通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物及制备方法与流程

本发明属于动物肠道菌群定向调控技术领域，具体涉及一种通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物及制备方法。

背景技术：

肠道菌群是维护宿主肠道机能稳定和正常免疫功能的基础，对动物养分消化吸收、肠道屏障功能、机体免疫和机体代谢等过程都有重要影响。肠道菌群与动物的生长发育、各器官功能作用，疾病尤其是肠道疾病等有直接关系，对宿主的健康具有重要意义。因此如何维护肠道菌群平衡，保证肠道代谢、免疫功能是十分重要的。

正常情况下肠道菌群种类和数量保持相对稳定。肠道菌群和宿主间存在共生关系，肠道菌群和宿主相互影响。肠道菌群影响宿主的消化、免疫和机体代谢等，许多宿主因素也影响了肠道菌群的组成，包括宿主的食物结构(脂肪、寡糖、膳食纤维、微生态制剂、有机酸等)、生活环境、生活习惯、生理状态、疾病、抗生素等药物的应用等会显著影响肠道菌群种类、数量、比例和定位。

研究发现高脂日粮、断奶应激、抗氧化剂(如硫辛酸、n-乙酰半胱氨酸)、低聚糖、黑蒜粉和大蒜素等均能改变肠道菌群的组成。因此通过开发一种通过调节肠道氧化还原状态，实现定向调节肠道菌群组成的组合物成为可能。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物，其能够提高机体的抗氧化能力，改变肠道氧化还原环境，定向调节肠道菌群组成，且该组合物安全性高，无不良反应。

本发明的第二个目的是提供上述组合物的制备方法。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物，该组合物由药用果实发酵物(组分a)和抗氧化强化物(组分b)组成，重量比为(1-99)：(1-99)。

优选地，药用果实发酵物和抗氧化强化物的重量比为1:4。

优选地，药用果实发酵物和抗氧化强化物的重量比为2:5。

优选地，药用果实发酵物和抗氧化强化物的重量比为1:3。

优选地，药用果实发酵物由30-50份金针菇、10-30份诺丽果、10-40份雪莲果和10-20份刺梨经复合微生物发酵剂发酵获得。

其中，金针菇又称小火菇、朴菇，是一种常见食用菌，金针菇含有丰富的蛋白质、碳水化合物和粗脂肪，还含有vb1、vb2、vc等多种维生素，总氨基酸含量高达10％，金针菇子实体提取物具含有丰富的多糖和多酚，具有显著的抗氧化活性、抗肿瘤活性及降低心血管疾病的作用，清除人体中过多的自由基，能够增强机体免疫力。

诺丽果是一种富含多种营养成分，生长在夏威夷和大溪地岛屿上的热带植物，几千年来民间将其茎、根、皮、叶和果实作为药物治疗多种疾病，包括糖尿病、高血压和癌症等，诺丽果含有多种必需氨基酸、维生素、微量元素，生物活性物质赛洛宁原，近年发现，诺丽果含有丰富的钾、黄酮醇糖苷和环烯醚萜糖苷，具有显著清除体内超氧阴离子和脂质过氧化物功能。

雪莲果又叫菊薯、雪莲薯、地参果。雪莲果果寡糖含量是干物质的60-70％，是所有植物中最高的；它含有20种人体必需的氨基酸及丰富的矿物质，雪莲果还含有极高的钙、镁、铁、锌、钾、硒等微量元素。

刺梨肉质肥厚、味酸甜、果实富含糖、维生素、胡萝卜素、有机酸和20多种氨基酸、10余种对人体有益的微量元素，以及过氧化物歧化酶；尤其是维生素c含量极高，是当前水果中最高的，每100克鲜果中含量841.58-3541.13毫克，是柑橘的50倍，猕猴桃的10倍，具有“维生素c之王”的美称。

优选地，复合微生物发酵剂由10-30份酿酒酵母(saccharomycescerevisiae，优选为accc20065)、10-30份嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus，优选为accc10637)、10-30份植物乳杆菌(lactobacillusplantarum，优选为accc11118)和10-30份双歧杆菌(bifidobacterium，优选为accc11054)混合发酵得到。

优选地，抗氧化强化物由5-15wt％n-乙酰半胱氨酸、10-25wt％硫辛酸、1-8wt％ve、0.001-0.006wt％酵母硒、1-8wt％β-胡萝卜素、5-15wt％茶多酚、2-6wt％vc、2-10wt％姜黄素和余量的葡萄糖组成，其总重量满足100wt％。

本发明中n-乙酰半胱氨酸、ve、酵母硒、β-胡萝卜素、茶多酚、vc、姜黄素、硫辛酸具有显著的抗氧化能力。

其中，n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，nac)是机体合成含巯基(-sh)的还原型谷胱甘肽(glutathione，gsh)前体物。细胞内过量产生的活性氧(ros)会提升氧化应激水平，导致核酸、蛋白质及膜脂质等发生氧化，破坏细胞器结构和功能。nac中的-sh能够保护这些生物大分子的活性，有效清除各类超氧化物如h2o2与^·o^2－等，维持正常细胞功能。gsh是体内重要的抗氧化物质，除了能直接清除^·oh^－和^·o^2－外，其亲核基团(-sh)可与各类亲电性毒物结合，生成巯基尿酸(amcc)经肾脏或胆汁排出体外。当细胞内gsh缺乏时，核酸、蛋白质等亲核大分子可与亲电性毒物结合，导致自身结构功能破坏，引起细胞死亡。nac因相对分子量较小，容易进入细胞并脱乙酰基生成gsh合成的前体半胱氨酸，补充gsh，缓解氧化应激时gsh合成限制，增加细胞抗氧化能力并降低毒物损伤。

ve又称生育酚，由于其自身极易氧化而保护其他物质不被氧化，是动物和人体中的一种主要的、最有效的脂溶性抗氧化剂。ve主要是通过清除脂质过氧化氢等自由基，并终止链式氧化反应来实现的。当机体内的一个自由基从高度不饱和脂肪酸中获得一个氢原子时，便启动了脂质氧化，继而触发链式增殖反应。而ve可通过向脂质过氧自由基提供一个氢原子，阻止其启动链式增殖反应。

硒是人和动物所必需的微量元素之一，是动物体内谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和硒蛋白的重要组成部分，能够清理体内活性氧化物质，起着平衡氧化还原的作用，对机体具有抗氧化、抗应激、提高免疫力等生物学功能，酵母硒与无机硒有不同的吸收、运输和代谢途径，动物体对酵母硒的吸收率是无机硒的20倍，有更好的抗氧化效果。

β-胡萝卜素属于类胡萝卜素，是维生素a的前体物质，其多烯烃结构有较好的抗氧化能力，能清除自由基，降低脂质过氧化物的产生，使机体的抗氧化状态明显改善。

茶多酚(c17h19n3o)是一种稠环芳香烃，茶多酚的抗氧化作用是由于结构中儿茶素c环和b环上的酚羟基有供氢体的活性，在氧化过程中生成邻醌类及联苯酚醌。它可以有效清除脂类自由基和氧自由基，近代医学研究表明，茶多酚具有抗癌、抗衰老、抗辐射、清除人体自由基、降低血糖血脂等一系列重要的药理功能。

vc又称vc抗坏血酸，既可作为羟化酶辅基参与动物结缔组织、骨骼、血管细胞间质等形成，还可作为还原剂提高动物体的抗氧化能力，是一种动物必需的、具有多重生物学功能的营养素。在生物体内，vc以氧化型或还原型形式存在，既可作为氢受体又可以作为氢供体，是最重要的还原剂和抗氧化剂之一。vc是一个极好的电子源，它可以为羟基和超氧化物自由基等提供电子，终止自由基的活性，减轻氧化损伤。

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种脂溶性酚类物质。药理学研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、降血糖和促进伤口愈合的作用，对多种慢性疾病和某些癌症都有治疗作用，并且可以增强常规化疗药物的药效。大量结果显示姜黄素具有清除活性氧等抗氧化作用，如可以清除超氧阴离子、羟自由基和一氧化氮，增强抗氧化酶，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性。姜黄素具有酚羟基和β-二酮两个活性部位以及其他碳连接体，二酮部分具有烯醇式结构互变。在反应中，它拥有酚羟基或者二酮可以提供一个质子；另外，在链中心的ch2基团中的氢原子转移对姜黄素及其酚羟基-基团的抗氧化性能也起着重要作用。具体涉及到h原子从烷氧基自由基转移，该自由基产生于其七烷酮链的中心，经过分子重排形成苯氧基自由基。因此，庚二酮链的中心亚甲基与羟基一起在姜黄素抗氧化活性中发挥作用。

硫辛酸又称α-硫辛酸，是一种天然的二硫化合物。α-硫辛酸(氧化型)在体内可以转变为二氢硫辛酸(还原型)，α-硫辛酸和二氢硫辛酸都具有很强的抗氧化性，在体内协同作用。硫辛酸在体内经肠道吸收后进入细胞，兼具脂溶性与水溶性的特性，因此可以在全身通行无阻，到达任何一个细胞部位，提供人体全面效能，是同时具有脂溶性与水溶性的“万能抗氧剂”。研究表明，硫辛酸能够清除过羟基自由基、次氯酸、过氧亚硝酸盐、单线态氧、一氧化氮等，但不能清除超氧阴离子和氢过氧基；而二氢硫辛酸能清除除单线态氧以外的其他自由基。α-硫辛酸和二氢硫辛酸在生物体内相互转化、协调，可以充分发挥高效的抗氧化作用。α-硫辛酸通过螯合cu²⁺、mn²⁺、zn²⁺、cd²⁺等离子可减少其所诱导的抗坏血酸氧化及脂质过氧化和细胞毒性。

茶多酚可以使ve再生继续发挥抗氧化作用；vc可以与ve交换电子从而使ve维持正常水平不断发挥抗氧化作用；茶多酚抑制了β-胡萝卜素的氧化分解，提高了体系中β-胡萝卜素的保存率。α-硫辛酸(氧化型)在体内可以转变为二氢硫辛酸(还原型)，是一种强还原剂，可以还原再生vc、gsh、辅酶q、硫氧还蛋白等nadph或nadh等抗氧化剂来再生ve，保护膜被氧化。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种上述的通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、药用果实发酵物(组分a)的制备过程为：将选定的果实与制备好的复合微生物发酵剂发酵、浓缩、干燥，具体地，

<1>分别取新鲜的30-50份金针菇、10-30份诺丽果、10-40份雪莲果和10-20份刺梨，清洗后在0.2-0.5wt％稀醋酸溶液中浸泡20-35min，浸泡后将果实粉碎成浆状，得到浆状物；

<2>将50-75份浆状物、3-6份红糖和20-40份水混合均匀，得到混合物；

<3>将10-30份酿酒酵母、10-30份嗜酸乳杆菌、10-30份植物乳杆菌和10-30份双歧杆菌混合发酵，得到复合微生物发酵剂；

<4>将复合微生物发酵剂按比例1:(15-20)接种到混合物内，在28-32℃条件下，厌氧发酵12-15天，得到药用果实复合微生物发酵液；

<5>将药用果实复合微生物发酵液经灭菌，喷雾干燥得到药用果实发酵物；

(2)、抗氧化强化物(组分b)的制备过程为：将5-15wt％n-乙酰半胱氨酸、10-25wt％硫辛酸、1-8wt％ve、0.001-0.006wt％酵母硒、1-8wt％β-胡萝卜素、5-15wt％茶多酚、2-6wt％vc、2-10wt％姜黄素和余量的葡萄糖混合均匀，得到抗氧化强化物；

(3)、将药用果实发酵物(组分a)和抗氧化强化物(组分b)按重量比混合均匀，密封包装，得到通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物。

其中，步骤<3>中，酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌按常规方法培养发酵获得。

优选地，复合微生物发酵剂中酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)为accc20065、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)为accc10637、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)为accc11118、双歧杆菌(bifidobacterium)为accc11054。

优选地，本发明具有改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群组成的组合物也可以制备成液态产品，方法是将果实复合微生物发酵液灭菌后不进行喷雾干燥，具体地，

步骤<5>中，药用果实复合微生物发酵液经灭菌，得到药用果实发酵液；

将2-5份抗氧化强化物溶解在30-70份药用果实发酵液中，得到液态的通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群组合物。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明通过微生物复合发酵技术对药用性果实的有效成分进行转化，破碎细胞壁，有效成分充分释放、吸收提高利用效率，同时根据自由基生物学理论，将多种优选的抗氧化物质有机配合构成抗氧化剂链式结构，通过分子间的协同和分子内的协同作用，充分发挥各组分抗氧化协同作用，获得比单一抗氧剂高的多的抗氧化能力，从而提高生物体的氧化稳定性。另外，复合抗氧化剂可以相互修复再生，形成氧化还原循环系统，通过相互作用，可以消除自由基和单线态氧；将活性氧与其特异作用部位相隔离，从而使抗氧化活性显著强于单体抗氧化剂。

由于这种协同作用，显著提高了机体和肠道的抗氧化能力，维持特定的肠道氧化还原状态。不同的氧化还原状态适合不同的肠道微生物生长发育，而且发酵物中的多种活性成分使肠道更适合于有益菌的生长而不利于有害菌的生长，从而定向调整肠道菌群组成，肠道中总菌数增加，乳酸菌和双歧杆菌的比例增加，大肠杆菌比例减少，肠道更健康。因此本发明的组合物具有通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群组成的功能。

附图说明

图1为本发明的实施例3中应用本发明产品后结肠的氧化还原状态图。

图2为本发明的实施例3中构建的pls-da判别分析图(根据各组中样品分布绘制椭圆形区域以区分对照组、diquat处理组和本发明产品组，各组的样品名称以不同数字和字母组合表示；其中，对照组的样品为c3tu、c4tu、c6tu、c13tu、c17tu；diquat处理组样品为13tu、14tu、17tu、23tu、29tu；本发明产品组样品为72tu、74tu、76tu、77tu、78tu)。

图3为本发明的实施例3中基于分类等级树的组间差异分类单元展示图。

图4为本发明的实施例3中组间具有显著差异的分类单元图。

图5为本发明的实施例4中仔猪回肠、结肠和盲肠主要微生物菌群的变化。

具体实施方式

本发明提供了一种通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物及制备方法。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本实施例的通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物(粉状)的制备方法包括如下步骤：

(1)、药用果实发酵物(组分a)的制备过程为：

<1>分别取新鲜的40份金针菇、25份诺丽果、25份雪莲果和10份刺梨，清洗后在0.3wt％稀醋酸溶液中浸泡30min，浸泡后将果实粉碎成浆状，得到浆状物；

<2>将60份浆状物、5份红糖和35份水混合均匀，得到混合物；

<3>将20份酿酒酵母accc20065、20份嗜酸乳杆菌accc10637、30份植物乳杆菌accc11118和30份双歧杆菌accc11054混合发酵，得到复合微生物发酵剂；

<4>将复合微生物发酵剂按比例1:20接种到混合物内，在30℃下，厌氧发酵15天，得到药用果实复合微生物发酵液；

<5>将药用果实复合微生物发酵液按常规方法灭菌，喷雾干燥得到药用果实发酵物；

(2)、抗氧化强化物(组分b)的制备过程为：将10wt％n-乙酰半胱氨酸、15wt％硫辛酸、4wt％ve、0.004wt％酵母硒、5wt％β-胡萝卜素、10wt％茶多酚、6wt％vc、5wt％姜黄素和44.996wt％葡萄糖混合均匀，得到抗氧化强化物；

(3)、将3份药用果实发酵物(组分a)和15份抗氧化强化物(组分b)混合均匀，密封包装，得到通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物(粉状)。

实施例2：

本实施例的通过改变肠道氧化还原状态定向调节肠道菌群的组合物(液态)的制备方法包括如下步骤：

(1)、药用果实发酵液的制备过程为：

<1>分别取新鲜的40份金针菇、25份诺丽果、25份雪莲果和10份刺梨，清洗后在0.3wt％稀醋酸溶液中浸泡30min，浸泡后将果实粉碎成浆状，得到浆状物；

<2>将60份浆状物、5份红糖和35份水混合均匀，得到混合物；

<3>将20份酿酒酵母accc20065、30份嗜酸乳杆菌accc10637、25份植物乳杆菌accc11118和25份双歧杆菌accc11054混合发酵，得到复合微生物发酵剂；

<4>将复合微生物发酵剂按比例1:20接种到混合物内，在30℃下，厌氧发酵15天，得到药用果实复合微生物发酵液；

<5>将药用果实复合微生物发酵液按常规方法灭菌，得到药用果实发酵液；

(2)、抗氧化强化物(组分b)的制备过程为：将10wt％n-乙酰半胱氨酸、15wt％硫辛酸、4wt％ve、0.004wt％酵母硒、5wt％β-胡萝卜素、10wt％茶多酚、6wt％vc、5wt％姜黄素和44.996wt％葡萄糖混合均匀，得到抗氧化强化物；

(3)、将3份抗氧化强化物(组分b)充分溶解在60份药用果实发酵液中即可。

实施例3：

通过改变肠道氧化还原状态调节小鼠肠道菌群的方法

选择了30只体重16-18g的健康的c57bl/6雌鼠随机分为对照组、模型组和本发明产品组，每组10只。对照组(control)和模型组(model)灌胃生理盐水，本发明产品组(ma)灌胃实施例2制备的液态产品，灌胃容量为0.2ml/10g体重，灌胃21天，自由采食和饮水。实验第22天，对照组小鼠腹腔注射生理盐水，其余2组分别腹腔注射36mg/kg体重的diquat溶液，注射3h后处死、采样。试验发现，diquat处理显著提高结肠的o2^·-、h2o2、md和pc水平，灌胃本发明产品后显著逆转了这些指标，改善了结肠的氧化还原状态(图1)。

采用illuminamiseq测序技术对小鼠回肠近肠壁微生物进行基因测序，通过r软件，根据物种丰度矩阵和样本分组数据构建pls-da偏最小二乘法判别分析(图2)表明，本发明产品处理组小鼠肠道菌群组成与对照组和diquat处理组(即模型组)小鼠均存在差异；与对照组和diquat处理组相比，本发明产品处理组小鼠肠道菌群组间差异小，数据结果提示本发明产品处理可改变小鼠回肠近肠壁菌群组成，使菌群组成趋于一致化。基于lefse分析(图3)和lda差异分析(图4)显示diquat处理导致小鼠回肠近肠壁prevotella、pseudomonas和af12属的细菌丰度显著增加，本发明产品处理组小鼠回肠近肠壁中adlercreutzia、enterococcus、turicibacter和jeotgalicoccus属细菌丰度显著增加，其中，本产品对diquat处理导致的prevotella、pseudomonas和af12属的细菌丰度增加有显著抑制作用。

实施例4：

通过改变肠道氧化还原状态调节仔猪肠道菌群的方法

选择15窝150头新生仔猪随机分成3组，每组5窝，分别为对照组、断奶组和本发明产品组。14-25日龄对照组和处理组仔猪采食日粮。对照组和断奶组饲喂基础日粮，本发明产品组在基础日粮中上添加5g/kg实施例1制备的粉状本发明产品。断奶组和本发明产品组分别在21日龄断奶，对照组继续哺乳。分别测定了24d龄仔猪回肠、结肠和盲肠的氧化还原状态和主要微生物群，采用实时绝对定量pcr反应对总菌、乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌的数量进行定量。结果表明，断奶应激显著改变仔猪回肠，结肠和盲肠氧化还原状态和肠道微生物群的变化，乳酸菌和双歧杆菌降低，大肠杆菌增加，添加本发明产品，能显著调整仔猪回肠、结肠和盲肠氧化还原状态，抗氧化能力增强，肠道乳酸菌和双歧杆菌增加，大肠杆菌降低(表1、表2、表3、图5)；发现乳酸菌、双歧杆菌与t-aoc、gsh-px、sod活性呈正相关(p<0.05)，与h2o2、no、oh·、mda水平升高呈负相关(p<0.05)，大肠杆菌与断奶仔猪肠道内自由基和mda水平的升高呈显著正相关(p<0.05)，与仔猪肠道内抗氧化酶活性呈显著负相关(p<0.05)(表4、表5、表6)。证明肠道的氧化还原状态与肠道菌群有密切的关系，本发明产品可以通过调节肠道氧化还原状态从而调节肠道菌群结构，从而改善肠道健康。

表1仔猪回肠组织的氧化还原状态

注：同行数据肩注不同字母表示差异显著(p<0.05)，无字母或字母相同表示差异不显著(p>0.05)。

表2仔猪结肠组织的氧化还原状态

注：同行数据肩注不同字母表示差异显著(p<0.05)，无字母或字母相同表示差异不显著(p>0.05)。

表3仔猪盲肠组织的氧化还原状态

注：同行数据肩注不同字母表示差异显著(p<0.05)，无字母或字母相同表示差异不显著(p>0.05)。

表4仔猪回肠氧化还原状态与肠道菌群组成的相关性

注：主要微生物与氧化还原指标的相关性：*p<0.05，**p<0.01。

表5仔猪结肠氧化还原状态与肠道菌群组成的相关性

注：主要微生物与氧化还原指标的相关性：*p<0.05，**p<0.01。

表6仔猪盲肠氧化还原状态与肠道菌群组成的相关性

注：主要微生物与氧化还原指标的相关性：*p<0.05，**p<0.01。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。