诱导预培养基I为：l/4MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0. 2mg/L+薦糖30. 0g/L+琼脂7.Og/L，抑为5. 80 ;接种数50个茎尖。
[0045] ②第二次诱导预培养：将步骤（2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导预培养基II中，培养时间为6天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱导预 培养基II为：l/4MS+2-ip0. 3mg/L+NAA0. 2mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80。
[0046] ③绿色球状体的诱导：将步骤（2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导培养基中，培养时间为14天，培养条件与步骤（1)相同，得绿色球状体，所述绿色球 状体诱导培养基为：1/4MS+TDZ0. 8mg/L+NAA0. 2mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/l，抑为 5. 80〇
[0047] 经诱导预培养和诱导培养后，金毛狗的茎尖膨大形成绿色球状体，绿色球状体的 诱导率为94. 00%。
[0048] 诱导率=(产生绿色球状体的无菌苗数/接种的无菌外植体数）X100%。
[0049] (3)金毛狗绿色球状体的增殖
[0050] 每一个增殖周期按W下步骤进行：
[0051] ①第一步增殖培养：将步骤（2)③获得的绿色球状体切割成2mm，接种于增殖培 养基A上，培养18天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基A为：1/2MS巧DZ0.8mg/ L+NAA0.lmg/L+薦糖30. 0g/L+琼脂7.Og/l，抑为5. 80 ;该2mm绿色球状体的鲜重为8mg， 接种数50个绿色球状体。
[0052] ②第二步增殖培养：将（3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖培 养基B上，培养18天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基B为：1/2MS巧-ip0.2mg/ L+6-BA1.Omg/L+NAA0.lmg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，pH为 5. 80。
[0053] 绿色球状体每18天的平均鲜重增加量为76mg，增殖倍数平均9. 5倍，且增殖过程 中未出现绿色球状体分化现象。每个增殖培养周期按上述顺序进行，需进行几个周期的增 殖培养，根据生产上需要的组培苗数量确定。
[0054] (4)金毛狗绿色球状体的分化
[0055] 将步骤（3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径2mm的球状体，接 种于分化培养基上，培养28天，得到分化幼苗，培养条件为与步骤（1)相同；所述的分化培 养基为：1/6MS+活性炭lg/L+水解酪蛋白200mg/L+薦糖30. 0g/L+琼脂7.Og/l，抑为5. 80。
[0056] 接种数了 50个绿色球状体，平均分化率为100%。
[0057] 分化率=(发生分化的绿色球状体数量/接种的绿色球状体的数量）X100%。
[00则 妨生根培养
[0059]将步骤（4)得到的分化幼苗接种于生根培养基上培养，分化幼苗生根后即为金毛 狗组培苗，培养条件为与步骤（1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭lg/L+水解酪蛋 白 200mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂浓度 7.Og/L，抑为 5. 80。
[0060] 培养4周，金毛狗组培苗的平均高度达3. 15cm。分化幼苗全部生根成活形成组培 苗，组培苗的生成率达到100%。
[0061] 实施例2和实施例3均为本发明方法
[0062] 实施例2和实施例3除表1所列各培养基中各成分的浓度不同外，其余措施均与 实施例1相同，不再寶述。
[0063] 表1实施例2-实施例3各步骤与实施例1的区别
[0064]
[0065]
[0066] 实施例1的繁殖结果：绿色球状体的诱导率为94%，分化率100%，生根率100%， 即组培苗的形成率100%，生根培养28天，组培苗的平均高度3. 15cm。直径为2mm的绿色 球状体鲜重8mg，绿色球状体每18天平均鲜重增加76mg，增殖倍数平均9. 5倍。W获得的 绿色球状体为中间繁殖体，经两步增殖培养供36天、分化培养28天、生根培养形成组培苗 28天、繁殖时间供92天。
[0067] 实施例2的繁殖结果：绿色球状体的诱导率为90.00%，分化率100%，生根率 100%，即组培苗的形成率100%，生根培养28天，组培苗的平均高度3. 08cm。直径为1mm的 绿色球状体鲜重4. 5mg，绿色球状体每20天平均鲜重增加45. 9mg，增殖倍数平均10. 2倍。 W获得的绿色球状体为中间繁殖体，经两步增殖培养供40天、分化培养29天、生根培养形 成组培苗28天、繁殖时间供97天。
[0068] 实施例3的繁殖结果：绿色球状体的诱导率为92%，分化率100%，生根率100%， 即组培苗的形成率100%，生根培养28天，组培苗的平均高度3. 30cm。直径为2mm的绿色 球状体鲜重8mg，绿色球状体每21天平均鲜重增加77. 6mg，增殖倍数平均9. 7倍。W获得 的绿色球状体为中间繁殖体，经两步增殖培养供42天、分化培养28天、生根培养形成组培 苗28天、繁殖时间供98天。
[0069] -个1~3mm的绿色球状体一次分化可获得20~25株组培苗。
[0070]上述实施例1至实施例3表明：本发明绿色球状体的诱导率为90~94%，绿色球 状体的增殖倍数达9. 5~10. 2倍，绿色球状体的分化率100%，生根率100%，组培苗的形 成率100%，因此，繁殖效率特别高。本发明诱导出绿色球状体后，即可W绿色球状体作为中 间繁殖材料，高效培育出大量组培苗，无需再重复从抱子开始培养，因此，繁殖周期短。W绿 色球状体为中间繁殖材料计算，繁殖周期为92天~98天。
【主权项】
1. 一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法，其特征在包括以下步骤： (1) 金毛狗无菌外植体的获得 将金毛狗无菌孢子接种在1/4MS+蔗糖30.0 g/L+琼脂7. Og/L，pH为5. 80的培养基上， 培养条件为：20~25°C、每天的光照时间为12小时，光照强度为20001x，得到无菌苗，在超 净工作台，将无菌苗在解剖镜下用镊子剥离出茎尖，将茎尖作为金毛狗绿色球状体诱导的 无菌外植体； (2) 金毛狗绿色球状体的诱导 ① 第一次诱导预培养：将步骤（1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基I，培 养5天~7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基I为：1/4MS~ 1/2MS+6-BA I. 0 ~I. 5mg/L+NAA 0? 2 ~0? 4mg/L++ 蔗糖 30.0 g/L+ 琼脂 7. Og/L，pH 为 5. 80 ; ② 第二次诱导预培养：将步骤（2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱 导预培养基II，培养时间为5天~7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱导预 培养基 II 为：1/4MS ~l/2MS+2-ip 0? 1 ~0? 3mg/L+NAA 0? 2 ~0? 4mg/L+ 蔗糖 30.0 g/L+ 琼 脂 7. 0g/L，pH 为 5. 80 ; ③ 绿色球状体的诱导：将步骤（2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱 导培养基，培养条件与步骤（1)相同，培养时间为14天~20天，得到绿色球状体，所述绿 色球状体诱导培养基为：1/4MS~1/2MS+TDZ 0. 6~0. 8mg/L+NAA 0. 2~0. 4mg/L+蔗糖 30. 0g/L+ 琼脂 7. 0g/L，pH 为 5. 80 ; (3) 金毛狗绿色球状体的增殖 每一个增殖周期按以下顺序进行： ① 第一步增殖培养：将步骤（2)③获得的绿色球状体切割成1~3mm，接种于增殖 培养基A，培养18天~21天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基A为：1/4MS~ 1/2MS+TDZ 0? 8 ~I. 2mg/L+NAA 0? 1 ~0? 2mg/L+ 蔗糖 30. 0g/L+ 琼脂 7. 0g/L，pH 为 5. 80 ; ② 第二步增殖培养：将（3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖培养基 B，培养18天~21天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基B为：1/4MS~l/2MS+2-ip 0? 1 ~0? 2mg/L+6-BA L 0 ~I. 2mg/L+NAA 0? 05 ~0? lmg/L+ 蔗糖 30. 0g/L+ 琼脂 7. 0g/L， pH 为 5. 80 ; (4) 金毛狗绿色球状体的分化 将步骤（3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径1~3mm的球状体，接 种于分化培养基，培养28天~29天，得到分化幼苗，培养条件与步骤（1)相同，所述分化培 养基为：1/6MS~1/4MS+活性炭1~2g/L+水解酪蛋白200~300mg/L+蔗糖30. 0g/L+琼 脂 7. 0g/L，pH 为 5. 80 ; (5) 生根培养 将步骤（4)得到的分化幼苗接种于生根培养基，分化幼苗生根后即为金毛狗组培苗， 培养条件与步骤（1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭1~2g/L+水解酪蛋白200~ 300mg/L+ 蔗糖 30. 0g/L+ 琼脂浓度 7. 0g/L，pH 为 5. 80。
【专利摘要】本发明公开一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法。该方法包括无菌外植体的获得、绿色球状体的诱导，其诱导通过两个诱导预培养基培养后再经绿色球状体诱导培养基培养，得到绿色球状体，之后，经两个增殖培养基交替培养，再经分化培养、生根培养获得组培苗。本发明成功诱导出珍稀濒危蕨类金毛狗绿色球状体，繁殖效率高，其绿色球状体诱导率达90～94％，增殖倍数达9.5～10.2倍，绿色球状体的分化率达100％，生根率达100％，繁殖周期短，对于珍稀濒危蕨类金毛狗种群数量的扩大，以及对濒危程度的缓解具有重要意义，同时实现了濒危物种种质资源的离体保存。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105145364
【申请号】CN201510606427
【发明人】余蓉培, 王继华, 莫锡君, 蒋亚莲, 田敏, 李进昆
【申请人】云南省农业科学院花卉研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月22日