一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属植物组织培养技术领域，具体设及金毛狗绿色球状体诱导和增殖方法。 技术背景
[0002]金毛狗（Cibotiumbarometz)，隶属于蛛壳藤科金毛狗属，根状茎平邸、粗大，端部 上翅，露出地面部分密被金黄色长茸毛，状似伏地的金毛狗，形态独特，具观赏价值，金色茸 毛可入药，被收入《中华人民共和国药典》。《国家重点保护野生植物名录（第一批）》将蛛 壳藤科的所有种均列为国家级II重点保护野生植物，中国大陆地区蛛壳藤科仅1属1种， 即：金毛狗属的金毛狗。
[0003] 自然条件下，金毛狗采用抱子进行繁殖，但抱子萌发和配子体发育对环境条件的 要求较为严格，导致其自然繁殖能力极低，加之环境破坏和人为采掘，金毛狗的野生种群数 量急剧减少，溯临灭绝。
[0004]目前，金毛狗的组织培养多限于抱子繁殖途径，其方法主要包括：抱子萌发培养、 原叶体培养、抱子体培养、生根培养等步骤，存在繁殖周期长、抱子体诱导率低等缺陷，因 此，寻找一种繁殖周期短同时繁育效率高的方法，对于珍稀溯危藤类一金毛狗种群数量的 扩大，W及溯危程度的缓解具有重要意义。
[0005] 藤类植物绿色球状体是指由藤类植物外植体诱导得到的由众多绿色颗粒组成的 球状体，其本质是分生组织集合体，接种于分化培养基上可W获得大量藤类植物幼苗，一旦 诱导得到绿色球状体，其繁殖系数将显著高于抱子繁殖途径，且繁殖周期缩短。
[0006] 由于外植体选择W及适宜的植物激素筛选方面的原因，目前，已经成功诱导绿色 球状体的种类较为有限，且在绿色球状体增殖过程中，只有选择适宜的植物激素配方和培 养方式，才能在抑制绿色球状体分化的同时实现快速增殖。因此，目前，尚无珍稀溯危藤类 金毛狗通过绿色球状体途径组培繁殖研究的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是克服金毛狗自然繁殖力低、通过抱子繁殖途径组培繁 殖周期较长，且繁殖系数较低等技术问题。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法， 该方法包括W下步骤：
[0009] (1)金毛狗无菌外植体的获得
[0010] 将金毛狗无菌抱子接种在1/4MS+薦糖30. 0g/L+琼脂7.Og/l，抑为5. 80的培养 基上，培养条件为：20~25°C、每天的光照时间为12小时，光照强度为20001X，得到无菌 苗，在超净工作台，将无菌苗在解剖镜下用綴子剥离出茎尖，将茎尖作为金毛狗绿色球状体 诱导的无菌外植体；
[0011] (2)金毛狗绿色球状体的诱导
[0012] ①第一次诱导预培养：将步骤（1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养 基I，培养5天~7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基I为： 1/4MS~1/2MS+6-BA1. 0 ~1. 5mg/L+NAA0. 2 ~0. 4mg/L++ 薦糖 30.Og/L+ 琼脂 7.Og/L， 抑为5. 80;
[0013] ②第二次诱导预培养：将步骤（2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导预培养基II，培养时间为5天~7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱 导预培养基II为：1/4MS~l/2MS+2-ip0. 1 ~0. 3mg/L+NAA0. 2 ~0. 4mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂7.Og/L，抑为5. 80 ;
[0014] ③绿色球状体的诱导：将步骤（2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导培养基，培养条件与步骤（1)相同，培养时间为14天~20天，得到绿色球状体，所述 绿色球状体诱导培养基为：1/4MS~1/2MS+TDZ0. 6~0. 8mg/L+NAA0. 2~0. 4mg/L+薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80;
[0015] (3)金毛狗绿色球状体的增殖
[0016] 每一个增殖周期按W下顺序进行：
[0017] ①第一步增殖培养：将步骤（2)③获得的绿色球状体切割成1~3mm，接种于增 殖培养基A，培养18天~21天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基A为：1/4MS~ 1/2MS+TDZ0. 8 ~1. 2mg/L+NAA0. 1 ~0. 2mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，pH为 5. 80;
[0018] ②第二步增殖培养：将（3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖 培养基B，培养18天~21天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基B为：1/4MS~ l/2MS+2-ip0. 1 ~0. 2mg/L+6-BA1. 0 ~1. 2mg/L+NAA0. 05 ~0.lmg/L+薦糖 30. 0g/L+琼 脂 7.Og/L，抑为 5. 80;
[0019] (4)金毛狗绿色球状体的分化
[0020] 将步骤（3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径1~3mm的球状 体，接种于分化培养基，培养28天~29天，得到分化幼苗，培养条件与步骤（1)相同，所述 分化培养基为：1/6MS~1/4MS+活性炭1~2g/L+水解酪蛋白200~300mg/L+薦糖30.Og/ L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80;
[00川 妨生根培养
[0022] 将步骤（4)得到的分化幼苗接种于生根培养基，分化幼苗生根后即为金毛狗组培 苗，培养条件与步骤（1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭1~2g/L+水解酪蛋白 200 ~300mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂浓度 7.Og/L，抑为 5. 80。
[0023] 本发明的创新点：
[0024] 1、成功诱导出了珍稀溯危藤类植物金毛狗的绿色球状体，且绿色球状体的诱导率 达90~94%。
[00巧]本发明通过大量实验，筛选出了适宜珍稀溯危藤类植物金毛狗的两个绿色球状体 诱导预培养基和一个绿色球状体诱导培养基。并设计了两次诱导预培养和一次诱导培养步 骤，成功诱导出了金毛狗绿色球状体。
[0026] 2、增殖培养上，筛选出A和B两个增殖培养基，并设计每一个增殖周期用依次用A 和B两个增殖培养基，既有效地抑制了增殖过程出现的分化现象，又取得了增殖倍数达到 9. 5~10. 2倍特别显著的技术效果，在不发生分化的前提下实现高效增殖，同时保持了较 高的增殖速率。需进行几个周期的增殖培养，可根据生产上需要的种苗数量确定。本发明 人在研究过程中发现，仅采用增殖培养基A,可抑制分化，但增殖倍数较低，而仅采用增殖培 养基B，增殖倍数较高但出现分化现象，而按本发明方法所述依次用增殖培养基A和增殖培 养基B交替进行的增殖培养，既抑制了增殖过程出现的分化现象，又可实现了高效增殖的 技术效果。而且有利于金毛狗绿色球状体作为中间繁殖体的增殖W及保存。
[0027] 通过本发明的创新，与现有技术相比，本发明有益效果如下：
[0028] 1、成功诱导出珍稀溯危藤类植物金毛狗绿色球状体，并且绿色球状体的诱导率等 繁殖效率特别高，对于我国二级重点保护的珍惜溯危藤类金毛狗群数量的扩大，W及溯危 程度的缓解具有重要意义。
[0029] 本发明方法使绿色球状体诱导率、绿色球状体增殖速率、绿色球状体分化率、单个 绿色球状分化苗数、W及分化苗培养成组培苗的效率均特别高，其绿色球状体的诱导率达 90~94 %，绿色球状体的增殖倍数达9. 5~10. 2倍，绿色球状体的分化率100 %，生根率 100%，因此，本发明绿色球状体的诱导率等繁殖效率特别高；而现有抱子繁殖途径的抱子 体诱导率仅为28. 30%，与现有的抱子途径繁殖相比，本发明的繁殖效率产生了预料不到的 技术效果。
[0030] 2、繁殖周期短
[0031] 本发明诱导出绿色球状体后，即可W绿色球状体作为中间繁殖材料，高效培育出 大量组培苗，无需再重复从抱子开始培养，因此，繁殖周期短。W绿色球状体为中间繁殖材 料计算，繁殖周期为92天~98天，而现有的抱子途径繁殖周期需约224天~284天（其中 抱子萌发形成原叶体60-90天，原叶体诱导生成抱子体80-110天，抱子体增殖42天，生根 42天），本发明与常规抱子繁殖途径的繁殖方法相比，繁殖周期缩短了 132~186天。
[0032] 3、实现了溯危物种金毛狗种质资源的离体保存
[0033] 通过本发明提供的方法得到的金毛狗绿色球状体W及金毛狗组培苗可作为种质 资源进行保存，对于实现珍稀溯危藤类金毛狗种质资源离体保存具有重要意义。
【附图说明】
[0034] 图1是金毛狗绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1mm。
[0035] 图2是开始分化的金毛狗绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1mm。
[0036] 具体实施方法
[0037]W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料均为市售。W下实施例 中的定量试验，均设置=次重复实验，结果取平均值。
[0038] W下各实施例培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含 量混合后，用抑计调抑为该培养基要求的抑值即制成。
[0039] 实施例1本发明方法
[0040] (1)金毛狗无菌外植体的获得
[0041] 将金毛狗无菌抱子接种在1/4MS+薦糖30. 0g/L+琼脂7.Og/l，抑为5. 80的培养 基上，培养条件为：20~25°C、每天的光照时间为12小时，光照强度为20001X，得到幼嫩的 无菌苗。在超净工作台中，将得到的无菌苗在解剖镜下用綴子剥离出茎尖，将茎尖作为金毛 狗绿色球状体诱导的无菌外植体。
[0042] 金毛狗无菌抱子的获得方法为：将lOmg抱子置于1. 5ml离屯、管中，用无菌水浸 泡1-2小时，600化/min离屯、2min，获得抱子沉淀物，加入体积分数为5%化CIO溶液灭菌 4min，无菌水清洗3-5次即得金毛狗无菌抱子。
[0043] 似金毛狗绿色球状体的诱导
[0044] ①第一次诱导预培养：将步骤（1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基I 中，培养6天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体