一种高密度液体菌种及其发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及杏鲍菇栽培技术领域，具体涉及一种高密度液体菌种及其发酵方法。
【背景技术】
[0002] 杏鲍葫（PleurotuseryngiiQuel.)又名刺序侧耳，具有菌肉肥厚、质地脆嫩等优 点，特别是其菌柄组织致密、结实、乳白、爽口，被称为"平菇王"、"干贝菇"，具有杏仁香味和 鲍鱼的口感，适合保鲜、加工，深得人们的喜爱，其营养丰富，富含蛋白质、碳水化合物、维生 素及钙、镁、铜、锌等矿物质，可以提高人体免疫功能，对人体具有抗癌、降血脂、润肠胃以及 美容等作用，具有极高的栽培价值与商业价值。
[0003] 目前国内外杏鲍菇栽培以固体菌种为主，而液体菌种相对于固体菌种具有生产周 期短、菌龄一致、出菇齐、便于管理、菌种成本低、接种方便且快速等优点，有利于食用菌生 产的规模化、工厂化。近年来由于工厂化栽培技术的迅猛发展，为缩短菌种制备周期，提高 菌种质量和生产效率，国内外生产厂家研宄开发液体菌种用于替代目前杏鲍菇生产中普遍 使用的固体菌种，并在实际生产中开始应用。
[0004] 杏鲍菇液体菌种是通过液体发酵工艺生产有活力的杏鲍菇菌丝体。目前，国内尚 未颁布统一的国家标准来规范杏鲍菇液体菌种的质量和品质，但是在实际应用过程中人们 总结应用效果制订了一些地方性标准，如辽宁省地方标准《DB21/T 1693-2008食用菌液体 菌种生产技术规程》等，在这些标准中明确规定，合格的食用菌液体菌种应该"可见特有的 菌丝形态，球状和丛状菌丝体大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀""菌液稍粘稠， 有大量片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀"，也就是说优良的液体菌种菌丝球密度高、直径 小，分布均匀；另一方面，在实际生产应用中杏鲍菇液体菌种是通过生产线接种机进行机械 化接种操作，由于接种机喷口狭窄，为防止菌液堵塞管道，还需要增加液体菌种接种前的预 处理工艺（一般采用机械粉碎的方法使菌液中的菌丝球直径变小，使菌液变均匀）。因此， 杏鲍菇液体发酵菌丝球的大小、密度、均匀度等物理特性是优质液体菌种的关键控制指标。
[0005] 目前，有关杏鲍菇液体培养的研宄报道和专利技术大部分集中于摇瓶水平，规模 化发酵研宄的较少，基本集中在发酵工艺的优化方面，尤其在发酵培养基的改良方面较 多：申请号为201410568173. 3的中国专利公开了一种改良的杏鲍菇液体发酵培养基以 及利用其培养杏鲍菇液体菌种的方法，在发酵培养基中添加〇. 1-0. 3g/100ml的明胶、琼 脂中的一种或二者的混合物，采用搅拌、摇床震荡培养，上述公开的专利培养基中琼脂添 加量超过0. 4g/100ml凝固，无法进行液体培养，不易控制，存在发酵失败隐患，并且摇床 培养得到的液体菌种量少，不适合规模化、机械化生产，同时菌种质量不是很好。申请号 为201410244283. 4的中国专利公开了一种食用菌液体菌种的生产方法，是将保存的食用 菌菌株经活化后在固体培养基培养，然后粉碎，继续在固体培养基上密封培养2-3天，与 0. 15-0. 2%的琼脂溶液接触混匀得到液体菌种，上述公开的专利实质上仍然存在固体发酵 的缺陷，并且其中的粉碎再培养工艺和调配工艺易污染杂菌，高速搅拌打浆和粉碎的高剪 切力对菌种伤害颇大。北方园艺.食用菌篇公开了刘冠丼等发表的杏鲍菇液体菌种的制备 研宄【2009 (11) 230-232】，对发酵培养基和发酵条件进行了优化，但仍不全面，不能很好的 适合菌种生长、繁殖，得到的液体菌种的发酵菌丝球的大小、密度、均匀度等物理特性不很 理想，同样存在搅拌剪切力对菌丝球质量的严重影响。
[0006] 鼓气发酵是将氧气或无菌空气从气升式发酵罐底部通入的发酵方式，同时具备通 氧和柔和搅拌的作用，通氧效率高、溶氧效果好，可有效防止搅拌式发酵剪切力对杏鲍菇液 体菌种质量的影响，得到的液体菌种菌丝粗壮、粘度适中、菌丝球直径小、密度高、分布均 匀。申请号为201310479951. 7的中国专利公开了一种杏鲍菇液体菌种的培养方法，将传统 的马铃薯碳源和麸皮氮源替换为豆柏粉，将培养基倒入发酵罐，121°C灭菌60-120分钟，灭 菌后水淋冷却并通入无菌空气；接种培养好的液体母种，接种量为1-2%。，发酵罐培养温度 为21-26°C，通气压力为0. 5-1. 5兆帕，培养7-10天得到杏鲍菇液体菌种，但上述公开的专 利培养基营养不全面，发酵工艺滞后，发酵周期长，得到的液体菌种质量仍不理想。
[0007] 综上，依据杏鲍菇的菌种特性，通过优化培养基和培养条件，采用鼓气发酵制备高 质量、高产量、成本低的杏鲍菇液体菌种仍是本领域技术人员的不懈追求。
【发明内容】
[0008] 本发明所解决的技术问题是克服现有鼓气发酵制备杏鲍菇液体菌种的缺陷，在菌 种培养过程各阶段培养基中科学复配可提高菌种抗冷、热应激性和免疫性的中草药提取物 以及适应性原料木肩粉，采用分段追加接种和变温发酵的方式，缩短菌种菌龄、增殖代数差 距，适时流加包被后的壳聚糖调整发酵培养基的粘度，培养出一种发酵菌丝粗壮、活性高、 菌丝球直径小、密度大、分布均匀、发酵周期短的杏鲍菇液体菌种。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 一种高密度液体菌种的发酵方法，包括如下步骤：
[0011] 1)取保存好的杏鲍菇斜面菌种〇. 2cm2的菌种块2块接种于平板培养基进行活化， 25°C恒温培养10天，如此活化2次，得平板种子；
[0012] 2)将平板种子用直径为0. 5cm的打孔器截取0. 2cm2的菌种块3块接入250mL三角 瓶中，液体种子培养基装液量为lOOmL，于25°C恒温培养2天，然后放入恒温摇床中，25°C、 100r/min振荡培养3天得液体种子；
[0013] 3)将液体种子以10%的接种量接种于50〇1^摇瓶中，摇瓶培养基装液量25〇11^，于 25°C、150r/min振荡恒温培养4天得摇瓶种子；
[0014] 4)将摇瓶种子以10 %的接种量接种于5L种子罐中，种子罐培养基装液量3L，于 25°C、通气量4L/min条件下恒温培养4天得种子罐种子；
[0015] 5)首先将种子罐种子以5%接种量接种于30L发酵罐，发酵培养基装液量15L， 于30-32°C、通气量3-5L/min恒温发酵12-24h，然后以0. 3-0. 5°C /min的速率降温至 18-22°C，向发酵罐中加入8-10g包被壳聚糖和900mL种子罐种子，在通气量6-8L/min条件 下恒温发酵l〇_16h，最后以0. 2-0. 4°C /min的速率升温至24-26°C，在通气量5-7L/min条 件下恒温发酵45-52h即得高密度液体菌种；
[0016] 所述杏鲍菇斜面菌种为市购杏鲍菇纯化菌株；
[0017] 所述平板培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 I. 5g/L，琼脂 20g/L，VB10.0 2g/L，余量为水，pH 值 6. 0 ;
[0018] 所述液体种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸出汁5g/L，蛋白胨2g/L，琼脂 2g/L，中草药提取物0. 3-0. 5g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，硫酸镁0. 5g/L，木肩粉0. 1-0. 3g/L， VB10.0 1g/L，余量为水，pH 值 6. 0 ;
[0019] 所述摇瓶培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取 物 0· 5-1. Og/L，磷酸二氢钾 0· 5g/L，硫酸镁 0· 5g/L，木肩粉 0· 2-0. 4g/L，VB10.0 1g/L，余量 为水，pH值6.0 ;
[0020] 所述种子罐培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提 取物 0· 8-1. 2g/L，磷酸二氢钾 0· 5g/L，硫酸镁 0· 5g/L，木肩粉 0· 3-0. 5g/L，VB10.0 1g/L，余 量为水，pH值6.0 ;
[0021] 所述发酵培养基的组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提 取物 I. 5-2g/L，木肩粉 0· 6-1. 0g/L，磷酸二氢钾 0· 5g/L，硫酸镁 0· 5g/L，VB10.0 1g/L，余量 为水，pH值6.0 ;
[0022] 优选地，所述中草药提取物的制备方法，包括如下步骤：按重量份数计，称取黄芪 30份，干姜30份，陈皮30份，牛黄25份，丹皮25份，甘草20份，知母18份，金银花18份， 鱼腥草17份，赤芍15份，黄芩15份，川芎10份，当归8份；置盛有0. 2%碳酸氢钠溶液的 超声波清洗机中于200W、30KHz清洗12min，沥干，将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下， 置容器中均匀混合并添加5倍重量的水，得混合物料，控制温度80°C保持3h，接着降温至 45°C，用乳酸调节pH值为4,在功率200W条件下进行微波提取12min，同时在功率250W，频 率35KHz条件下进行超声波辅助提取；然后加入混合物料总重量1. 0 %的混合酶进行酶解， 用乳酸调节PH值为6. 2,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合