然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12 Pa，冻干温度为一 50°C。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛。常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于10vol%蚌血清溶液中30分钟，在一 20 °C条件下冷冻2小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为一 20°C。
[0050]6.外套膜细胞分离:清洗蚌壳，割断闭壳肌，撕取外套膜组织，去除内表皮，先用PBS缓冲溶液清洗3遍，将组织置于含4000~5000U/mL抗生素(青霉素+链霉素)的PBS缓冲溶液中浸泡10分钟，再用PBS缓冲溶液浸泡清洗10分钟，切除边缘色线部分，将其余组织剪碎成约1mm2小片，加入约2倍量含EDTA、0.25wt%胰蛋白酶消化30分钟，然后加入胎牛血清终止酶消化反应，用200目絹网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心5分钟，弃上清，加入1640培养液吹散沉淀。
[0051]7.珠核植核前预粘附细胞:将细胞密度调整为每毫升1 X 106细胞。将表面粘附有胶原蛋白组织工程支架的珠核浸泡到细胞悬液中。
[0052]8.用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，深度为2cm，口径为
1cm，先向通道中滴加0.5mL细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加0.2mL细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出。
[0053]9.将经过手术插核处理的育珠蚌吊养于育珠水域，按常规的饲养管理规范进行操作。
[0054]10.采用本方法试验培育100只育珠蛛，养殖2年，死亡5只，无1例发生吐核，收获的珍珠基本都是正圆形或近似正圆形，无尾巴珠，一等珠达到89%，而对照组采用未含组织工程支架的普通珠核，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。
[0055]参考文献
1.刘万磊.水生无脊椎动物细胞培养[J]。细胞生物学杂志，2006，28( 2): 173 —
178.2.李倩，施志仪，李文娟.三角帆蚌外套膜细胞体外培养优化及体内植入培养对细胞生长的影响[J].中国水产科学，2014，21 (2): 225 - 234.钱伟平，许梓荣，张明霞，等.注射法培育三角帆蚌有核珍珠的研究[J]。浙江农业学报，2002，14(2):82 ?86。
[0056]上述实施例只是本发明的部分实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，任何依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。
【主权项】
1.一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，在植入育珠蚌的珠核表面粘附有一层厚度均匀的可降解高分子聚合物作为组织工程支架，所述组织工程支架为一个可以容纳细胞生长的立体网络空间，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离的外套膜细胞，配制成一定细胞密度的外套膜细胞悬液，然后将珠核粘附外套膜细胞后与外套膜细胞悬液一起植入育珠蚌的插核位置来培育有核珍珠。2.根据权利要求1所述的用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，其包括以下步骤: (1)珠核表面预处理:将珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态； (2)制备珠核组织工程支架层模具:所述模具由模具I和模具II组成，模具I由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度(H)为0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度(H)就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，而位于棱另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具I用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有凹槽的组织工程支架珍珠核； 模具II由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具I棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具II完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核； (3)配制组织工程支架液:无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0wt°/^3.0wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为 0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀； 先将步骤(1)处理好的珠核放置于模具I中，将步骤⑶制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀，室温下静置6~24小时使胶原蛋白交联，降温至4°C、10分钟后使珠核脱模；然后打开模具I取出珠核，再放置入模具II中，使组织工程支架的凹槽的凹口处对准注胶孔，再注入步骤3)制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在一 20 °C条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥2~24小时，真空度为12~20 Pa,冻干温度为一 20~ — 70°C ;将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗多次以充分洗尽戊二醛；常温真空干燥抽去水分；将珠核浸泡于蚌血清或牛血清或马血清溶液中30分钟，在一20 °C条件下冷冻2~4小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥1~24小时，真空度为12~20 Pa,冻干温度为一 20--70 °C ； (4)外套膜游离细胞获取:清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1_2小块，采用胰酶消化法消化组织块，通常采用浓度为0.25wt%左右的胰酶溶液，在25~37°C范围内消化0.5~4小时，用200目絹网过滤去除残留的组织块，lOOOr/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞； (5)珠核植核前预粘附细胞:将分离出的外套膜组织游离细胞用培养液或PBS稀释成每毫升1.0X 105~1.0X 107个细胞的细胞悬液，将处理过的珠核浸泡到细胞悬液中； (6)用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，先向通道中滴加部分步骤(5)制备的细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出； (7)将经过步骤(6)手术插核处理的育珠蚌吊养于育珠水域，按常规的饲养管理规范进行操作。3.根据权利要求1所述的用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，其中所述的高分子聚合物指的是生物可降解天然高分子材料和生物可降解的合成高分子材料，所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸或它们与其他材料组成的复合物；所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)或它们与其他材料组成的复合物。
【专利摘要】本发明公开一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，在植入育珠蚌的珠核表面粘附有一层厚度均匀的可降解高分子聚合物作为组织工程支架，所述组织工程支架为一个可以容纳细胞生长的立体网络空间，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离的外套膜细胞，配制成一定细胞密度的外套膜细胞悬液，然后将珠核粘附外套膜细胞后与外套膜细胞悬液一起植入育珠蚌的插核位置来培育有核珍珠。本发明方法操作简便，无需体外培养细胞，避免了采用细胞培养方法对技术和设备要求高的问题，可将无菌包装好的珠核直接运至养殖现场操作，运输方便，对设备、操作人员的要求低，成本生产大幅降低，适于大规模生产应用。
【IPC分类】A01K61/00
【公开号】CN105309346
【申请号】CN201510306482
【发明人】林尧, 肖义军, 黄义德, 陈元仲, 王正朝, 肖宽诚
【申请人】福建师范大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年6月7日