一种防治脂代谢异常的组合物的制作方法
本申请涉及一种保健茶，具体而言，涉及一种防治脂代谢异常的组合物。
背景技术：
脂代谢异常多与嗜食肥甘厚味、好逸恶劳、情志不遂、先天禀赋不足、它病失治等因素有关，这些因素致肝郁脾虚、肾气亏虚、痰浊瘀血内蕴，遂发本病。病位在肝，涉及脾、胃、肾等脏腑，证属本虚标实，脾肾亏虚为本，痰浊血瘀为标(中华中医药学刊，2016，34(11)：2586–2589)。
现有技术虽然已有类似的组合物，例如cn200810058332公开了一种三七花叶普洱茶，按重量计，按重量计，茶叶占50－80％，三七花10％，三七花叶占10－40％，对清脂减肥，酒精肝，脂肪肝有良好的代谢作用。cn201310597025公开了由下述重量份的原料制成：岩黄连、胡黄连、三七、丹参、葛根、白术、白芍、茯苓、柴胡、当归、荷叶、薏苡仁、冬瓜仁、芦根、桔梗、葶苈子、枇杷叶、川贝母、枸杞子、决明子、泽泻、桃仁和桑叶，减轻肝细胞脂肪沉积，改善肝功能以及降低肝脏指数，从而对非酒精性脂肪性肝病大鼠有明显的治疗作用。然而，现有技术的组合物效果不尽如人意，或者药味偏多，并不适合生产生活中的实际应用，因此并没有得到广泛的应用。
技术实现要素：
在本发明中，配方由黄精、当归、三七、木香、茯苓、红曲、普洱茶7种物质组成，这些物质均为药食同源(即可作为药材使用，也可作为食品使用)。方中黄精有补气养阴，健脾，润肺，益肾之功，归脾、肺、肾经；当归有补血活血，调经止痛，润肠通便之功，为补血活血行瘀之要药，归肝、心、脾经，三七有化瘀止血，活血定痛之功，归肝、胃经，二者配伍共奏补血活血、行瘀之功；木香有行气疏肝，调中导滞之功，归脾、胃、肝、肺经；茯苓有利水消肿，渗湿，健脾，宁心之功，归心、肺、脾、肾经，方中配伍茯苓有利于痰浊湿邪排除体外。因此，该方以上几种物质可有效针对脂代谢异常的病机。此外，现代研究表明，红曲和普洱茶具有明显调节脂代谢异常的药理活性(浙江大学博士学位论文，2012；安徽医科大学硕士学位论文，2017)，方中配伍该两种物质，可进一步增强处方调节脂代谢异常的功能。因此，以疏肝健脾、化湿祛瘀法，该组合物可有效防治脂代谢异常相关症状，可用于防治脂代谢异常的药物/保健品/功能食品开发。
具体的，本发明提供了一种用于预防脂代谢异常的保健茶，由下列原料组成：黄精1-20g、当归1-20g、三七1-20g、木香1-10g、茯苓1-10g、红曲1-10g、普洱茶1-20g。
所述的保健茶，由下列原料组成：黄精1-10g、当归1-10g、三七1-10g、木香1-5g、茯苓1-5g、红曲1-5g、普洱茶1-10g。
所述的保健茶，由下列原料组成：黄精1-5g、当归1-5g、三七1-5g、木香1-4g、茯苓1-4g、红曲1-4g、普洱茶1-5g。
所述的保健茶，由下列原料组成：黄精2-4g、当归2-4g、三七2-4g、木香1-3g、茯苓1-3g、红曲1-3g、普洱茶2-4g。
所述的保健茶，由下列原料组成：黄精3g、当归3g、三七3g、木香2g、茯苓2g、红曲2g、普洱茶3g。
本发明还提供了一种预防和治疗脂代谢异常的组合物，其原料药包括：黄精1-20g、当归1-20g、三七1-20g、木香1-10g、茯苓1-10g、红曲1-10g、普洱茶1-20g。
进一步的，提供了一种治疗脂代谢异常的组合物，其原料药包括：黄精1-10g、当归1-10g、三七1-10g、木香1-5g、茯苓1-5g、红曲1-5g、普洱茶1-10g。
进一步的，提供了一种治疗脂代谢异常的组合物，其原料药包括：黄精1-5g、当归1-5g、三七1-5g、木香1-4g、茯苓1-4g、红曲1-4g、普洱茶1-5g。
进一步的，提供了一种治疗脂代谢异常的组合物，其原料药包括：黄精2-4g、当归2-4g、三七2-4g、木香1-3g、茯苓1-3g、红曲1-3g、普洱茶2-4g。
进一步的，提供了一种治疗脂代谢异常的组合物，其原料药包括：黄精3g、当归3g、三七3g、木香2g、茯苓2g、红曲2g、普洱茶3g。
本发明保健茶的制备方法是：
取原料打成细粉后，先用12倍量的95％乙醇90℃回流提取，在以12倍量的70％的乙醇回流提取，每次回流2h，合并两次提取液，65℃，转速100，减压浓缩回收乙醇，制备冻干粉，即得。在使用时冲饮。
本发明组合物的制备方法是：
取原料打成细粉后，先用12倍量的95％乙醇90℃回流提取，在以12倍量的70％的乙醇回流提取，每次回流2h，合并两次提取液，65℃，转速100，减压浓缩回收乙醇，制备冻干粉，通过常规的制备方法制备成药学上可接受的制剂。
所述的制剂选自水煎剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、散剂。
附图说明
图1实验期间各组大鼠食量(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与正常组相比)
图2实验期间各组大鼠体重增长趋势
图3组合物对脂代谢紊乱大鼠血清tc、tg含量的影响(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与模型组相比)
图4各组大鼠肝组织形态学(油红o染色，×200))
a，正常组b，模型组c，低剂量组d，中剂量组e，高剂量组f，白藜芦醇组
图5大鼠肝细胞免疫组化分析(tunel，×200)
a，正常组b，模型组c，低剂量组d，中剂量组e，高剂量组f，白藜芦醇组
图6组合物对高脂诱导的脂代谢紊乱大鼠肝脏tg、tc、ldl-c和hdl-c的影响
与模型组比较，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001
图7组合物对高脂诱导的脂代谢紊乱大鼠肝脏mda、gsh的影响(与模型组比较，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)
图8组合物对高脂诱导的脂代谢紊乱大鼠肝线粒体complexⅰ、camplexⅱ、atp含量的影响(与模型组比较，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)
图9组合物对高脂诱导的脂代谢紊乱大鼠肝线粒体gsh、sod、mda含量的影响(与模型组比较，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)
图10实验期间各组大鼠进食量
图11实验期间各组大鼠体重增长趋势
图12组合物、红曲和普洱茶对nafld大鼠血清tg、tc含量的影响(与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与组合物组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001)
图13各组大鼠肝组织形态学(油红o染色，×200)
a，正常组；b，模型组；c，白藜芦醇组；d，红曲组；e，普洱茶组；f，组合物组
图14大鼠肝细胞免疫组化分析(tunel，×200)
a，正常组；b，模型组；c，白藜芦醇组；d，红曲组；e，普洱茶组；f，组合物组
图15组合物、红曲和普洱茶对nafld大鼠肝脏tg、tc、ldl-c和hdl-c的影响(与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p＜0.001；与组合物组比较，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001)
图16组合物、红曲和普洱茶对高脂诱导的nafld大鼠肝脏mda、gsh的影响(与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与组合物组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p<0.001)
图17组合物、红曲和普洱茶对高脂诱导的nafld大鼠肝线粒体complexⅰ、complexⅱ、atp含量的影响(与模型组比较，*p<0.05，**p＜0.01，***p<0.001；与组合物组比较，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001)
具体实施方式
实施例1水煎剂
(1)处方
黄精3g、当归3g、三七3g、木香2g、茯苓2g、红曲2g、普洱茶3g。
(2)制备
上述七味药材粉碎，加8倍水煎煮两次，每次2小时，浓缩，即得。
实施例2颗粒剂
(1)处方
黄精3g、当归3g、三七3g、木香2g、茯苓2g、红曲2g、普洱茶3g。
(2)制备
取原料打成细粉后，先用12倍量的95％乙醇90℃回流提取，在以12倍量的70％的乙醇回流提取，每次回流2h，合并两次提取液，65℃，转速100，减压浓缩回收乙醇，制备冻干粉，加蔗糖、糊精混匀，制成颗粒，干燥，制成。
实施例3临床试验
1.治疗方法
采用疏肝健脾、化湿祛瘀法治疗高脂血症，给予组合物：黄精3g、当归3g、三七3g、木香2g、茯苓2g、红曲2g、普洱茶3g。每日1剂，水煎服，分早晚2次服用。10天为1个疗程，连续治疗6个疗程。随访6个月。
2.疗效标准
显效：治疗后血脂降至正常水平，并半年后复查均无升高。有效：治疗后，血脂明显降低，但比正常水平略高，继续用药还有下降趋势。无效：血脂水平稍有降低，但停药后半年血脂水平有升高趋势。
3.结果
238例高脂血症肥胖患者经6个疗程的治疗，患者高脂血症轻、中、重度均有不同程度的疗效变化，其显效率为67.2％。同时复查肝、肾功能及血尿常规均属正常，并且半年后复查除无效者，其余血脂均无升高反跳现象。
表1238例患者的治疗效果(例％)
实施例4组合物对高脂饮食诱导脂代谢紊乱大鼠的干预作用
一、实验材料与方法
(一)实验材料
1实验材料
所有材料购自昆明螺蛳湾药材批发市场，凭证标本均保存于昆明市代谢性疾病中医药防治重点实验室。
阳性对照白藜芦醇购于成都普菲德生物技术有限公司。
2实验动物
8周龄清洁级spraque-dawley健康雄性大鼠60只，体重180±20g，购自成都达硕实验动物有限公司，质量合格证号：scxk(川)2015-030。实验条件和方法经云南中医学院动物实验中心伦理审查合格，动物伦理学审查文件编号为：r-062014012。实验前，所有大鼠适应性喂养1周，在适应性饲养期间，动物自由取食，自由饮水。饲养室内保持安静，室内温度维持在23～25℃，湿度55～75％，日光灯照明，每天24h中保持12h照明12h黑暗。
3实验试剂
实验动物饲料(苏州双狮实验动物饲料科技有限公司)
白藜芦醇(成都普菲德生物技术有限公司)
低密度脂蛋白(ldl-c)测试盒(南京建成生物工程研究所)
丙二醛(mda)测试盒(南京建成生物工程研究所)
超氧化物歧化酶(sod)测试盒(南京建成生物工程研究所)
甘油三脂(tg)测试盒(南京建成生物工程研究所)
总胆固醇(t-cho)测试盒(南京建成生物工程研究所)
高密度脂蛋白(hdl-c)测试盒(南京建成生物工程研究所)
谷胱甘肽过氧化物酶(gsh)测试盒(南京建成生物工程研究所)
atp酶测试盒(南京建成生物工程研究所)
bca蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)
大鼠线粒体呼吸链复合物ⅰ测试盒(上海极威生物科技有限公司)
大鼠线粒体呼吸链复合物ⅱ测试盒(上海极威生物科技有限公司)
蔗糖(天津市风船化学试剂科技有限公司)
tris(北京博奥拓达科技有限公司)
甘露醇(biosharp科技有限公司)
edta(biosharp科技有限公司)
egta(biosharp科技有限公司)
无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)
4实验仪器
bs224电子天平(d＝0.0001g)(北京赛尔利斯仪器系统有限公司)
涡旋震荡仪(lab-blogen倍捷科技vtx-e)
jj1000型精密电子天平(d＝0.02g)(常熟双杰测试仪器厂)
t-5000型电子天平(d＝1g)(常熟双杰测试仪器厂)
dy89-ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)
酶标分析仪(dnm-9602g)(北京普朗新技术有限公司)
紫外分光光度计(756型)(上海光谱仪器有限公司)
高速台式冷冻离心机(tjl-20m)(长沙湘仪离心机仪器有限公司)
osb-2100型水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)
n-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)
shz-diii型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)
dl-5-b型离心机(上海安亭科学仪器厂)
纯水机(milli-qacademica10超纯水系统)(美国millipore公司)
超纯水系统(milli-qreference)(美国millipore公司)
超低温冰箱(美国thermo公司)
sx-500型蒸汽灭菌器(日本tomykogyocoltd公司)
hhs型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)
超声波清洗机(14-1275)(宁波新芝生物科技有限公司)
-80℃冰箱8920(834747-328)(thermoscientiic)
dy89-ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)
spectramaxplus酶标仪(美国moleculardevices公司)
(二)实验方法
1制备组合物提取物
取组合物打成细粉后，各组分以3：3：3：2：2：2：3混合，然后先用12倍量的95％乙醇90℃回流提取，在以12倍量的70％的乙醇回流提取，每次回流2h，合并两次提取液，65℃，转速100，减压浓缩回收乙醇，制备冻干粉。
2脂代谢紊乱大鼠模型复制、分组及给药
60只清洁级spraque-dawley健康sd雄性大鼠随机分成6组，每组10只，即正常组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、阳性药组(白藜芦醇)、组合物提取物低、中、高剂量组(分组及给药详见表2)；各组大鼠均以250g体重给1ml的剂量灌胃给药，连12周，每天1次。除正常组喂普通饲料外，其余各组均喂高脂饲料(基础饲料79％、猪油10％、蛋黄10％、胆固醇1％)，实验期间，每天记录一次大鼠进食量，每周记录一次大鼠体重，计算各组大鼠每周的进食量和体重。
表2大鼠分组及给药情况
3样品采集
在第12周最后一次给药后，对实验大鼠禁食处理12h，戊巴比妥钠麻醉大鼠，取血后，立即离心(3500r﹒min-1，10min)分离血清，所需脏器放置于-80℃冰箱保存，备用。
4组织病理学观察
油红o染色：取肝脏，经固定、脱水、石蜡包埋、制片、油红o染色后，观察形态学变化。
tunel检测肝细胞凋亡：参考文献方法，进行免疫组化检测细胞凋亡。
5血清生化指标测定
按试剂盒说明书具体步骤操作，检测血清的总胆固醇tc和甘油三酯tg的含量。
6脏器指数
分别剖取各脏器(肝、脾、肾)，称重，按脏器指数＝[脏器重量g/体重g]×100％，计算各脏器指数。
7肝组织生化指标测定
取0.1g大鼠肝脏，于匀浆管内剪碎(冰浴上操作)，加0.9ml预冷的生理盐水匀浆10次，转移至1.5ml离心管中，4℃、3000rpm﹒min-1离心10min，取上清液待用。采用bca蛋白测定试剂盒测定上清液中的蛋白含量，按照试剂盒说明书操作，依次加入各试剂，振荡充分混匀，测定上清液中的tc、tg、hdl-c、ldl、mda与gsh的含量。
8肝细胞线粒体相关指标
(1)肝细胞线粒体分离
取大鼠肝脏0.1g，加入1ml预冷的线粒体分离液(0.21m甘露醇、0.07m蔗糖、10mmtrisbase、1mmedta、0.5mmegta，ph至7.4)，于冰水浴中匀浆；将组织匀浆液转移至离心管中，于4℃，1000×g离心10min，弃去沉淀，上清液转移至另一离心管中，4℃，10000×g离心10min，所得沉淀即为肝细胞线粒体。
(2)肝细胞线粒体中mda、sod、gsh、atp合酶及complexi、ii测定
取肝细胞线粒体，加生理盐水混匀成混悬液，用bca蛋白浓度测定试剂盒测定线粒体蛋白浓度；分别取100μl线粒体混悬液，按试剂盒说明书操作，羟胺法测定sod活性，硫代巴比妥酸法测定mda含量，比色法测定gsh、atp合酶活性，双抗体夹心法酶联免疫吸附试验测定complexi、ii活性。
9统计处理
各组数据采用均数±标准差
二、实验结果
(一)组合物对高脂诱导脂代谢紊乱大鼠体重增长的影响
实验过程中，各组大鼠均无死亡，正常进食饮水，活动自如，皮毛光泽度好，对外界刺激反应迅速。实验开始至12周实验结束，结果显示，各组大鼠平均每天的摄食量无显著差异(图1)，各组大鼠均呈正向增长趋势(图2)，体重增长正常。
(二)组合物对高脂诱导脂代谢紊乱大鼠血清tc与tg水平的影响
如图3所示，与正常组相比，模型组tg含量显著升高(p＜0.001)，说明高脂饮食诱导极易造成大鼠血清脂质紊乱。与模型组比较，第12周实验结束，白藜芦醇组大鼠血清中tc、tg含量降低极显著(p<0.01，p<0.001)，高中低剂量组tg含量均显著降低(p<0.001)，且高剂量组tc含量显著降低(p<0.05)，但无显著性差异。结果表明组合物提取物可调节高脂饲料诱导的脂代谢紊乱大鼠血脂异常。
(三)组合物对高脂诱导脂代谢紊乱大鼠脏器指数的影响
实验进行12周结束后，取各组大鼠肝脏、肾脏、脾脏称重，计算各组肝指数、脾指数、肾指数(表2)。结果显示，与正常组相比，其他各组肝指数有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，表明高脂饲料喂食12周后，造成了肝脏的肿大；与正常组相比，脾指数和肾指数没有显著性差异(p＜0.05)，值得注意的是，模型组脾指数和肾指数低于其他组，表明高脂饮食可能会对脾脏和肾脏有一定程度的损伤，给与药物醇提取物后，可改善损伤。与模型组相比，除高剂量组外，其他各给药组都可在降低肝脏肿大程度，表明复方提取物可改善高脂诱导的脂代谢紊乱大鼠肝脏损伤。
表3组合物对脂代谢紊乱大鼠脏器指数影响(
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001，与模型组相比
(四)组合物对高脂诱导脂代谢紊乱大鼠肝组织形态学的影响
各组大鼠肝组织形态学结果显示(图4)，正常组大鼠脂滴面积百分比为4.27％，模型组脂滴面积百分比为55.47％，白藜芦醇组脂滴百分比为38.68％，复方提取物低，中，高剂量组脂滴百分比为40.82％、39.21％和45.17％。模型组大鼠呈现弥漫性肝细胞水肿变性，散在大量大小不等圆形空泡样脂滴，汇管区炎细胞浸润。白藜芦醇组和给药组干预大鼠肝脏病理形态接近正常对照组，有少量炎性细胞浸润，脂滴数量少于模型组。结果表明组合物提取物可有效改善高脂饲料引发的肝组织形态学病变。
免疫组化tunel凋亡率分析结果显示(图5)，正常组、模型组、白藜芦醇组、低计量组、中剂量组、高剂量组肝细胞凋亡率分别为19.76％、35.00％、6.23％、41.26％、16.98％和22.72％，表明组合物提取物中、高剂量组可缓解脂代谢紊乱过程中细胞凋亡，保护肝细胞受损。
(五)组合物对脂代谢紊乱大鼠肝脏tg、tc、ldl-c和hdl-c的影响
图6结果显示，与正常组比较，模型组肝组织中tc、tg和ldl-c含量均升高极显著(p<0.001)，同时，hdl-c含量降低极显著(p<0.001)，表明高脂诱导的大鼠肝脏中存在着明显脂质代谢紊乱。与模型组比较，白藜芦醇组肝组织中tc与tg显著降低(p＜0.01，p＜0.001)，hdl-c含量升高极显著(p＜0.001)，同时ldl-c含量有降低的趋势，但无显著变化，表明其可调节高脂诱导的肝脏脂质异常；给予不同剂量复方提取物后，低、中、高剂量给药组中tc与tg含量降低极显著(p＜0.001)；高剂量给药组ldl-c含量降低极显著(p＜0.001)，同时，低、中剂量给药组能一定程度降低ldl-c含量，但无显著性差异；低、中、高剂量给药组中hdl-c含量都有一定的升高趋势，但无显著性差异。结果表明复方提取物均可较好改善高脂饲料诱发的肝脏脂质异常。
(六)组合物对脂代谢紊乱大鼠肝脏mda和gsh的影响
如图7结果所示，与正常组相比，模型组大鼠肝脏线粒体中mda含量极显著升高(p＜0.001)，且gsh活力降低具有显著性(p＜0.05)，表明脂代谢紊乱大鼠肝脏中存在氧化应激与脂质过氧化损伤。与模型组相比，给予复方提取物后，各剂量给药组中mda含量降低极显著(p<0.001)，中剂量给药组中ghs含量升高极显著，低、高剂量给药组均有一定程度升高，但均无显著变化。表明组合物提取物能有效地调节脂代谢紊乱大鼠氧化应激与脂质过氧化损伤，从而缓解脂代谢紊乱的发生。
(七)组合物对脂代谢紊乱大鼠肝脏线粒体中atp合酶与complexⅰ、ⅱ的影响
由图8结果可见，与正常组相比，模型组大鼠肝脏线粒体中complexⅰ、complexⅱ、atp合酶(na+-k+-atp酶、ca2+-mg2+-atp酶)含量均极显著降低(p＜0.001)，显示脂代谢紊乱大鼠肝线粒体能量代谢紊乱。且与模型组比较，白藜芦醇极显著升高na+-k+-atp酶活力(p<0.001),complexⅱ活力有显著性差异(p<0.05)，一定程度提高ca2+-mg2+-atp酶与complexⅱ活性，但无显著性差异，表明其可一定程度改善脂代谢紊乱大鼠能量代谢；给予不同剂量复方醇提物后，其低、中、高剂量给药组肝线粒体中complexⅱ活力均极显著升高(p＜0.001)；低剂量给药组能一定程度升高na+-k+-atp酶和complexⅱ活力，但无显著差异；高剂量有升高na+-k+-atp酶、ca2+-mg2+-atp酶活力的趋势，但无显著性差异。结果表明复方提取物可在一定程度上调节脂代谢紊乱大鼠能量代谢障碍紊乱。
(八)组合物对脂代谢紊乱大鼠肝脏线粒体中mda、gsh与sod含量的影响
如图9结果所示，与正常组相比，模型组大鼠肝脏线粒体中mda含量显著升高(p＜0.05)，gsh含量显著减低(p＜0.05)，且sod与活力一定程度降低(无显著差异)，提示脂代谢紊乱大鼠肝线粒体中存在氧化应激与脂质过氧化损伤。与模型组相比，白藜芦醇组显著降低mda含量(p<0.05)，且显著提高gsh(p<0.05)以及一定程度提高sod活力，但无显著变化，表明其可一定程度提高脂代谢紊乱大鼠氧化应激能力；给予组合物提取物后，低剂量给药组mda含量显著降低(p＜0.01)，中、高剂量给药组有一定程度降低，但无显著差异；低剂量给药组sod与gsh活力有一定升高趋势(无显著变化)，中剂量sod活力显著升高(p＜0.01)；高剂量sod与gsh活力均一定程度升高(无显著变化)；表明复方提取物可在一定程度上调节肝线粒体功能提高nalfd大鼠肝脏的氧化应激能力。
实施例5组合物、红曲和普洱茶对高脂饮食诱导脂代谢紊乱大鼠的干预作用比较研究
为了进一步证明本发明的组合物与红曲、普洱茶相比获得了更加优异的降血脂、调节脂代谢紊乱的效果，我们还进行了作用比较研究。
一、实验材料与方法
(一)实验材料
1实验材料
所有材料购自昆明螺蛳湾药材批发市场，凭证标本均保存于昆明市代谢性疾病中医药防治重点实验室。
阳性药白藜芦醇购于成都普菲德生物技术有限公司。
2实验动物
8周龄清洁级spraque-dawley健康雄性大鼠60只，体重180±20g，购自成都达硕实验动物有限公司，质量合格证号：scxk(川)2015-030。实验条件和方法经云南中医学院动物实验中心伦理审查合格，动物伦理学审查文件编号为：r-062014012。实验前，所有大鼠适应性喂养1周，在适应性饲养期间，动物自由取食，自由饮水。饲养室内保持安静，室内温度维持在23～25℃，湿度55～75％，日光灯照明，每天24h中保持12h照明12h黑暗。
3实验试剂
实验动物饲料(苏州双狮实验动物饲料科技有限公司)
白藜芦醇(成都普菲德生物技术有限公司)
低密度脂蛋白(ldl-c)测试盒(南京建成生物工程研究所)
丙二醛(mda)测试盒(南京建成生物工程研究所)
超氧化物歧化酶(sod)测试盒(南京建成生物工程研究所)
甘油三脂(tg)测试盒(南京建成生物工程研究所)
总胆固醇(t-cho)测试盒(南京建成生物工程研究所)
高密度脂蛋白(hdl-c)测试盒(南京建成生物工程研究所)
谷胱甘肽过氧化物酶(gsh)测试盒(南京建成生物工程研究所)
atp酶测试盒(南京建成生物工程研究所)
bca蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)
大鼠线粒体呼吸链复合物ⅰ测试盒(上海极威生物科技有限公司)
大鼠线粒体呼吸链复合物ⅱ测试盒(上海极威生物科技有限公司)
蔗糖(天津市风船化学试剂科技有限公司)
tris(北京博奥拓达科技有限公司)
甘露醇(biosharp科技有限公司)
edta(biosharp科技有限公司)
egta(biosharp科技有限公司)
无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)
4实验仪器
bs224电子天平(d＝0.0001g)(北京赛尔利斯仪器系统有限公司)
涡旋震荡仪(lab-blogen倍捷科技vtx-e)
jj1000型精密电子天平(d＝0.02g)(常熟双杰测试仪器厂)
t-5000型电子天平(d＝1g)(常熟双杰测试仪器厂)
dy89-ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)
酶标分析仪(dnm-9602g)(北京普朗新技术有限公司)
紫外分光光度计(756型)(上海光谱仪器有限公司)
高速台式冷冻离心机(tjl-20m)(长沙湘仪离心机仪器有限公司)
osb-2100型水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)
n-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)
shz-diii型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)
dl-5-b型离心机(上海安亭科学仪器厂)
纯水机(milli-qacademica10超纯水系统)(美国millipore公司)
超纯水系统(milli-qreference)(美国millipore公司)
超低温冰箱(美国thermo公司)
sx-500型蒸汽灭菌器(日本tomykogyocoltd公司)
hhs型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)
超声波清洗机(14-1275)(宁波新芝生物科技有限公司)
-80℃冰箱8920(834747-328)(thermoscientiic)
dy89-ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)
spectramaxplus酶标仪(美国moleculardevices公司)
(二)实验方法
1组合物、红曲、普洱茶提取物制备
组合物提取物：取组合物打成细粉后，各组分以3：3：3：2：2：2：3混合，然后先用12倍量的95％乙醇90℃回流提取，在以12倍量的70％的乙醇回流提取，每次回流2h，合并两次提取液，65℃，转速100，减压浓缩回收乙醇，制备冻干粉。
红曲和普洱茶提取物：分别取红曲和普洱茶打成细粉后，分别用12倍量的95％乙醇90℃回流提取，在以12倍量的70％的乙醇回流提取，每次回流2h，合并两次提取液，65℃，转速100，减压浓缩回收乙醇，制备冻干粉。
2nafld大鼠模型复制、分组及给药
60只清洁级spraque-dawley健康sd雄性大鼠随机分成6组，每组10只，即正常组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、阳性药组(白藜芦醇)、组合物组、红曲组、普洱茶组(分组及给药详见表4)；各组大鼠均以250g体重给1ml的剂量灌胃给药，连12周，每天1次。除正常组喂普通饲料外，其余各组均喂高脂饲料(基础饲料79％、猪油10％、蛋黄10％、胆固醇1％)，实验期间，每天记录一次大鼠进食量，每周记录一次大鼠体重，计算各组大鼠每周的进食量和体重。
表4大鼠分组及给药情况
3样品采集
在第12周最后一次给药后，对实验大鼠禁食处理12h，戊巴比妥钠麻醉大鼠，取血后，立即离心(3500r﹒min-1，10min)分离血清，所需脏器放置于-80℃冰箱保存，备用。
4组织病理学观察
油红o染色：取肝脏，经固定、脱水、石蜡包埋、制片、油红o染色后，观察形态学变化。
tunel检测肝细胞凋亡：参考文献方法，进行免疫组化检测细胞凋亡。
5血清生化指标测定
按试剂盒说明书具体步骤操作，检测血清的总胆固醇tc和甘油三酯tg的含量。
6脏器指数
分别剖取各脏器(肝、脾、肾)，称重，按脏器指数＝[脏器重量g/体重g]×100％，计算各脏器指数。
7肝组织生化指标测定
取0.1g大鼠肝脏，于匀浆管内剪碎(冰浴上操作)，加0.9ml预冷的生理盐水匀浆10次，转移至1.5ml离心管中，4℃、3000rpm﹒min-1离心10min，取上清液待用。采用bca蛋白测定试剂盒测定上清液中的蛋白含量，按照试剂盒说明书操作，依次加入各试剂，振荡充分混匀，测定上清液中的tc、tg、hdl-c、ldl、mda与gsh的含量。
8肝细胞线粒体相关指标
(1)肝细胞线粒体分离
取大鼠肝脏0.1g，加入1ml预冷的线粒体分离液(0.21m甘露醇、0.07m蔗糖、10mmtrisbase、1mmedta、0.5mmegta，ph至7.4)，于冰水浴中匀浆；将组织匀浆液转移至离心管中，于4℃，1000×g离心10min，弃去沉淀，上清液转移至另一离心管中，4℃，10000×g离心10min，所得沉淀即为肝细胞线粒体。
(2)肝细胞线粒体中atp合酶及complexi、ii测定
取肝细胞线粒体，加生理盐水混匀成混悬液，用bca蛋白浓度测定试剂盒测定线粒体蛋白浓度；分别取100μl线粒体混悬液，按试剂盒说明书操作，比色法测定atp合酶活性，双抗体夹心法酶联免疫吸附试验测定complexi、ii活性。
9统计处理
各组数据采用均数±标准差
二、实验结果
(一)组合物、红曲和普洱茶对高脂诱导nafld大鼠体重增长的影响
实验过程中，各组大鼠均无死亡，正常进食饮水，活动自如，皮毛光泽度好，对外界刺激反应迅速。实验开始至12周实验结束，结果显示，各组大鼠平均每周的摄食量无显著差异(图10)，各组大鼠均呈正向增长趋势(图11)，体重增长正常。
(二)组合物、红曲和普洱茶对高脂诱导nafld大鼠血清tc与tg水平的影响
如图12所示，与正常组相比，模型组tg含量极显著升高(p＜0.001)，且tc含量显著升高(p＜0.05)，说明高脂饮食诱导造成大鼠血清脂质紊乱。与模型组比较，第12周实验结束，白藜芦醇组大鼠血清中tc、tg含量显著降低(p＜0.05，p＜0.001)表明其可调节调节高脂诱导的nafld大鼠血脂异常；与模型组相比，红曲组、普洱茶组和组合物组tg含量均显著降低(p＜0.001)，且组合物组tg含量水平显著低于红曲组和普洱茶组(p＜0.05)；同时，组合物tc含量显著降低(p＜0.05)，红曲组和组合物组tc含量均有降低趋势，但无显著变化。结果表明，红曲、普洱茶和组合物都可调节nafld大鼠血脂异常，且组合物的效果显著优于红曲或普洱茶。
(三)组合物、红曲和普洱茶对高脂诱导nafld大鼠脏器指数的影响
实验进行12周结束后，取各组大鼠肝脏、肾脏、脾脏称重，计算各组肝指数、脾指数、肾指数(表5)。结果显示，与正常组相比，除红曲组的脾指数外，其余各给药组的肾指数和脾指数无显著差异(p＜0.05)，表明本实验方法对大鼠肾脏和脾脏没有造成显著性损伤。与正常组相比，其他各组肝指数差异显著(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，表明高脂诱导nafld大鼠12周后，造成了肝脏的肿大和损伤；与模型组相比，各给药组肝指数都有下降的趋势，且组合物组显著下降，红曲组和普洱茶组没有显著性差异，表明组合物可显著抑制高脂诱导的nafld大鼠肝脏损伤。
表5组合物、红曲和普洱茶对nafld大鼠脏器指数影响(
(四)组合物、红曲和普洱茶对高脂诱导nafld大鼠肝组织形态学的影响
各组大鼠肝组织形态学结果显示(图13)，正常组大鼠脂滴面积百分比为4.27％，模型组脂滴面积百分比为55.47％，白藜芦醇组脂滴百分比为38.68％，红曲、普洱茶和组合物组脂滴百分比为45.17％、42.02％和35.94％。模型组大鼠呈现弥漫性肝细胞水肿变性，散在大量大小不等圆形空泡样脂滴，汇管区炎细胞浸润。白藜芦醇组和给药组干预大鼠肝脏病理形态接近正常对照组，有少量炎性细胞浸润，脂滴数量少于模型组。结果表明红曲、普洱茶和组合物提取物可有效改善高脂诱导nafld大鼠的肝组织形态学病变，且组合物提取物效果较优于红曲或普洱茶提取物。
免疫组化tunel凋亡率分析结果显示(图14)，正常组、模型组、白藜芦醇组、红曲组、普洱茶组和组合物组肝细胞凋亡率分别为19.76％、35.00％、6.23％、11.45％、47.98％和11.87％，表明三种提取物可缓解nafld过程中细胞凋亡，保护肝细胞受损，且组合物和红曲效果优于普洱茶。
(五)组合物、红曲和普洱茶对nafld大鼠肝脏tg、tc、ldl-c和hdl-c的影响
图15结果显示，与正常组比较，模型组肝组织中tc、tg和ldl-c含量均显著升高(p＜0.01，p＜0.001)，同时hdl-c含量具有下降趋势，但无显著性差异，表明高脂诱导的nafld大鼠肝脏中存在着明显脂质代谢紊乱。与模型组比较，白藜芦醇组肝组织中tc、tg和ldl-c具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，表明其可调节高脂诱导的nafld大鼠肝脏脂质异常；给予不同提取物后，红曲组，普洱茶组和组合物组中tc与tg含量显著降低(p＜0.01，p＜0.001)，红曲组和组合物组ldl-c含量显著降低(p＜0.05)，其次，三种提取物给药组hdl-c有升高降趋势，但无显著性差异；与组合物组相比，红曲组和普洱茶组tc显著升高(p＜0.05)，tg也有升高的趋势。结果表明，三种提取物都可较好改善高脂诱导的nafld大鼠肝脏脂质异常，且组合物组的效果显著优于红曲组或普洱茶组。
(六)组合物、红曲和普洱茶对nafld大鼠肝脏mda和gsh-px的影响
如图16结果所示，与正常组相比，模型组大鼠肝脏中gsh-px活力降低极显著(p＜0.001)，且mda含量升高极显著(p＜0.001)，表明nafld大鼠肝脏中存在氧化应激与脂质过氧化损伤。与模型组相比，白藜芦醇组gsh-px活力显著升高(p＜0.05)，mda含量降低显著(p＜0.01)，表明白藜芦醇可降低nafld大鼠肝脏氧化应激与脂质过氧化损伤；与模型组相比，组合物组gsh-px活力显著升高(p＜0.001)，红曲组和普洱茶组有升高趋势，但无显著性差异，同时，三种提取物mda含量显著降低(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)；与组合物组相比，普洱茶组gsh-px活力显著降低，红曲组也有降低趋势，但无显著性差异，同时，普洱茶和红曲组的mda含量显著升高(p＜0.05，p＜0.01)。结果表明三种提取物能调节nafld大鼠肝脏氧化应激与脂质过氧化损伤，从而缓解非酒精性脂肪肝的发生，且组合物的效果显著优于红曲和普洱茶。
(五)组合物、红曲和普洱茶对nafld大鼠肝脏线粒体中atp合酶与complexⅰ、complexⅱ的影响由图17结果可见，与正常组相比，模型组大鼠肝脏线粒体中complexⅰ、complexⅱ、atp合酶(na+-k+-atpase酶、ca2+-mg2+-atpase酶)活力均显著降低(p＜0.01，p＜0.001)，表明高脂诱导nafld大鼠肝线粒体能量代谢紊乱。与模型组比较，白藜芦醇给药组na+-k+-atpase酶和complexⅱ酶的酶活力有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)，一定程度提高ca2+-mg2+-atpase酶与complexⅰ酶活性，但无显著性差异，表明其可一定程度改善nafld大鼠肝线粒体能量代谢异常。
与模型组相比，给予不同提取物后，普洱茶组和组合物组肝线粒体中atp合酶(na+-k+-atpase酶、ca2+-mg2+-atpase酶)活力显著升高(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，红曲组肝线粒体中atp合酶活力也有升高趋势，但无显著性差异，同时，组合物组complexⅰ、ⅱ酶活力显著升高(p＜0.01)，红曲组和普洱茶组complexⅰ、ⅱ酶活力有升高趋势，但无显著性差异；与组合物组相比，普洱茶组atp合酶(na+-k+-atpase酶、ca2+-mg2+-atpase酶)活力和complexⅰ酶活力显著降低(p＜0.05，p＜0.01)；红曲组atp合酶与complexⅰ、ⅱ酶活力均有减低趋势，但无显著性差异。结果表明三种提取物可在一定程度上调节nafld大鼠肝线粒体能量代谢障碍紊乱，且组合物药效显著优于红曲或普洱茶。
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