一种肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球的制备方法与流程

1.本发明涉及谷胱甘肽纳米微球制备技术领域，具体涉及一种肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球的制备方法。


背景技术：

2.纳米微球是一种以生物相容性或可生物降解的聚合物基质作为壁材，将固体、液体或气体等芯材包埋在壁材内得到的新材料。纳米微球粒径小，比表面积大，溶解度高，生物活性高，生物相容性较好，比传统的包埋具有更好的缓释效果和靶向性能，大大提高了功效成分的稳定性和生物利用率。纳米微球应用在食品、医药领域中，可显著提高热敏性或易氧化等功能性成分在加工过程中的生物活性，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向功效成分输送和基因治疗，从而增强这些功能性成分的保健和治疗功能。
3.谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸与甘氨酸组成的天然活性肽，在临床上主要用于美白排毒抗衰老、治愈肿瘤、护肝排毒、解除氧中毒和改善内分泌紊乱等。谷胱甘肽有还原型谷胱甘肽(gsh)和氧化型谷胱甘肽(gssg)两种存在形式，而只有gsh才具有生物活性，因为gsh中的半胱氨酸侧链基团上的巯基可以保护重要的酶蛋白不被氧化，从而保证酶的生理活性。但是gsh的巯基在水溶液和空气中稳定性较差，极易被氧化，成为gssh，进而失去其生理活性。另外，gsh作为一种具有极强美白排毒抗衰老功能的活性因子，主要在人体的小肠中吸收完全，而在胃部的消化过程中容易失活，且不易透过细胞膜，生物利用率低。
4.中国专利cn104338112a公开了一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法，将纳米微球技术和谷胱甘肽结合起来，玉米淀粉糊化处理后通过普鲁兰酶转化为短直链淀粉，然后包覆谷胱甘肽制备谷胱甘肽纳米缓释胶囊。所制备的纳米谷胱甘肽胶囊在肠中较胃部更容易吸收，这为谷胱甘肽的应用提供了一种新的思路。但是所制备的纳米胶囊中谷胱甘肽的包覆率为50.5％，包埋率有待提升，同时所得缓释胶囊的粒径比较大。因此，人们迫切需要一种肠道缓释型且既不影响gsh活性又能提高其功效性的包埋技术，以实现其在功能性食品、医药中的应用及提高功效性。


技术实现要素：

5.为提高谷胱甘肽的包埋率，本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，以提升制备的谷胱甘肽纳米微球中谷胱甘肽gsh的包埋率，而且制备的谷胱甘肽纳米微球相较其它包埋处理的gsh具有更高的生物活性。
6.本发明提供如下的技术方案：一种肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球的制备方法，以蛋白为包埋壁材，包括以下步骤：(1)向包埋蛋白的溶液中加入谷胱甘肽gsh，混合均匀得到混合液；(2)将混合液经静电喷雾设备喷出，并接收得到肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米
微球；所述包埋蛋白的溶液为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白或椰肉醇溶蛋白的乙醇水溶液；包埋蛋白的质量浓度≥14％。
7.本发明中所用的包埋蛋白如玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白或者椰肉醇溶蛋白等与糊化淀粉不同，具有两亲性，能够在醇水溶液或水溶液中自主形成微球、纳米粒结构，实现对谷胱甘肽的包覆，包覆率高。同时谷胱甘肽纳米微球制备中选用静电喷雾方法，制备的高分子微粒的粒径及形态可控，这样与包埋蛋白所具有的形成微球、纳米粒结构的趋势相结合，使制备的纳米微球的gsh包埋率高，粒径分布范围窄，粒径小，同时gsh的生物活性得到保持，gsh纳米微球的整体生物活性，如还原能力、清除自由基的能力等相对gsh得到提升，缓释效果好，在肠中的释放效果优于在胃中的释放效果。
8.作为本发明方法的优选，步骤(1)中所述乙醇水溶液中的乙醇体积浓度为75％～85％。醇溶蛋白在此范围内的溶解性好。
9.作为本发明方法的优选，步骤(1)中所述包埋蛋白的溶液为椰肉醇溶蛋白的乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为14～32％。椰肉醇溶蛋白成本低，具有抗氧化性，可生物降解，延展性强，且无转基因的风险，目前关于它的开发研究还很少，也没有作为纳米微球的载体被研究。发明人首次将椰肉醇溶蛋白作为壁材应用在gsh的包埋上，所制备的纳米微球中gsh的包埋率明显的高于其他蛋白。
10.作为本发明方法的优选，所述椰肉醇溶蛋白经以下过程制备得到：将脱脂椰肉粉分散于体积分数95％及以上的乙醇中，固液比控制为1:14～20，50～60℃水浴30～60min，调节ph值至8.0～10，加水稀释至乙醇体积分数50％～70％，萃取30～60min，离心分离取上清液、盐析、静置后离心分离沉淀，水洗至中性，干燥得到椰肉醇溶蛋白。
11.作为本发明方法的优选，步骤(1)中所用gsh与包埋蛋白的溶液或分散液的质量比为1:400～450。
12.作为本发明方法的优选，gsh以磷酸缓冲液溶液的形式使用，磷酸缓冲溶液的ph为5.5～6.5，gsh的摩尔浓度为0.04～0.1mol/l。磷酸缓冲溶液提高了混合液体系制备时的稳定性性，所获得的纳米微球的贮藏稳定性得到提升。
13.作为本发明方法的优选，步骤(1)还包括加入gsh前向包埋蛋白的溶液中添加小麦醇溶蛋白，加入gsh混合均匀后再加入小麦谷蛋白。发明人在使用椰肉醇溶蛋白作为包埋蛋白的进一步研究中，将小麦醇溶蛋白与小麦谷蛋白结合到步骤(1)中使用，小麦醇溶蛋白为单链结构，以非共价键作用力与谷蛋白中的二硫键聚集形成三维网络结构穿插在椰肉醇溶蛋白的微球结构中，可以提升纳米微球的存放稳定性，gsh的损耗速率变慢。由于小麦醇溶蛋白和小麦谷蛋白是面筋蛋白以及小麦谷朊粉的主要成分，因此发明人在研究中也尝试直接以面筋蛋白和小麦谷朊粉替代小麦醇溶蛋白和小麦谷蛋白的组合使用。当直接使用面筋蛋白或小麦谷朊粉时，混合液的粘度增大导致喷雾困难，所制备的小球的粒径变大，球形结构出现缺陷，gsh的包封率和存放稳定性都出现一定程度的下降，其中谷朊粉的下降更为明显，发明人认为原因一是跟小麦醇溶蛋白和小麦谷蛋白的用量有关，二是这样会使小麦谷蛋白和小麦醇溶蛋白作为一个整体出现，两者间的相互作用发生快，降低了椰肉醇溶蛋白参与的可能性；三是小麦谷朊粉中还包括清蛋白等成分，影响了纳米微球的稳定性。
14.作为本发明方法的优选，包埋蛋白与小麦醇溶蛋白、小麦谷蛋白的质量比为1:0.1
～0.2:0.01～0.03。小麦谷蛋白的含量过高而与小麦醇溶蛋白配合后体系粘性增大，达不到预期的效果。同时谷胱甘肽纳米微球更期望在肠道中释放、吸收，而小麦谷蛋白在肠道中的分解、消化性能不佳，影响gsh的释放，小麦谷蛋白的累积过量还可能引起过敏反应，所以需要控制合理的用量。
15.作为本发明方法的优选，所述步骤(1)还包括将制备的混合液在2～3mpa下均质30～60min。通过低压均质处理促进混合液体系的均一性，有利于提升制备的微球的稳定性。
16.作为本发明方法的游侠，步骤(2)中静电喷雾的条件为：聚合物溶液流速为15～25μl/min；电压为10～20kv；接收距离为10～20cm。发明人在研究中发现，混合溶液流速、电压以及接收距离均影响到制备的纳米微球中gsh的包埋效果。
17.本发明的有益效果如下：本发明方法制备的谷胱甘肽纳米微球中，gsh的包覆率高，释放后的gsh的生物活性可以正常发挥；纳米微球的抗氧化能力相对gsh增强；gsh在存放过程中的稳定性高、损耗低，同时纳米微球的粒径分布范围窄，粒径小，分散性好，而且gsh的缓释效果好，同时在肠道中具有更高的释放效率，在功能性食品、特殊医学用途配方食品、特殊膳食用食品等领域具有很好的应用前景。
附图说明
18.图1是本发明制备的谷胱甘肽纳米微球的sem表征图谱。
19.图2是本发明制备的谷胱甘肽纳米微球的粒径分布图。
20.图3是本发明制备的谷胱甘肽纳米微球的电位分布图。
21.图4是本发明制备的谷胱甘肽纳米微球模拟肠道中的释放曲线。
22.图5是本发明制备的谷胱甘肽纳米微球模拟胃部的释放曲线。
23.图6是不同的制备工艺所获得的谷胱甘肽纳米微球对dpph的清除效果。
24.图7是不同的制备工艺所获得的谷胱甘肽纳米微球对超氧阴离子o
2-·
的清除效果。
25.图8是不同的制备工艺所获得的谷胱甘肽纳米微球对
·
oh的清除效果。
26.图9是不同的制备工艺所获得的谷胱甘肽纳米微球的总还原能力效果。
具体实施方式
27.下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
28.如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
29.实施例1一种肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球的制备方法，包括以下步骤：(1)将椰肉醇溶蛋白均匀溶解在80％(v/v)乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为26％，然后向其中加入0.05mol/l的gsh的磷酸缓冲溶液(ph＝6)，gsh与椰肉醇溶蛋白/乙醇水溶液的质量比为1:425，继续搅拌直至混合均匀，以确保聚合物完全水合得到混合液；
(2)将步骤(1)获得的混合溶液吸入10ml注射泵中，设定电压15kv，推进速率20μl/min，启动静电喷雾设备喷射，在15cm收集距离处进行收集得到肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球，收集好的样品放置于装有干燥剂的密封袋中储藏备用；所用椰肉醇溶蛋白制备过程如下：将脱脂椰肉粉过80目筛，然后分散于体积分数95％的乙醇中，固液比控制为1:15，55℃水浴40min，调节ph值至9.0，然后加水稀释至乙醇体积分数60％，萃取40min，4 000r/min离心分离取上清液、用质量分数1％氯化钠1:1盐析，静置12h后，然后离心分离沉淀得到湿cg，反复水洗至中性，40℃条件下进行热风干燥4h得到椰肉醇溶蛋白。
30.实施例2一种肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球的制备方法，包括以下步骤：(1)将椰肉醇溶蛋白均匀溶解在75％(v/v)乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为14％，然后向其中加入0.04mol/l的gsh的磷酸缓冲溶液(ph5.5)，gsh与椰肉醇溶蛋白/乙醇水溶液的质量比为1:400，继续搅拌直至混合均匀，以确保聚合物完全水合得到混合液；(2)将步骤(1)获得的混合溶液吸入10ml注射泵中，设定电压10kv，推进速率15μl/min，启动静电喷雾设备喷射，在10cm收集距离处进行收集得到肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球，收集好的样品放置于装有干燥剂的密封袋中储藏备用；所用椰肉醇溶蛋白制备过程如下：将脱脂椰肉粉过80目筛，然后分散于体积分数95％的乙醇中，固液比控制为1:14，50℃水浴60min，调节ph值至10，然后加水稀释至乙醇体积分数50％，萃取60min，4000r/min离心分离取上清液、用质量分数1％氯化钠1:1盐析，静置12h后，然后离心分离沉淀得到湿cg，反复水洗至中性，40℃条件下进行热风干燥4h得到椰肉醇溶蛋白。
31.实施例3一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，包括以下步骤：(1)将椰肉醇溶蛋白均匀溶解在85％(v/v)乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为32％，然后向其中加入0.1mol/l的gsh的磷酸缓冲溶液(ph6.5)，gsh与椰肉醇溶蛋白/乙醇水溶液的质量比为1:450继续搅拌直至混合均匀，以确保聚合物完全水合得到混合液；(2)将步骤(1)获得的混合溶液吸入10ml注射泵中，设定电压20kv，推进速率20μl/min，启动静电喷雾设备喷射，在20cm收集距离处进行收集得到肠溶缓释型高活性谷胱甘肽纳米微球，收集好的样品放置于装有干燥剂的密封袋中储藏备用；所用椰肉醇溶蛋白制备过程如下：将脱脂椰肉粉过60目筛，然后分散于体积分数96％的乙醇中，固液比控制为1:20，60℃水浴30min，调节ph值至8.0，然后加水稀释至乙醇体积分数70％，萃取30min，4000r/min离心分离取上清液、用质量分数1％氯化钠1:1盐析，静置12h后，然后离心分离沉淀得到湿cg，反复水洗至中性，40℃条件下进行热风干燥4h得到椰肉醇溶蛋白。
32.实施例4一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例1的不同之处为，步骤(1)中将gsh直接添加到椰肉醇溶蛋白/乙醇水溶液中。
33.实施例5一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例1的不同之处为，以玉米醇溶蛋白替
换椰肉醇溶蛋白。
34.实施例6一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例1的不同之处为，以小麦醇溶蛋白替换椰肉醇溶蛋白。
35.实施例7一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例1的不同之处为，步骤(1)的混合液的制备过程如下：将椰肉醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白均匀溶解在80％(v/v)乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为26％，然后向其中加入0.05mol/l的gsh的磷酸缓冲溶液(ph＝6)，继续搅拌直至混合均匀，然后加入小麦谷蛋白继续搅拌均匀得到混合液，gsh与椰肉醇溶蛋白/乙醇水溶液的质量比为1:425，椰肉醇溶蛋白与小麦醇溶蛋白、小麦谷蛋白的质量比为1:0.1:0.01。
36.实施例8一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例1的不同之处为，步骤(1)的混合液的制备过程如下：将椰肉醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白均匀溶解在80％(v/v)乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为26％，然后向其中加入0.05mol/l的gsh的磷酸缓冲溶液(ph＝6)，继续搅拌直至混合均匀，然后加入小麦谷蛋白继续搅拌均匀得到混合液，gsh与椰肉醇溶蛋白/乙醇水溶液的质量比为1:425，椰肉醇溶蛋白与小麦醇溶蛋白、小麦谷蛋白的质量比为1:0.2:0.03。
37.实施例9一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例7的不同之处为，将得到的混合液在2mpa下均质60min。
38.实施例10一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例7的不同之处为，将得到的混合液在3mpa下均质30min。
39.实施例11一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例7的不同之处为，步骤(1)中以玉米醇溶蛋白替代小麦醇溶蛋白，并省略小麦谷蛋白的添加。
40.实施例12一种谷胱甘肽纳米微球的制备方法，与实施例7的不同之处为，步骤(1)中省略小麦谷蛋白的添加。
41.对比例1与实施例7的不同之处为，步骤(1)中小麦醇溶蛋白与小麦谷蛋白在乙醇水溶液中混合均匀后再添加到椰肉醇溶蛋白的乙醇水溶液中。
42.对比例2与实施例7的不同之处为，步骤(1)中小麦醇溶蛋白与小麦谷蛋白的质量比为1:1。
43.对比例3谷胱甘肽纳米微球的制备方法与实施例7的不同之处为，步骤(1)中：将椰肉醇溶蛋白和小麦面筋蛋白均匀溶解、分散在80％(v/v)乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为26％，然后向其中加入0.05mol/l的gsh的磷酸缓冲溶液(ph＝6)，继续搅拌直至混合均匀，
椰肉醇溶蛋白与面筋蛋白的质量比为1:0.2。
44.对比例4谷胱甘肽纳米微球的制备方法与实施例7的不同之处为，步骤(1)中：将椰肉醇溶蛋白和小麦谷朊粉均匀溶解、分散在80％(v/v)乙醇水溶液，椰肉醇溶蛋白的质量浓度为26％，然后向其中加入0.05mol/l的gsh的磷酸缓冲溶液(ph＝6)，继续搅拌直至混合均匀，椰肉醇溶蛋白与面筋蛋白的质量比为1:0.3。
45.各微球的性能测试1、本发明方法制备的纳米微球的形貌和粒径分布将实施例1制备的谷胱甘肽纳米微球进行sem电镜扫描和荧光粒度测定，结果如图1～3所示。从图1中可以看出，谷胱甘肽纳米微球形状良好，表面光滑，谷胱甘肽纳米微球均呈现单分散状态。从图2中可以看出，谷胱甘肽纳米微球的平均粒径为100nm左右，谷胱甘肽纳米微球分散性较好且粒径分布较窄。从图3可以看出，谷胱甘肽纳米微球的zeta电位平均值为-47.7mv，表面展现出负电荷，能避免进一步的聚集，单分散稳定性较好。
46.2、谷胱甘肽纳米微球在体外模拟消化过程中的稳定性测试功能食品或药物输送体系被人体摄入后主要经过口腔、胃，再到小肠吸收后进入人体的血液循环中。对于理想的功能食品或药物输送体系，应能够在胃部强酸环境下保持相对稳定，而进入肠道环境后能充分释放出功能因子，以提高功能因子生物利用度。参考dupont等(comparative resistance of food proteins to adult and infant in vitro digestion models)的方法制备模拟胃液(sgf)和模拟肠液(sif)的消化原液。
47.2.1模拟胃液(sgf)：将7ml浓盐酸溶液溶解于20％(m/m)氯化钠水溶液中去，搅拌均匀后，用0.1mol/l盐酸溶液调节ph至1.2后定容至1l容量瓶中，再制备质量浓度为3.2mg/ml的胃蛋白酶溶液，制备完成后于4℃条件下储藏备用，其中胃蛋白酶在消化实验开始时加入。
48.2.2模拟肠液(sif)：量取浓度0.1mol/l的氢氧化钠溶液190ml，再取6.8g磷酸氢二钾的水溶液，将两者混合均匀后用0.01mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.4后定容到1l。再准备质量浓度为3.2mg/ml的胰蛋白酶溶液和质量浓度为0.2mg/ml的胆汁溶液备用，以上制备完成的溶液均于4℃条件下贮藏。其中胰酶和胆汁在消化实验开始时加入。
49.2.3体外模拟胃、肠单独消化：取实施例1制备的谷胱甘肽纳米微球300mg分别与5ml sgf和10mlsif溶液混合均匀，并分别用6mol/l hcl调ph至2和用1mol/l naoh调ph至7，混合物在37℃恒温水浴振荡以100r/min摇床中孵育以模拟消化反应。每隔一定消化时间取样分析，取样时间为：0、10、20、30、60、120、240min时测定样品中gsh的含量，并根据下式计算释放率，每个样品平行测定三次，求平均值：释放率(％)＝(z-y)/z
×
100；式中：z为消化前测定游离gsh含量，单位为毫克(mg)；y为消化液中测定的游离gsh含量，单位为毫克(mg)。
50.其中肠模拟消化结果如图4所示，胃模拟消化结果如图5所示。结果表明，谷胱甘肽纳米微球可以在肠和胃中缓慢释放gsh，其中在肠液中的释放速率大于胃液中的释放速率，具有良好的肠吸收性。
51.3、不同的制备工艺制备的纳米微球的生物活性
在混合液组成不变的情况下，测试实施例1制备的纳米微球和通过喷雾干燥法、溶剂法制备的纳米微球对1,1-二苯基-2-苦味基肼自由基(dpph)、超氧阴离子(o
2-·
)、羟基自由基(oh
·
)的清除能力以及总还原能力。
52.3.1dpph清除率测定：分别将未包埋的gsh以及静电喷雾法、喷雾干燥法、溶剂法制备的纳米微球配制成1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mg/ml的作为样品溶液，分别取上述溶液各2.0ml，并加入2.0ml 0.2mmol dpph溶液(95％乙醇配制)，室温放置30min，以95％乙醇调零，紫外可见分光光度计测定其吸光度(am)；同法分别在517nm处测定2.0ml样品溶液与2.0mldpph溶液的吸光度(an)以及2.0mldpph溶液与2.0m乙醇混合液的吸光度(a0)。按下式计算dpph
·
清除率：dpph清除率％＝(a
m-an)/a0×
100；式中：an为样品组的吸光度值(2.0ml样品溶液与2.0ml乙醇溶液)；am为对照组的吸光度值(2.0ml 0.5mol/l dpph溶液和2.0ml样品溶液)；a0为空白组的吸光度值(2.0mldpph溶液与2.0ml乙醇溶液)。
53.不同gsh包埋工艺对dpph清除率结果见图6，在试验范围内，不同包埋工艺对dpph-清除率在一定范围内都随着浓度增加而增加，并存在一定的剂量效应。与其他包埋工艺相比，静电喷雾工艺对dpph清除率在不同浓度条件下均高出很多。与未经包埋的gsh相比，静电喷雾制成的谷胱甘肽纳米微球对dpph清除率要更高。
54.3.2o
2-·
清除率测定：采用邻苯三酚法，分别将未包埋的gsh以及静电喷雾法、喷雾干燥法、溶剂法制备的纳米微球配制成2.00、3.00、4.00、5.00、6.00mg/ml的作为样品溶液。取6ml0.05 mol/l tris-hcl缓冲液(ph 8.2)，分别加入上述溶液0.5ml，37℃水浴10min，加入经37℃预热的7mmol/l此邻苯三酚盐酸溶液1ml，混匀，37℃反应4min，用0.5ml浓盐酸终止反应。在325nm处测定其吸光度值a1。以等体积ph 8.2％tris-hcl缓冲液作为空白，测定其吸光度值a0。按下式计算o
2-·
清除率：o
2-·
清除率％＝(a
0-a1)/a0×
100；式中：a1为样品组的吸光度值；a0为对照组的吸光度值。
55.不同gsh包埋工艺对o
2-·
清除率结果见图7所示，在试验范围内，不同包埋工艺对o
2-·
清除率在一定范围内都随着浓度增加而增加，并存在一定的剂量效应。与其他包埋工艺相比，静电喷雾工艺对o
2-·
清除率在不同浓度条件下均高出很多。另外，与未将包埋的gsh相比，静电喷雾制成的谷胱甘肽纳米微球对o
2-·
清除率要更高，说明壁材椰肉醇溶蛋白不仅对gsh进行了包埋，还增强了谷胱甘肽纳米微球对o
2-·
的清除能力，体现了谷胱甘肽纳米微球对o
2-·
较强的清除能力和以椰肉醇溶蛋白为壁材进行静电包埋的优势。
56.3.3羟基自由基oh
·
清除率测定采用邻二氮菲-fe
2+
氧化法，分别将未包埋的gsh以及静电喷雾法、喷雾干燥法、溶剂法制备的谷胱甘肽纳米微球配制成2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg/ml的作为样品溶液。量取1.5ml 5mmol/l邻二氮菲溶液，依次加入0.5mol/l磷酸盐缓冲液(ph 7.4)4.0ml、7mmol/l feso4溶液1.0ml、样品溶液1.0ml和0.1％h2o
2 1.0ml，加去离子水补充体积至10.0ml，37℃水浴90min，分别测定其在510nm处吸光度(am)。以样品及h2o2均用去离子代替，同法处理测得吸光度(an)，以h2o2溶液用去离子水代替作为空白对照，同法处理测得吸光度(a0)。按下式计算羟自由基(
·
oh)清除率：
·
oh清除率％＝(a
m-a0)/(a
n-a0)
×
100；式中：am为加入样品(抗氧化剂)及h2o2的吸光度值；a0以纯水代替样品及h2o2的吸光度值；an为样品及h2o2均用纯水代替的吸光度值。
57.不同gsh包埋工艺对oh
·
清除率结果见图8所示，在试验范围内，不同包埋工艺对oh
·
清除率在一定范围内都随着浓度增加而增加，并存在一定的剂量效应。与其他包埋工艺相比，静电喷雾工艺对oh
·
清除率在不同浓度条件下均高出很多。另外，与未将包埋的gsh相比，静电喷雾制成的谷胱甘肽纳米微球对oh
·
清除率要更高，说明壁材椰肉醇溶蛋白不仅对gsh进行了包埋，还增强了谷胱甘肽纳米微球对oh
·
的清除能力，体现了谷胱甘肽纳米微球对oh
·
较强的清除能力和以椰肉醇溶蛋白为壁材进行静电包埋的优势。
58.3.4gsh还原能力的测定分别将未包埋的gsh以及静电喷雾法、喷雾干燥法、溶剂法制备的纳米微球配制成2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg/ml的作为样品溶液。从中取1.0ml，加入lwt％铁氰化钾溶液2.5ml和2.5ml 0.2mol/l磷酸盐缓冲液(ph 6.6)，混合均匀，置于50℃水浴中反应30min，迅速冷却，加10％三氯乙酸2.5ml，4000r/min离心10min。取上清液2.5ml，加蒸馏水2.5ml和0.1wt％三氯化铁溶液2.5ml，混匀后静置10min，分别测定样品在700nm处的吸光值。
59.不同gsh包埋工艺对gsh还原能力的结果见图9所示，在试验范围内，不同包埋工艺对gsh还原能力的影响在一定范围内都随着浓度增加而增加，并存在一定的剂量效应。与其他包埋工艺相比，静电喷雾工艺对gsh还原能力在不同浓度条件下均高出很多。另外，与未经包埋的gsh相比，静电喷雾制成的谷胱甘肽纳米微球还原能力要更高，说明壁材椰肉醇溶蛋白不仅对gsh进行了包埋，还增强了谷胱甘肽纳米微球还原能力，体现了谷胱甘肽纳米微球较强的还原能力和以椰肉醇溶蛋白为壁材进行静电包埋的优势。
60.4各纳米微球的包埋率和存放稳定性4.1谷胱甘肽纳米微球的储藏稳定性测试将各实施例和对比例制备得到谷胱甘肽纳米微球在25℃和45℃条件下分别在第0天、30天、60天、90天、120天进行包埋率测试。已有文献研究表明未经包埋的gsh不稳定，易氧化后变成gssg，故测试以gsh含量为指标，将gsh从谷胱甘肽纳米微球中分离，测定游离的gsh量，然后根据下式计算：gsh包埋率：ee＝(1—cf/c
t
)
×
100％；式中ee：gsh包埋率；cf：游离gsh含量；c
t
：gsh总含量。
61.4.2本实施所得的gsh纳米微球贮藏稳定性如表1所示。
62.表1各纳米微球的包埋效果和贮藏稳定性
从上述结果可知，本发明方法至别的gsh纳米微球的包埋率高，在25℃低温和45℃低温存放一段时间后的gsh纳米微球的包埋率没有发生大幅度的变化，gsh纳米微球的存放稳定性较好，其中椰肉醇溶蛋白的效果最好。将玉米醇溶蛋白或小麦醇溶蛋白和椰肉醇溶蛋白复配使用后的结果低于椰肉醇溶蛋白的单独使用，说明两者不能起到协同增强作用。而将小麦醇溶蛋白与小麦谷蛋白引入到椰肉醇溶蛋白的纳米微球中，gsh的包埋率没有明显的提升，这可能是椰肉醇溶蛋白的包覆效果已经很好，提升空间有限，但是存放稳定性有提升。但是将小麦醇溶蛋白与小麦谷蛋白先混合后添加，或者明显提升小麦谷蛋白的用量，不论包埋效果还是稳定性均有下降。同时以谷朊粉或面筋蛋白替代，稳定性是下降的，这可能与制备的微球的球形结构受到影响有关。同时发明人在对实施例7、8制备的纳米微球的肠溶效果测试中确认，其在肠内的gsh释放效果与实施例1的纳米微球相近，未发生明显的下降，这应该是由于影响贮藏稳定性的因素和使纳米微球在肠道释放的因素不同所致。