棱隔开的4个空间中。将步骤4制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置12小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层6，降温至4°C 10分钟使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，再将其注胶孔处的组织工程支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，再放置入模具II中，使组织工程支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤4制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在一 20 °C条件下放置2小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12 Pa，冻干温度为一 50°C。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛。常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于10vol%蚌血清溶液中30分钟，在一 20 °C条件下冷冻2小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为一 20°C。
[0030]6.外套膜细胞分离:清洗蚌壳，割断闭壳肌，撕取外套膜组织，去除内表皮，先用PBS缓冲溶液清洗3遍，将组织置于含4000~5000U/mL抗生素(青霉素+链霉素)的PBS缓冲溶液中浸泡10分钟，再用PBS缓冲溶液浸泡清洗10分钟，切除边缘色线部分，将其余组织剪碎成约1mm2小片，加入约2倍量含EDTA、0.25wt%胰蛋白酶消化30分钟，然后加入胎牛血清终止酶消化反应，用200目絹网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心5分钟，弃上清，加入1640培养液吹散沉淀。
[0031]7.珠核植核前预粘附细胞:将细胞密度调整为每毫升1 X 106细胞。将表面粘附有胶原蛋白组织工程支架的珠核浸泡到细胞悬液中。
[0032]8.用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，深度为2cm，口径为
1 cm，先向通道中滴加0.5mL细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加0.2mL细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出。
[0033]9.将经过手术插核处理的育珠蚌吊养于育珠水域，按常规的饲养管理规范进行操作。
[0034]10.采用本方法试验培育100只育珠蚌，养殖2年，5例死亡，无一例发生吐核，95粒珍珠全部为圆形或近圆形珍珠，一等珠达到100%，而对照组采用未含组织工程支架的普通珠核，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。
[0035]实施例2
1.将打磨好的珍珠核高压灭菌处理，放入0.lwt%的多聚赖氨酸溶液中振荡浸泡10分钟，取出，无菌条件下晾干。
[0036]2.制备蚌血清:自马氏珠母贝血窦中抽取血液，2000r/分钟离心10分钟，取上清，置于56°C水浴锅中做灭活处理30分钟，得到的血清再经过0.2 μπι的滤膜过滤，用PBS配制成10vol%浓度，4°C存储备用。
[0037]3.制备珠核组织工程支架层模具:模具I由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3条隆起的棱，棱的长度略短于半球的周长，其中2条棱位于半球的边缘，另一条棱位于半球的正中间位置，中间棱与边缘的棱平行排列，3条棱的末端相交在同一处；中间棱的宽度3mm左右，高度Η为1 mm，边缘棱宽度为中间棱的一半。模具II由两个中空的半球组成，其内径为珠核直径和2倍棱高度之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架材料。使用时，模具I用于完成珠核组织工程支架制备的第一步，得到有4道凹槽的组织工程支架珠核；模具II用于完成凹槽的填补，最后得到球形的组织工程支架珠核。
[0038]4.无菌条件下用双蒸水将重组人胶原蛋白II配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为
0.01vol%，搅拌均匀。
[0039]5.组织工程支架制备:先将晾干好的珠核放置于模具I中，将步骤4制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置6小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4°C 10分钟使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，将其注胶孔处的组织工程支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，再放置入模具II中，使组织工程支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤4制备的液态胶原蛋白溶液，使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置6小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在一 20 °C条件下放置2小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12 Pa，冻干温度为一 50°C。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛。常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于10vol%蚌血清溶液中30分钟，在一 20 °C条件下冷冻2小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为一 20°C。
[0040]6.外套膜细胞分离:清洗蚌壳，割断闭壳肌，撕取外套膜组织，先用PBS缓冲溶液清洗3遍，将组织置于含4000~5000U/mL抗生素(青霉素+链霉素)的PBS缓冲溶液中浸泡10分钟，再用PBS缓冲溶液浸泡清洗10分钟，切除边缘色线部分，将其余组织剪碎成约1mm2小片，加入约2倍量含EDTA、0.25wt%胰蛋白酶消化30分钟，然后加入胎牛血清终止酶消化反应，用200目絹网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心5分钟，弃上清，加入1640培养液吹散沉淀。
[0041]7.珠核植核前预粘附细胞:将细胞密度调整为每毫升IX 106细胞。将表面粘附有胶原蛋白组织工程支架的珠核浸泡到细胞悬液中。
[0042]8.用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，深度为2cm，口径为
1 cm，先向通道中滴加0.5mL细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加0.2mL细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出。
[0043]9.将经过手术插核处理的育珠蚌吊养于育珠水域，按常规的饲养管理规范进行操作。
[0044]10.采用本方法试验培育100只育珠蚌，养殖2年，12例死亡，无一例发生吐核，88粒珍珠全部为圆形或近圆形珍珠，一等珠达到100%，而对照组采用未含组织工程支架的普通珠核，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。
[0045]实施例3
1.将打磨好的珍珠核高压灭菌处理，放入0.lwt%的鼠源I型胶原蛋白溶液中振荡浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。
[0046]2.制备蚌血清:自马氏珠母贝血窦中抽取血液，2000r/分钟离心10分钟，取上清，置于56°C水浴锅中做灭活处理30分钟，得到的血清再经过0.2 μπι的滤膜过滤，用PBS配制成10vol%浓度，4°C存储备用。
[0047]3.制备珠核组织工程支架层模具:模具I由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3条隆起的棱，棱的长度略短于半球的周长，其中2条棱位于半球的边缘，另一条棱位于半球的正中间位置，中间棱与边缘的棱平行排列，3条棱的末端相交在同一处；中间棱的宽度3mm左右，高度1 mm左右，边缘棱宽度为中间棱的一半。模具II由两个中空的半球组成，其内径为珠核直径和2倍棱高度之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架材料。使用时，模具I用于完成珠核组织工程支架制备的第一步，得到有4道凹槽的组织工程支架珠核；模具II用于完成凹槽的填补，最后得到球形的组织工程支架珠核。
[0048]4.无菌条件下用双蒸水将重组鼠源胶原蛋白I配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为
0.02vol%，搅拌均匀。
[0049]5.组织工程支架制备:先将晾干好的珠核放置于模具I中，将步骤4制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置2小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4°C 10分钟使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，将其注胶孔处的组织工程支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，再放置入模具II中，使组织工程支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤4制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置2小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在一 20 °C条件下放置2小时冷冻成型，