双特异性HER2抗体的制作方法

背景本发明提供特异性结合至HER2的组合物以及用于使用此类组合物来治疗癌症的方法。受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介导物。受体家族包括四个不同成员，这四个不同成员包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)以及HER4(ErbB4或tyro2)。HER2最初被鉴定为来自化学治疗的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。在乳癌和卵巢癌中观察到人同源物扩增并且与较差预后相关。还在其他癌瘤中观察到HER2的过表达(由于基因扩增而频繁地但非一致地)，这些癌瘤包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌以及膀胱癌。HER2还可以在前列腺癌中过表达。HER受体通常以不同组合存在于细胞中，并且异源二聚化被认为使对各种HER配体的细胞反应的多样性增加(厄普(Earp)等人，乳癌研究和治疗(BreastCancerResearchandTreatment)35：115-132(1995))。虽然EGF和TGFα不结合HER2，但EGF刺激EGFR和HER2以形成异源二聚体，该异源二聚体活化EGFR并且引起HER2在该异源二聚体中的转磷酸化。二聚化和/或转磷酸化看起来似乎活化HER2酪氨酸激酶。参见厄普等人，同上。同样，当HER3与HER2共表达时，形成活性信号传导复合体并且针对HER2的抗体能够破坏这种复合体(希利科沃夫斯基(Sliwkowski)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，269：14661-14665(1994))。在本领域中描述了靶向HER2的众多抗体(参见，例如布雷克(Hudziak)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)9：1165-1172(1989)；美国专利号5,677,171；芬迪丽(Fendly)等人，癌症研究(CancerResearch)50：1550-1558(1990)；可斯(Kotts)等人，体外(Invitro)26(3)：59A(1990)；厄普等人，生长调节(GrowthRegulation)1：72-82(1991)；谢泼德(Shepard)等人，临床免疫学杂志(J.Clin.Immunol.)11：117-127(1991)；库玛(Kumar)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)1：979-986(1991)；路易斯(Lewis)等人，癌症免疫现状(CancerImmunol.Immunother.)37：255-263(1993)；彼得拉斯(Pietras)等人，致癌基因(Oncogene)9：1829-1838(1994)；维提塔(Vitetta)等人，癌症研究54：5301-5309(1994)；希利科沃夫斯基等人，生物化学杂志269(20)：14661-14665(1994)；斯科德(Scott)等人，生物化学杂志266：14300-5(1991)；迪苏沙(D＇souza)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)91：7202-7206(1994)；路易斯等人，癌症研究56：1457-1465(1996)；以及沙佛(Schaefer)等人，致癌基因15：1385-1394(1997)。具有不同特性的其他HER2抗体描述于塔利亚布埃(Tagliabue)等人，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)47：933-937(1991)；麦肯齐盖尔(McKenzie)等人，致癌基因4：543-548(1989)；梅尔(Maier)等人，癌症研究(CancerRes.)51：5361-5369(1991)；贝卡斯(Bacus)等人，分子癌变(MolecularCarcinogenesis)3：350-362(1990)；斯坦克斯克(Stancovski)等人，PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；贝卡斯等人，癌症研究52：2580-2589(1992)；徐等人，国际癌症杂志53：401-408(1993)；WO94/00136；卡斯普尔泽克等人，癌症研究52：2771-2776(1992)；汉考克(Hancock)等人，癌症研究51：4575-4580(1991)；沙文(Shawver)等人，癌症研究54：1367-1373(1994)；阿特阿加(Arteaga)等人，癌症研究54：3758-3765(1994)；哈韦特(Harwerth)等人，生物化学杂志267：15160-15167(1992)；美国专利号5,783,186；以及克拉帕(Klapper)等人，致癌基因14：2099-2109(1997)中。曲妥珠单抗(参见美国专利号5,821,337)(鼠HER2抗体4D5的重组人源化形式)在患有HER2过表达转移性乳癌的患者中是临床活性的，这些患者以往接受过广泛的抗癌疗法(巴塞尔加(Baselga)等人，临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)14：737-744(1996))。为了靶向HER信号传导途径，帕妥珠单抗(PerjetaTM；参见专利公开WO2001/00245)被开发为抑制HER2与其他HER受体二聚化的鼠抗体2C4的人源化形式，从而抑制配体驱动的磷酸化和活化，以及RAS和AKT途径的下游活化。Ado-曲妥珠单抗emtansine(T-DM1；)是批准用于对曲妥珠单抗有抗性的患有HER2过表达转移性乳癌的患者、连接至细胞毒性剂美登素上的曲妥珠单抗的抗体药物轭合物。虽然，充分证实了曲妥珠单抗在乳癌中的治疗功效，但它被严格限制并且仅批准用于30％的肿瘤过表达HER2的乳癌患者。70％的乳癌患者不能或不充分地响应于曲妥珠单抗，因为他们单独的肿瘤不能过表达或不能充分地表达HER2。在其他癌症和/或单独的癌症中，HER2以43％至69％范围内的很大比例情况下过表达，然而，通常，在大多数肿瘤中HER2表达水平是基本上低的。此外，HER2受体的过表达经常由编码基因扩增而引起(海因斯(Hynes)等人，自然评论：癌症(NatRevCancer)5：341(2005))。因此，目前的共识是：抗HER2单克隆抗体疗法在具有低HER2表达或缺失过表达的肿瘤中是效率低下的。此外，对这些抗HER2抗体的抗性是重大问题。鉴于在表达低水平HER2和对当前疗法有抗性的特定癌症中缺乏有效的抗HER2疗法，存在对能够有效地结合至表达更高范围水平HER2的癌症细胞并且抑制这些癌症细胞生长的改进抗体的需要，这些能力通过例如以下各项来实现：(i)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或(ii)由于作为抗体药物轭合物(ADC)的轭合至抗体上的有效负载引起的细胞毒性作用和/或(iii)抑制介导信号传导的受体(例如通过抑制受体二聚化和/或介导受体内化)。因此，本披露的目的是提供有效抑制HER2介导的细胞信号传导的改进免疫治疗剂，这些改进免疫治疗剂可用于治疗HER2表达癌症，包括其中HER2不以高水平表达的癌症。概述本披露提供包含免疫球蛋白重链(VH)和免疫球蛋白轻链(VL)的抗HER2结合分子，其中该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸序列。还提供包含VH和VL的抗HER2结合分子，其中该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸序列。在一些方面中，该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸序列并且该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸序列。在一些方面中，该抗HER2结合分子包括抗体或其抗原结合片段。本披露还提供包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域的双特异性抗HER2抗体，其中(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2抗体结合位点，(ii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第一HER2抗体结合位点，该第一HER2抗体结合位点包含HER2的结构域II内的表位，并且(iii)该第一HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点不同。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第二HER2抗体结合位点，该第二HER2抗体结合位点包含HER2的结构域IV内的表位。在一些方面中，该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER2抗体结合位点相同。在一些方面中，该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER2抗体结合位点部分重叠。在其他方面中，该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER抗体结合位点不同。本披露还提供包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域在包含SEQIDNO：52中的一个或多个氨基酸残基的表位上结合HER2。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域在包含SEQIDNO：52中的一个或多个氨基酸残基的表位上结合HER2，并且该第二免疫球蛋白抗原结合结构域在结构域IV内的表位上特异性结合HER2。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域在包含SEQIDNO：53中的一个或多个氨基酸残基的表位上结合HER2。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区和该轻链可变区包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)序列；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)序列；(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)序列；(iv)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)序列；(v)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)序列；以及，(vi)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)序列。在某些方面中，相对于包含VH(包含SEQIDNO：43的氨基酸序列)和VL(包含SEQIDNO：44的氨基酸序列)的免疫球蛋白抗原结合结构域，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含至少一个异源可变结构域构架区(FW)。在某些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段。在某些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该至少一个异源FW区包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域进一步包含(i)包含SEQIDNO：11的可变轻链构架1(VL-FW1)氨基酸序列；(ii)包含SEQIDNO：12的VH-FW2氨基酸序列；(iii)包含SEQIDNO：13的VH-FW3氨基酸序列；(iv)包含SEQIDNO：14的VH-FW4氨基酸序列；或(vi)其任何组合。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH氨基酸序列包含SEQIDNO：15；其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域或该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VL氨基酸序列包含SEQIDNO：16；其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域或该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含VH和VL，其中该VH氨基酸序列包含SEQIDNO：15；并且其中该VL氨基酸序列包含SEQIDNO：16，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域或该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，在此披露的该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含以下各项或由其组成：(a)VH和VL，该VH进一步包括重链恒定区或其片段并且该VL包含轻链恒定区或其片段；(b)单链Fv(“scFv”)；(c)双体抗体；(d)小抗体；(e)F(ab’)2；或(f)F(ab)。在相同的方面中，该重链恒定区或其片段是IgG恒定区。在一些方面中，该IgG恒定区或其片段是IgG1恒定区。在一些方面中，该LC恒定区是κ恒定区。在一些方面中，该LC恒定区是λ恒定区。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是单克隆抗体。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是人源化抗体。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是人抗体。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是嵌合抗体。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是亲和力优化的抗体。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗竞争表位结合。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同的非重叠HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中(a)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至与曲妥珠单抗抗体相同的HER2的结构域IV中的表位；(b)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域通过曲妥珠单抗抗体竞争性地抑制HER2结合；和/或(c)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个互补决定区(CDR)，这些互补决定区具有选自下组的氨基酸，该组由SEQIDNO：54至59组成。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv，该scFv包含：(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：57的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：58的氨基酸的VL-CDR2；以及(vi)包含SEQIDNO：59的氨基酸的VL-CDR3。在一些方面中，该scFv是二硫化物稳定的scFv。在一些方面中，该scFv包含VH和VL，该VH包含SEQIDNO：17的氨基酸并且该VL包含SEQIDNO：18的氨基酸。在一些方面中，该scFv的该VH和该VL通过肽接头共价连接。在一些方面中，该肽接头包含SEQIDNO：19的氨基酸序列。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的羧基末端上。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的羧基末端之间的接头。在其他方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的氨基末端上。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的氨基末端之间的接头。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价嵌入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的多肽链中。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价嵌入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的CH1区与CH2区之间。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含插入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的CH1区与该第二免疫球蛋白抗原结合结构域之间的接头，以及插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的CH2区之间的第二接头。在一些方面中，该第一接头和该第二接头是相同的。在其他方面中，该第一接头和该第二接头是不同的。在一些方面中，这些接头中的一个或多个包括肽接头。在一些方面中，该肽接头包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少20个、或至少30个氨基酸。在其他方面中，该肽接头包括具有化学式Serx[(Gly)y-Ser4]z的肽，其中x是从0至1，y是从1至4，并且z是从1至10。在一些方面中，该肽接头包含SEQIDNO：19、20、21或22。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含可包括Fc结构域的重链，该Fc结构域包含CH2和CH3区。在一些方面中，该Fc结构域是IgG1Fc结构域。在其他方面中，该IgG1Fc结构域是天然IgG1Fc结构域。在一些方面中，该天然IgG1Fc结构域包含SEQIDNO：23的氨基酸序列。在一些方面中，该Fc结构域是突变IgG1Fc结构域。在其他方面中，该突变IgG1Fc结构域包含能够降低该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变。在一些方面中，能够降低该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变是氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代包括L234F、S239A、S239C、或其任何组合。在一些方面中，该突变IgG1Fc结构域包含引入可衍生基团的至少一个氨基酸取代。在一些方面中，该可衍生基团是氢硫基基团。在一些方面中，该至少一个氨基酸取代包括S239C、248C、254C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、440C、441C、S442C、443C以及446C、或其任何组合。在一些方面中，该突变Fc结构域包含SEQIDNO：24或SEQIDNO：25的氨基酸。还提供包含彼此相关联的第一多肽链和第二多肽链的双特异性抗HER2抗体，其中该第一多肽链包含选自以下各项的序列：(1)[TZS]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[FcX](2)[BVH]-[BCH]-[FcX]-[L2]-[TZS](3)[BVH]-[BCH]-[L3]-[TZS]-[L4]-[FcX]其中TZs是结合与曲妥珠单抗相同的表位的scFv；L1、L2、L3以及L4是肽接头；Fcx是Fc结构域；BVH和BCH分别是抗体的VH区和CH1区，该抗体能够结合至与曲妥珠单抗抗体识别的表位不同的HER2表位。在某些方面中，该不同的表位包含SEQIDNO：52中的一个或多个氨基酸残基。在一些方面中，铰链多肽连接[BCH]和[FcX]。在特定方面中，该铰链多肽包含SEQIDNO：26的氨基酸或替代地由其组成。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二链包含序列[BVL]-[CL]，其中BVL是能够结合至与曲妥珠单抗抗体识别的表位不同的HER2表位的抗体的VL区，并且CL是IgG轻链恒定区。在一些方面中，CL选自下组，该组由以下各项组成：人κ恒定区和人λ恒定区。在一些方面中，该BVL包含(i)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。在一些方面中，BVL包含SEQIDNO：16或SEQIDNO：44的氨基酸。在其他方面中，CL是包含SEQIDNO：27A的氨基酸序列的κ轻链。在其他方面中，CL是包含SEQIDNO：27B的氨基酸序列的λ轻链。在一些方面中，[TZS]包含：(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：57的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：58的氨基酸的VL-CDR2；以及(vi)包含SEQIDNO：59的氨基酸的VL-CDR3。在一些方面中，[TZS]是二硫化物稳定的scFv。在一些方面中，[TZS]包含通过肽接头共价连接的VH和VL，该VH包含SEQIDNO：17的氨基酸序列并且该VL包含SEQIDNO：18的氨基酸序列。在一些方面中，该肽接头包含SEQIDNO：19的氨基酸序列。在一些方面中，[TZS]包含SEQIDNO：28的氨基酸序列。在一些方面中，[Fcx]的氨基酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO：23、24A、24B、24C、25A、25B以及25C。在一些方面中，[L1]、[L2]、[L3]以及[L4]的氨基酸独立地选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO：19、20、21以及22。在其他方面中，(i)[L1]包含SEQIDNO：20的氨基酸；(ii)[L2]包含SEQIDNO：20的氨基酸；(iii)[L3]包含SEQIDNO：21的氨基酸；并且(iv)[L4]包含SEQIDNO：22的氨基酸。在一些方面中，[BVH]包含(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或1个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)；以及(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)。在一些方面中，[BVH]包含SEQIDNO：15或SEQIDNO：43。在其他方面中，[BCH]包含SEQIDNO：29的氨基酸序列。在一些方面中，[BVL]包含(i)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。在其他方面中，[BVL]包含SEQIDNO：16的氨基酸。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一多肽链包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQIDNO：30、31A、31B、32A、32B、32C、33A、33B、33C、34、35A、35B、36A、36B、36C、37A、37B、37C、38、39A、39B、40A、40B、40C、41A、41B以及41C，并且该双特异性抗HER2抗体的该第二多肽链包含SEQIDNO：42A或42B的氨基酸。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域在结合至HER2靶标时诱导内化。在一些方面中，该双特异性HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域在内化之后促进有效的溶酶体运输。在一些方面中，该双特异性HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域诱导HER2靶标降解。在一些方面中，该双特异性HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域在低HER2表达的癌症细胞中阻断配体诱导的AKT磷酸化。在一些方面中，该双特异性HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域破坏配体诱导的HER2：HER3二聚化。本披露还提供包含在此披露的抗HER2结合分子或在此披露的抗HER2双特异性抗体的ADC，该ADC进一步包含至少一个治疗部分。在一些方面中，该ADC进一步包含至少一个任选的间隔物。在一些方面中，该至少一个间隔物是肽间隔物。在一些方面中，该至少一个间隔物是非肽间隔物。用于ADC的常规轭合策略依赖于通过赖氨酸或半胱氨酸随机地将有效负载(例如，治疗部分)轭合至抗体上。因此，在一些方面中，该ADC被随机地轭合至治疗部分上。在具体方面中，在特定位置处使用反应性氨基酸残基将治疗部分位点特异性轭合至抗体上可得到具有均匀化学计量的均质ADC制剂。在一些方面中，该ADC包含两个、三个、或四个或更多个治疗部分。在一些方面中，所有治疗部分是相同的。在一些方面中，每个治疗部分被化学轭合至该双特异性抗体的Fc区中的特定卡巴特位置处的氨基酸侧链上。在一些方面中，这些特定卡巴特位置是239、442、或两者。在一些方面中，这些特定位置是卡巴特位置442、在卡巴特位置239与240之间的氨基酸插入、或两者。在一些方面中，该氨基酸侧链是氢硫基侧链。在一些方面中，该治疗部分包括细胞毒素、放射性同位素、奥瑞他汀、美登木素生物碱或吡咯并苯并二氮杂(PBD)、或其组合。在某些方面中，该细胞毒素是微管溶素。在某些方面中，该微管溶素是化合物T32(在此又称为“微管溶素1508”或简称为“1508”)。本披露还提供包含双特异性抗HER2抗体的ADC，其中所述抗体包含：(i)包含SEQIDNO：32的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至卡巴特位置239处的半胱氨酸氨基酸上的微管溶素分子。(ii)包含SEQIDNO：33的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于卡巴特位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个微管溶素分子。(iii)包含SEQIDNO：40的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至卡巴特位置239处的半胱氨酸氨基酸上的微管溶素分子。(iv)包含SEQIDNO：41的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于卡巴特位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个微管溶素分子。本披露还提供编码抗HER2结合分子(例如，在此披露的双特异性抗HER2抗体)、或其补体的分离的核酸分子或核酸分子组。还提供包含此类核酸分子或核酸分子组、或其补体的载体或载体组。还提供包含该分离的核酸分子或核酸分子组、或该载体或载体组的宿主细胞。还提供表达在此披露的抗HER2结合分子或双特异性抗HER2抗体的宿主细胞。还提供用于产生抗HER2结合分子或双特异性抗HER2抗体的方法，该方法包括培养该宿主细胞并且从培养基中回收该抗体。本披露还提供药物组合物，该药物组合物包含抗HER2结合分子或抗HER2双特异性抗体以及药学上可接受的载体。还提供治疗HER2表达的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予在此披露的抗HER2结合分子、在此披露的抗HER2双特异性抗体、在此披露的ADC、或在此披露的药物组合物。在一些方面中，该癌症是低HER2表达的癌症。在一些方面中，该方法进一步包括给予至少一种另外的治疗剂。在一些方面中，该至少一种另外的治疗剂是放射性核素或化疗剂。还提供将治疗剂或预防剂靶向表达HER2的细胞表面的方法，该方法包括将该试剂轭合至在此披露的抗HER2结合分子、或在此披露的抗HER2双特异性抗体上。还提供增加治疗部分的活性的方法，该方法包括将该试剂轭合至在此披露的抗HER2结合分子、或在此披露的抗HER2双特异性抗体上。还提供改进治疗剂或预防剂的药物代谢动力学特性的方法，该方法包括将该试剂轭合至在此披露的抗HER2结合分子、或在此披露的抗HER2双特异性抗体上。在一些方面中，该治疗部分是细胞毒素。在一些方面中，该细胞毒素是微管溶素。在一些方面中，该微管溶素是化合物T32，在此又称为“微管溶素1508”或简称为“1508”。还提供治疗对HER2靶向的治疗剂的抗性的方法，该方法包括向有需要的患者给予在此披露的双特异性HER2抗体、在此披露的抗HER2结合分子、或在此披露的ADC。在一些方面中，该患者对包括曲妥珠单抗和/或美登木素生物碱DM1的HER2靶向的治疗剂有抗性。附图/图简要说明图1示出相应于前导优化的39S抗体(LO)和亲本AZ1.39.1抗体(WT)的VL区和VH区的氨基酸序列的序列比对。指示了CDR1、CDR2以及CDR3的位置。强调了相对于亲本抗体不同的氨基酸残基。还强调了VL区中的替换的构架区。图2.示出将轻链构架改变为种系IGKV2D可引起加倍表达。图3.示出HER2的细胞外结构域的结构的带状示意图。用箭头指示了39S、帕妥珠单抗以及结构域IVscFv的结合位点。39S的结合位点包括与帕妥珠单抗不同的结构域II内的氨基酸。图4示出使用DL-680标记的39S(2μg/ml)和不同浓度的未标记的单克隆抗体(R347对照、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、AZ1.39.1以及39S)的FACS竞争测定。图5示出使用不同抗体组合和细胞系MCF-7的配体依赖性增殖测定，从而证实在与曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗组合给予时39S协同地抑制所测定的细胞系的生长。对于每个实验，标绘的抗体样品是：R347对照、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗加上曲妥珠单抗、39S、39S加上曲妥珠单抗、以及39S加上帕妥珠单抗。图6示出使用不同抗体组合和细胞系NCI-N87的配体依赖性增殖测定，从而证实在与曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗组合给予时39S协同地抑制所测定的细胞系的生长。对于每个实验，标绘的抗体样品是：R347对照、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗加上曲妥珠单抗、39S、39S加上曲妥珠单抗、以及39S加上帕妥珠单抗。图7描绘双特异性构建体，其中HER2结合部分(在结构域IV内结合的半胱氨酸稳定的scFv)已被基因融合至39S抗体结构内的不同位置上。scFv被融合至39S抗体重链中的每一个的羧基末端(称为“Bs3Ab-39SH”)上(图7B)，融合至39S抗体重链中的每一个的氨基末端(称为“Bs2Ab-39SH”)上(图7A)，或嵌入在39S抗体重链中的每一个的CH1区与CH2区之间(称为“Bs4Ab-39SH”)(图7C)。图8A示出Bs2抗体的重链序列，从而指示在野生型重链和可对于ADCC活性或对于产生具有降低ADCC活性和/或位点特异性轭合的ADC而优化的重链中的卡巴特位置234、239、239-ins、330、332以及442处的氨基酸。图8B示出Bs3抗体的重链序列，从而指示在野生型重链和可对于ADCC活性或对于产生具有降低ADCC活性和/或位点特异性轭合的ADC而优化的重链中的卡巴特位置234、239、239-ins、330、332以及442处的氨基酸。图8C示出Bs4抗体的重链序列，从而指示在野生型重链和可对于ADCC活性或对于产生具有降低ADCC活性和/或位点特异性轭合的ADC而优化的重链中的卡巴特位置234、239、239-ins、330、332以及442处的氨基酸。图9A示出使用不同双特异性抗体构建体和MDA-MB-361细胞的配体依赖性增殖测定，从而证实Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH在MDA-MB-361和MCF-7细胞中具有类似的效力(分别为图9A和图9B)，这还可与亲本抗体组合(39S加上曲妥珠单抗)的活性比较。对于每个实验，标绘的抗体样品是：R347对照、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH、以及39S加上曲妥珠单抗。图9B示出使用不同双特异性抗体构建体和MCF-7细胞的配体依赖性增殖测定，从而证实Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH在MDA-MB-361和MCF-7细胞中具有类似的效力(分别为图9A和图9B)，这还可与亲本抗体组合(39S加上曲妥珠单抗)的活性比较。对于每个实验，标绘的抗体样品是：R347对照、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH、以及39S加上曲妥珠单抗。图10示出从T47D细胞中免疫沉淀(IP)HER2，接着免疫印迹法(WB)检测HER2和HER3以测量在存在或不存在抗HER2抗体情况下由调蛋白(HRG1)诱导的HER2：HER3二聚化的破坏。在对照条件(不具有抗体并且不具有HRG1；不具有抗体但具有HRG1；或具有对照抗体R347并且具有HRG1)下孵育T47D细胞，并且之后使用HRG1加上(i)曲妥珠单抗、(ii)帕妥珠单抗、或(iii)39S抗体、或(iv)Bs2Ab-39SH双特异性构建体孵育。图11示出代表性HPLC大小排阻色谱法分布图(profile)，从而示出从1∶1摩尔比的抗体∶HER2中衍生的免疫复合体的大小分离。Bs2Ab-39SH可交联许多HER2分子以形成大小为1716kDa大的复合体，而曲妥珠单抗最大仅可结合至两个HER2分子以形成320kDa复合体。图12呈现基于FACS的受体内化测定，从而表明在图6中呈现的三种HER2双特异性抗体形式在细胞系BT-474中快速内化。图上标绘的是：R347对照、曲妥珠单抗、39S、曲妥珠单抗加上39S、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、以及BsAb-39SH。在MCF-7、T47D、RT-112、MDA-MB-361、以及NCI-N87细胞系中看到类似的结果(数据未示出)。图13示出由BT-474细胞进行的Bs2Ab-39SH内化的动力学。在添加Bs2Ab-39SH构建体、曲妥珠单抗或R347对照之后的0分钟、30分钟、60分钟、120分钟、以及360分钟处取得显微图像。使用CELLTRACKERTM绿(美国生命技术公司(LifeTechnologiesCorp.))对BT-474细胞的细胞质进行染色，并且用ALEXA647(美国生命技术公司)标记抗体。图14是示出在使用抗体样品孵育BT-474细胞2小时、6小时、以及24小时之后HER2的降解程度或缺乏该HER2的蛋白质免疫印迹。GAPDH被用作对照。所测试的抗体样品是：(泳道1)R347对照抗体、(泳道2)曲妥珠单抗、(泳道3)帕妥珠单抗、(泳道4)曲妥珠单抗和帕妥珠单抗、(泳道5)39S、(泳道6)曲妥珠单抗和39S、(泳道7)帕妥珠单抗和39S、(泳道8)曲妥珠单抗、帕妥珠单抗以及39S、(泳道9)Bs2Ab-39SH、(泳道10)Bs2Ab-39SH_aFuc(均质无岩藻糖基化的Bs2Ab-39SH)、(泳道11)Bs3Ab-39SH、(泳道12)Bs3Ab-39SH_aFuc(均质无岩藻糖基化的Bs3Ab-39SH_aFuc)、(泳道13)Bs4Ab-39SH、以及(泳道14)Bs4Ab-39SH_aFuc(均质无岩藻糖基化的Bs4Ab-39SH)。图15是从Bs2Ab-39SH(图A)、Bs3Ab-39SH(图B)以及Bs4Ab-39SH(图C)抗HER2构建体衍生的示例性ADC的详细卡通示意图。由圆形指示ADC构建体的CH2和CH3结构域中的两个潜在工程化的细胞毒性剂轭合位点。在希望的药物与抗体比(DAR)是2比1的情况下，可使用或者位点1或者位点2。在希望DAR为4的情况下，使用位点1和位点2两者。可工程化替代的和/或另外的位点。对于具有大约2的DAR的ADC，双特异性抗HER2ADC在此被缩写为“Bs2Ab-2T”、“Bs3Ab-2T”以及“Bs4Ab-2T”(或简称为“Bs2-2T”、“Bs3-2T”以及“Bs4-2T”)，并且对于具有大约4的DAR的ADC，被缩写为“Bs2Ab-4T”、“Bs3Ab-4T”以及“Bs4Ab-4T”(或简称为“Bs2-4T”、“Bs3-4T”以及“Bs4-4T”)。通过在图7中提供的名称引用缺乏任何细胞毒性剂的双特异性构建体并且可被鉴定为“未待用的”。如在此所提供(参见，例如图8)，可选择工程化的轭合位点来降低或去除ADCC功能。替代地或另外地，抗体的Fc部分可进一步包含降低或去除ADCC活性的另外的突变。替代地，可使用经典轭合方法来产生ADC，诸如通过抗体的常有多种赖氨酸残基或天然半胱氨酸残基轭合至抗体上，从而产生异质抗体-药物轭合物混合物。图16A呈现使用1μg/ml的在每个图像下指示的抗体处理的SKOV-3细胞的免疫荧光图像，从而示出细胞内微管网络的破坏或缺乏该细胞内微管网络。示出了微管染色。测试了以下样品：不具有任何抗体的培养基对照(图像i)、R347对照抗体(图像ii)、曲妥珠单抗(图像iii)、Bs2Ab-39SH(图像iv)、R347-DM1(轭合至细胞毒性剂美登木素生物碱DM1上的R347对照抗体)(图像v)、R347-4T(轭合至4个细胞毒性剂微管溶素分子上的R347对照抗体)(图像vi)、T-DM1(轭合至美登木素生物碱DM1上的曲妥珠单抗)(图像vii)、以及Bs2-4T(轭合至4个细胞毒性剂微管溶素分子上的Bs2Ab-39SH)(图像viii)。图16B呈现使用1μg/ml的在每个图像下指示的抗体处理的JIMT-1细胞的免疫荧光图像，从而示出细胞内微管网络的破坏或缺乏该细胞内微管网络。示出了微管染色。测试了以下样品：不具有任何抗体的培养基对照(图像i)、R347对照抗体(图像ii)、曲妥珠单抗(图像iii)、Bs2Ab-39SH(图像iv)、R347-DM1(轭合至细胞毒性剂美登木素生物碱DM1上的R347对照抗体)(图像v)、R347-4T(轭合至4个细胞毒性剂微管溶素分子上的R347对照抗体)(图像vi)、T-DM1(轭合至美登木素生物碱DM1上的曲妥珠单抗)(图像vii)、以及Bs2-4T(轭合至4个细胞毒性剂微管溶素分子上的Bs2Ab-39SH)(图像viii)。图16C呈现使用1μg/ml的在每个图像下指示的抗体处理的RT-112细胞的免疫荧光图像，从而示出细胞内微管网络的破坏或缺乏该细胞内微管网络。示出了微管染色。测试了以下样品：不具有任何抗体的培养基对照(图像i)、R347对照抗体(图像ii)、曲妥珠单抗(图像iii)、Bs2Ab-39SH(图像iv)、R347-DM1(轭合至细胞毒性剂美登木素生物碱DM1上的R347对照抗体)(图像v)、R347-4T(轭合至4个细胞毒性剂微管溶素分子上的R347对照抗体)(图像vi)、T-DM1(轭合至美登木素生物碱DM1上的曲妥珠单抗)(图像vii)、以及Bs2-4T(轭合至4个细胞毒性剂微管溶素分子上的Bs2Ab-39SH)(图像viii)。图17A示出相对于SKBR-3人乳癌细胞系上的T-DM1、未轭合(未待用的)Bs2Ab-39SH以及曲妥珠单抗具有2或4的DAR的Bs2Ab形式的细胞毒性活性。还示出对于R347(R347对照抗体)、与2或4个微管溶素轭合的R347(分别为R347-2T和R3474T)、轭合至DM1上的R347的曲线。Bs2-2T和Bs2-4T两者比T-DM1更有效。图17B示出相对于SKBR-3人乳癌细胞系上的T-DM1、未轭合(未待用的)Bs4Ab-39SH以及曲妥珠单抗具有2或4的DAR的Bs4Ab形式的细胞毒性活性(图B)。还示出对于R347(R347对照抗体)、与2或4个微管溶素轭合的R347(分别为R347-2T和R3474T)、轭合至DM1上的R347的曲线。Bs4-2T和Bs4-4T两者比T-DM1更有效。图18A示出相对于JIMT-1人乳癌细胞系上的T-DM1、未轭合(未待用的)Bs2Ab-39SH以及曲妥珠单抗具有2或4的DAR的Bs2Ab形式的细胞毒性活性。还示出对于R347(R347对照抗体)、与2或4个微管溶素轭合的R347(分别为R347-2T和R3474T)、轭合至DM1上的R347的曲线。Bs2-2T和Bs2-4T两者在杀伤JIMT-1细胞上是非常有效的，而T-DM1示出无活性。图18B示出相对于JIMT-1人乳癌细胞系上的T-DM1、未轭合(未待用的)Bs4Ab-39SH以及曲妥珠单抗具有2或4的DAR的Bs4Ab形式的细胞毒性活性(图B)。还示出对于R347(R347对照抗体)、与2或4个微管溶素轭合的R347(分别为R347-2T和R3474T)、轭合至DM1上的R347的曲线。Bs4-2T和Bs4-4T两者在杀伤JIMT-1细胞上是非常有效的，而T-DM1示出无活性。图19A示出相对于ZR-75-1人乳癌细胞系上的T-DM1、未轭合(未待用的)Bs2Ab-39SH以及曲妥珠单抗具有2或4的DAR的Bs2Ab形式的细胞毒性活性。还示出对于R347(R347对照抗体)、与2或4个微管溶素轭合的R347(分别为R347-2T和R3474T)、轭合至DM1上的R347的曲线。Bs2-4T在杀伤ZR-75-1细胞上是最有活性的，而Bs2-2T具有较低水平的活性并且T-DM1示出无细胞毒性活性或限制的细胞毒性活性。图19B示出相对于ZR-75-1人乳癌细胞系上的T-DM1、未轭合(未待用的)Bs4Ab-39SH以及曲妥珠单抗具有2或4的DAR的Bs4Ab形式的细胞毒性活性(图B)。还示出对于R347(R347对照抗体)、与2或4个微管溶素轭合的R347(分别为R347-2T和R3474T)、轭合至DM1上的R347的曲线。Bs4-4T在杀伤ZR-75-1细胞上是最有活性的，而Bs4-2T具有较低水平的活性并且T-DM1示出无细胞毒性活性或限制的细胞毒性活性。图20示出相对于MDA-MB-468人乳癌细胞系上的T-DM1、未轭合(未待用的)Bs2Ab-39SH以及曲妥珠单抗具有2或4的DAR的Bs2Ab形式的细胞毒性活性(图A)。还示出对于R347(R347对照抗体)、与2或4个微管溶素轭合的R347(分别为R347-2T和R3474T)、轭合至DM1上的R347的曲线。数据指示Bs2-2T或Bs2-4T在MDA-MB-468细胞中都不是有效的，从而指示Bs2-2T和Bs2-4T的细胞毒性活性是靶标(HER2)依赖的。对于Bs4-2T和Bs4-4T观察到类似的结果(数据未示出)。图21A示出抗HER2ADC在MDA-MB-361肿瘤模型中的活性。示出了相应于使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)媒介物对照、(2)在3mg/kg下的R347-4T(轭合至4个微管溶素分子上的R347对照抗体)、(3)在3mg/kg下的T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)、(4)在3mg/kg下的Bs2ADMix(与微管溶素混合的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)、以及(5)在0.3、1以及3mg/kg下的Bs2-4T(轭合至4个微管溶素上的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)。在括号之间指示了浓度。图21B示出抗HER2ADC在MDA-MB-361肿瘤模型中的活性。示出了相应于使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)媒介物对照、(2)在3mg/kg下的R347-4T(轭合至4个微管溶素分子上的R347对照抗体)、(3)在3mg/kg下的T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)、(4)在3mg/kg下的Bs4ADMix(与微管溶素混合的Bs4Ab-39SH-(FCC)构建体)、以及(5)在0.3、1以及3mg/kg下的Bs4-4T(轭合至4个微管溶素上的Bs4Ab-39SH-(FCC)构建体)。在括号之间指示了浓度。图22示出抗HER2ADC在ST996三阴性(ER-/PR-/HER2-1+)PDX肿瘤模型中的活性。示出了相应于使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)媒介物对照(CTRL)、(2)同种型R347-2TCTRL(轭合至2个微管溶素分子上的R347对照抗体)、(3)同种型R347-4TCTRL(轭合至4个微管溶素分子上的R347对照抗体)、(4)T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)、(5)ADMix(与微管溶素混合的构建体)、(6)Bs2-2T，即轭合至2个微管溶素上的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体、或(7)Bs2-4T，即轭合至4个微管溶素上的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体。在括号之间指示了浓度。还通过箭头指示了给药时间。响应于不同处理的肿瘤生长曲线呈现为平均肿瘤体积(mm3)±SEM。图23示出抗HER2ADC在ST225(HER2-3+)BrCaPDX肿瘤模型中的活性。示出了相应于使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)媒介物对照、(2)R347-4T(轭合至4个微管溶素分子上的R347对照抗体)、(3)T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)、(4)BS2ADMix(与微管溶素混合的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)、以及(5)Bs2-4T(轭合至4个微管溶素上的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)。在括号之间指示了浓度。图24示出抗HER2ADC在T-DM-1未响应者JIMT-1(HER2-3+)BrCaCBX肿瘤模型中的活性。示出了相应于使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)媒介物对照、(2)R347-4T(轭合至4个微管溶素分子上的R347对照抗体)、(3)T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)、(4)BS2ADMix(与微管溶素混合的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)、以及(5)Bs2-4T(轭合至4个微管溶素上的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)。在括号之间指示了浓度。图25示出抗HER2ADC在ST455B三阴性(ER-/PR-/HER2-1+)BrCaPDX肿瘤模型中的活性。示出了相应于使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)媒介物对照(CTRL)、(2)同种型CTRL(轭合至4个微管溶素分子上的R347对照抗体)、(3)T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)、(4)BS2ADMix(与微管溶素混合的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)、以及(5)Bs2-4T(轭合至4个微管溶素上的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体)。在括号之间指示了浓度。图26A示出Bs2-4T和T-DM1对亲本NCI-N87细胞系(左图)和具有对T-DM1的获得性抗性的NCI-N87细胞系(右图)的细胞毒性活性。Bs2-4T在亲本细胞系中具有更有效的活性并且在杀伤T-DM1抗性细胞上仍有活性。图26B示出抗HER2ADC在T-DM1抗性NCI-N87肿瘤模型中的活性。示出了相应于未处理的小鼠和使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)ADMix(与微管溶素混合的构建体)、(2)T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)、(3)T-DM1(曲妥珠单抗-DM1ADC)加上帕妥珠单抗、或(4)Bs2-4T，即轭合至4个微管溶素上的Bs2Ab-39SH-(FCC)构建体。在括号之间指示了浓度。响应于不同处理的肿瘤生长曲线呈现为平均肿瘤体积(mm3)±SEM(n＝7)。与未处理的对照组比较，由学生t检验得到*P＜0.001。图27示出在使用曲妥珠单抗预处理之后的抗HER2ADC的活性。示出了相应于使用以下各项处理的小鼠的肿瘤生长曲线：(1)媒介物CTRL(对照)、(2)曲妥珠单抗接着是Bs2-4T、(3)媒介物接着是Bs2-4T、(4)曲妥珠单抗接着是Bs2-4T、或(5)媒介物接着是Bs2-4T。在括号之间指示了浓度和剂量方案。响应于不同处理的肿瘤生长曲线呈现为平均肿瘤体积(mm3)+/-SEM(n＝10)。图28A示出评价双特异性ADC的旁观者效应的测定的示意图。图28B示出使用以下各项处理的细胞的FACS分析结果：(i)单独培养基；(ii)R347-T4对照；(iii)T-DM1；(iv)Bs2Ab-39SH混合物；以及(v)Bs2-4T。在两个象限中的细胞数减少指示：Bs2-4T可杀伤共培养物中的HER2表达细胞和无HER2细胞两者，从而表明Bs2-4T具有旁观者效应。相反，T-DM1不能杀伤共培养物中的无HER2细胞，从而表明它不具有旁观者效应。图29示出相对于T-DM1和R347-4T(轭合至4个微管溶素分子上的R347对照抗体)，Bs2-4T对癌症干细胞(CSC)球体形成的活性(左图)；并且相对于R34-4T(轭合至4个微管溶素分子上的R234对照抗体)，对异种移植肿瘤中的CSC的活性(右图)。图30A示出使用细胞系MDA-MB-361(从脑转移衍生的人导管乳腺上皮癌)的配体依赖性增殖测定，这些测定示出所有ADCC增强的无岩藻糖基化的双特异性抗体均保留体外抗增殖性活性。在每个实验中，所使用的抗体样品是：R347对照、39S加上曲妥珠单抗、Bs2Ab-39SH_aFuc、Bs3Ab-39SH_aFuc、以及Bs4Ab-39SH_aFuc。图30B示出使用细胞系MCF-7(人侵入性导管乳腺癌)的配体依赖性增殖测定，这些测定示出所有ADCC增强的无岩藻糖基化的双特异性抗体均保留体外抗增殖性活性。在每个实验中，所使用的抗体样品是：R347对照、39S加上曲妥珠单抗、Bs2Ab-39SH_aFuc、Bs3Ab-39SH_aFuc、以及Bs4Ab-39SH_aFuc。图31A示出使用作为靶标的MDA-MB-361细胞和工程化的NK效应子细胞(稳定表达CD16)的ADCC细胞毒性测定，这些测定示出与具有岩藻糖基化的糖形的相同构建体相比，每种无岩藻糖基化的双特异性抗体具有更有效的ADCC活性。所使用的抗体样品是：(1)R347对照、(2)曲妥珠单抗、(3)曲妥珠单抗_aFuc、(4)Bs2Ab-39SH、以及(5)Bs2Ab-39SH_aFuc。图31B示出使用作为靶标的MDA-MB-361细胞和工程化的NK效应子细胞(稳定表达CD16)的ADCC细胞毒性测定，这些测定示出与具有岩藻糖基化的糖形的相同构建体相比，每种无岩藻糖基化的双特异性抗体具有更有效的ADCC活性。所使用的抗体样品是：(1)R347对照、(2)曲妥珠单抗、(3)曲妥珠单抗_aFuc、(4)Bs3Ab-39SH、以及(5)Bs3Ab-39SH_aFuc。图31C示出使用作为靶标的MDA-MB-361细胞和工程化的NK效应子细胞(稳定表达CD16)的ADCC细胞毒性测定，这些测定示出与具有岩藻糖基化的糖形的相同构建体相比，每种无岩藻糖基化的双特异性抗体具有更有效的ADCC活性。所使用的抗体样品是：(1)R347对照、(2)曲妥珠单抗、(3)曲妥珠单抗_aFuc、(4)Bs4Ab-39SH、以及(5)Bs4Ab-39SH_aFuc。图32示出微管溶素1508有效负载的结构。在最右边处的马来酰亚胺基团的双键易于与半胱氨酸上存在的巯基基团反应以形成稳定的碳-硫键。图33示出使用Bs2Ab-FCC构建体作为可衍生平台的示例性位点特异性抗体药物轭合方法。该方法包括以下步骤：(a)打开可衍生氨基酸(例如，半胱氨酸)的侧链，(b)氧化，(c)轭合有效负载(例如，细胞毒性剂诸如微管溶素)并且(d)通过去除轭合试剂和未反应的有效负载来抛光。发明详细说明本披露提供优化的抗HER2抗体、以及从此类优化的抗HER2抗体中衍生的双特异性抗体。还提供相关的多核苷酸、载体、细胞、以及包含此类优化的抗HER2抗体或双特异性抗HER2抗体的药物组合物。还提供制备此类优化的抗HER2抗体或双特异性抗体的方法。另外，本披露提供使用这些优化的抗HER2抗体或双特异性抗HER2抗体的方法，例如治疗有需要的受试者的癌症的方法。本披露还提供从优化的抗HER2抗体和从此类优化的抗HER2抗体中衍生的双特异性抗体中衍生的抗体-药物轭合物(ADC)。还提供制备从此类优化的抗体和双特异性抗体中衍生的ADC的方法。还提供使用从优化的抗HER2抗体和双特异性抗体中衍生的ADC的方法，例如治疗有需要的受试者的癌症的方法。还提供治疗患有对化学疗法有抗性的癌症(例如，T-DM1未响应者或较差响应者患者中的肿瘤)的患者的方法；治疗使用其他疗法(具体地单特异性ADC疗法(例如T-DM1))治疗会复发、难治疗、不适合的患者的方法；或在使用其他疗法(例如T-DM1)预先治疗之后治疗患者的方法。具体地说，本披露提供适用于治疗表达低水平HER2的癌症的抗HER2结合分子。为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。另外的定义贯穿详细说明而阐述。I.定义在详细描述本发明之前，应当了解的是，本发明并不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以改变。如在本说明书和随附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个/种”和“该”包括复数参考对象。术语“一个”(或“一种”)，以及术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个”在此可以互换地使用。此外，在此使用“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如在此在措词如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，如在词组如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面：A、B以及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露涉及的领域所属的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，简明生物医学与分子生物学词典(theConeiseDictionaryofBiomedicineandMolecularBiology)，卓培秀(Juo，Pei-Show)，第2版，2002，CRC出版社；细胞与分子生物学词典(TheDictionaryofCellandMolecularBiology)，第3版，1999，美国学术出版社(AcademicPress)；以及牛津生物化学与分子生物学辞典(theOxfordDictionaryOfBiochemistryAndMolecularBiology)，修订版，2000，牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)为技术人员提供了用于本披露中的许多术语的通用词典。单位、前缀以及符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的小标题不是不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。应当理解，当用语言“包含”来说明方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。氨基酸在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。术语“HER2”和“HER2受体”在此可互换使用，并且是指ErbB2蛋白(在文献中又称为HER2/neu)。如在此所使用，这些术语旨在包括HER2的变体(例如，剪接变体)、同工型、以及同源物(直向同源物和横向同源物两者)。在一些方面中，在此披露的抗HER2结合分子与HER2的结合抑制了表达HER2的细胞(即典型地肿瘤细胞，并且具体地表达低水平HER2的癌症细胞)的生长，该抑制通过抑制HER2与其他ErbB家族成员之间的异聚复合体形成，例如抑制与EGFR或HER3异源二聚化来实现。HER2是受体酪氨酸激酶并且包含细胞外结构域(ECD)，该HER2由以下各项组成：(i)两个负责配体结合的富含亮氨酸的结构域(结构域I/L1和结构域III/L2)、以及(ii)两个负责受体二聚化的富含半胱氨酸的结构域(结构域II/CR1和结构域IV/CR2)；跨膜结构域；以及细胞内酪氨酸激酶结构域。存在替代的HER2的剪接变体。替代的HER2的剪接变体的实例包括p100和赫斯达汀(两种可溶性形式)、以及611-CTF、687-CTF、648-CTF、以及Δ16HER2。HER2的可溶性形式可与全长受体(p185)相互作用并且抑制受体二聚化；687-CTF是无活性的；611-CTF和648-CTF可活化若干细胞内信号转导途径；并且Δ16HER2缺乏结构域IV中的氨基酸634-649，这诱导促进组成型活化的HER2同源二聚体形成的构象变化。不具有信号序列的成熟HER2的细胞外部分相应于标准同工型1的位置23-652(参见UniprotP04626；还参见“单独HER2和与赫赛汀Fab复合的HER2的细胞外区的结构(StructureoftheextracellularregionofHER2aloneandincomplexwiththeHerceptinFab.)”Cho等人，自然(Nature)421：756-760(2003)，通过引用以其全文结合在此)。帕妥珠单抗结合至HER2的结构域II内的表位。不结合至结构域II内的帕妥珠单抗结合表位的抗体包括曲妥珠单抗，该曲妥珠单抗结合至结构域IV内的表位。术语“抑制”、“阻断”以及“压制”在此可互换使用并且是指任何统计学显著的生物活性的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的降低。因此，当术语“抑制”或“压制”被用于描述例如对配体介导的HER2磷酸化的作用时，术语是指相对于未处理(对照)细胞中的磷酸化，抗HER2抗体或包含其抗原结合片段的HER2结合分子统计学显著地降低由EGF样配体诱导的HER2磷酸化的能力。表达HER2的细胞可以是天然存在的细胞或细胞系(例如，癌症细胞)或可以通过将编码HER2的核酸引入到宿主细胞中来重组产生。在一个方面中，该抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或包含其抗原结合片段的HER2结合分子)将配体介导的HER2磷酸化抑制至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％，如例如通过蛋白质印迹法接着是使用抗磷酸酪氨酸抗体探测或通过ELISA来确定。如在此所使用的术语表达HER2的细胞的“生长压制”或“生长抑制”是指相对于不存在抗HER2结合分子情况下的增殖，抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或包含其抗原结合片段的HER2结合分子)统计学显著地降低表达HER2的细胞的增殖的能力。在一个方面中，当细胞与抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或包含其抗原结合片段的HER2结合分子)接触时，相对于不存在该抗HER2结合分子情况下(对照条件)测量的增殖，表达HER2的细胞(例如，癌症细胞)的增殖可被降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％。细胞增殖可根据本领域中已知的不同方法来测量，例如通过计数活细胞数，鉴定生长标记物的标记物存在，测量分子(例如，放射性标记的分子，诸如3H-胸苷)的掺入，通过测量肿瘤的大小(例如，按体积计或按重量计)等。在某些方面中，生长压制是指转移的数量、大小或分布减小。如贯穿本说明书所使用，短语“抗HER2结合分子”是指例如(i)结合与本申请中披露的1.39.1抗体相同的表位或从该1.39.1抗体中衍生的抗体及其抗原结合片段(参见PCT公开号WO2008/019290)，例如39S抗体及其抗原结合片段，并且通常是包含此类抗体及其抗原结合片段的分子；(ii)结合与掺入另外的抗原结合部分的39S抗体相同的表位或从该39S抗体中衍生的抗HER2抗体和其他HER2结合分子，例如双特异性抗体；(iii)包含轭合至细胞毒性部分(例如，小分子抗癌剂、放射性核素等)上的根据(i)或(ii)的分子中的至少一种的抗体-药物轭合物(ADC)；以及(iv)具有增强的ADCC的根据(i)或(ii)的抗HER2分子。如在此所使用，术语“39S抗体”是指从PCT公开号WO2008/019290中披露的1.39.1抗体中衍生的前导优化的单克隆抗体，其中所述优化的抗体包含VH和VL，该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸并且该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸。如在此所使用，术语“微管溶素”是总体地和单独地指天然存在的微管溶素、以及微管溶素的类似物和衍生物。微管溶素的说明性实例披露于例如WO2004005326A2、WO2012019123A1、WO2009134279A1、WO2009055562A1、WO2004005327A1、US7754885、US20100240701、US7816377、US20110021568以及US20110263650中并且披露于在此提供的实例中。应当理解，此类衍生物包括例如微管溶素前药或包括一种或多种保护或保护基团、一个或多个连接部分的微管溶素。可使用本领域公认的技术来测定细胞增殖，这些技术测量了细胞分裂速率、和/或细胞群内经历细胞分裂的细胞分数、和/或由于终末分化或细胞死亡(例如，胸苷掺入)引起的细胞从细胞群中的损失率。如在此互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括全抗体和其任何抗原结合片段或其单链以及其组合(例如，双特异性抗体)。典型的抗体包含由二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链包含重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区(在此缩写为CH)。该重链恒定区包含三个结构域(CH1、CH2以及CH3)。每个轻链包含轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个结构域CL。这些VH区和VL区可被进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，这些高变区与称为构架区(FW)的更保守的区相互间置。每个VH和VL包含以下列顺序从氨基末端至羧基末端安排的三个CDR和四个FW：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主细胞或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。本披露的示例性抗体包括典型的抗体、scFv以及其组合，其中，例如scFv被共价连接(例如，通过肽键或通过化学接头)至典型抗体的重链和/或轻链的N末端上，或嵌入在典型抗体的重链和/或轻链中。术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合至靶标诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质、或上述物质的组合的免疫球蛋白分子。如在此所使用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、以及Fv片段)、单链可变片段(scFv)、二硫化物稳定的scFv、多特异性抗体诸如从至少两个完整抗体和/或其抗原结合片段中产生的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现希望的生物活性。抗体可以是以下五大类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1以及IgA2)，这基于它们的重链恒定结构域的特性分别被称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类的免疫球蛋白具有不同的且熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或轭合至其他分子诸如毒素、放射性同位素等上以形成ADC。“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原诸如HER2的生物活性的抗体。在某一方面中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全地抑制抗原的生物活性。希望地，该生物活性被降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、或甚至100％。术语“抗HER2抗体”或“抗HER2”是指能够以足够的亲和力结合HER2的抗体，这样使得该抗体作为靶向HER2的治疗剂或诊断试剂是有用的。抗HER2抗体与不相关非HER2蛋白的结合程度小于约该抗体与HER2的结合的10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)或BIACORETM(使用重组HER2作为分析物并且使用抗体作为配体，或反之亦然)、或其他本领域中已知的结合测定所测量。在某些方面中，结合至HER2的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤10pM、≤1pM、或≤0.1pM的解离常数(KD)。术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。本领域已知的是，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段完成。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、以及Fv片段、线性抗体、单链抗体、以及从抗体片段形成的多特异性抗体。“单克隆抗体”是指涉及高度特异性识别和结合单个抗原决定簇或表位的均质抗体群体。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”涵盖完整单克隆抗体和全长单克隆抗体两者以及抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链可变片段(scFv)、包含抗体部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指通过任何数量的方式制备的此类抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、以及转基因动物(例如，在转基因小鼠中表达人抗体)。术语“人源化抗体”是指从非人(例如，鼠)免疫球蛋白中衍生的抗体，该抗体被工程化成含有最少的非人(例如，鼠)序列。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自CDR的残基被来自具有希望的特异性、亲和力以及能力的非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、或仓鼠)的CDR的残基替换(琼斯(Jones)等人，1986，自然，321：522-525；瑞彻曼(Riechmann)等人，1988，自然，332：323-327；威霍英(Verhoeyen)等人，1988，科学(Science)，239：1534-1536)。在一些例子中，人免疫球蛋白的FW残基被来自具有希望的特异性和/或亲和力和/或能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。该人源化抗体可通过取代FW区中的另外残基和/或在替换的非人残基内精修并优化抗体特异性和/或亲和力和/或能力来进一步修饰。通常，该人源化抗体将基本上包含所有至少一个、并且典型地两个或三个可变结构域，这些可变结构域含有所有或基本上所有的相应于非人免疫球蛋白的CDR区，而所有或基本上所有的FW区是人免疫球蛋白共有序列的那些。该人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539或5,639,641中。抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独地或组合地。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个CDR区连接的四个FW区组成。每个链中的CDR由FW区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一个链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成。存在用于确定CDR的至少两种技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，卡巴特等人，具有免疫学兴趣的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，(第5版，1991，美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)，马里兰州贝塞斯达(BethesdaMd.))；以及(2)基于抗原-抗体复合体的结晶学研究的方法(奥拉卡尼(Al-lazikani)等人(1997)分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)273：927-948)。另外，在本领域中有时使用这两种方法的组合来确定CDR。当引用可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用卡巴特编号系统(例如，卡巴特等人，具有免疫学兴趣的序列，第5版，公共卫生服务(PublicHealthService)，美国国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991))。短语“如用卡巴特编号的氨基酸位置”、“卡巴特位置”以及其语法变体是指在卡巴特等人，具有免疫学兴趣的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，美国国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991)中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有相应于可变结构域的FW或CDR的缩短、或插入的较少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特的残基52a)以及在重链FW残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b、以及82c等)。表1可以通过抗体序列与“标准”卡巴特编号序列在同源区的比对而针对给定的抗体确定残基的卡巴特编号。替代地，乔西亚是指结构环的位置(乔西亚和莱斯克(Lesk)，分子生物学杂志196：901-917(1987))。当使用卡巴特编号惯例进行编号时，乔西亚CDR-H1环的端部取决于该环的长度在H32与H34之间变化(这是因为卡巴特编号方案在H35A和H35B处放置插入；如果35A或35B都不存在，该环在32处结束；如果仅存在35A，该环在33处结束；如果存在35A和35B两者，该环在34处结束)。AbM高变区代表卡巴特CDR与乔西亚结构环之间的折衷，并且通过牛津大学分子AbM抗体建模软件来使用。IMGT(ImMunoGeneTics)也提供了用于免疫球蛋白可变区包括CDR的编号系统。参见，例如勒弗朗M.P.(Lefranc，M.P.)等人，发育和比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)27：55-77(2003)，该参考文献通过引用结合在此。该IMGT编号系统基于多于5,000个序列的比对、结构数据以及高变环的表征，并且允许对于所有物种进行可变区和CDR区的简单比较。根据该IMGT编号方案，VH-CDR1是在位置26至35处，VH-CDR2是在位置51至57处，VH-CDR3是在位置93至102处，VL-CDR1是在位置27至32处，VL-CDR2是在位置50至52处，并且VL-CDR3是在位置89至97处。对于在本发明中讨论的所有重链恒定区氨基酸位置，根据首次在爱德曼(Edelman)等人，1969，美国科学院院刊63(1)：78-85中描述的EU索引进行编号，该参考文献描述了骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列，该氨基酸序列是首次人lgG1测序的。爱德曼等人的Eu索引也阐述于卡巴特等人，1991，具有免疫兴趣的蛋白质序列，第5版，美国公共卫生服务，国家卫生研究院，贝塞斯达中。因此，短语“如在卡巴特中所阐述的EU索引”或“卡巴特的EU索引”和“根据如在卡巴特中所阐述的EU索引的位置……”以及其语法变体是指基于如在卡巴特1991中所阐述的爱德曼等人的人lgG1Eu抗体的残基编号系统。用于可变结构域(重链和轻链两者)和轻链恒定区氨基酸序列的编号系统是在卡巴特1991中阐述的编号系统。如在此所使用，Fc区包括包含抗体的除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD、以及IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、以及在这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的铰链。虽然Fc区的界限可以改变，但人IgG重链Fc区通常被定义成包含其羧基末端的残基C226或P230，其中编号是根据如在卡巴特中阐述的EU索引。Fc可以是指孤立地这个区，或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的背景下的这个区。已在抗体恒定区的多个不同位置(例如，Fc位置，包括但不限于如通过在卡巴特中所阐述的EU索引进行编号的位置270、272、312、315、356、以及358)处观察到多态性，并且因此所呈现的序列与现有技术序列之间可存在略微的差异。已充分表征了人免疫球蛋白的多态性形式。目前，已知18种Gm同种异型：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)(勒弗朗(Lefranc)等人，人IgG亚类：结构、功能以及调控的分子分析(ThehumanIgGsubclasses：molecularanalysisofsttuucture，functionandregulation).培格曼(Pergamon)，牛津，第43-78页(1990)；勒弗朗G.等人，1979，美国人类遗传学杂志(Hum.Genet.)：50，199-211)。确切地想到，本发明的抗体可掺入任何免疫球蛋白基因的任何同种异型、异种型或单倍型，并且不限于在此提供的序列的同种异型、异种型或单倍型。术语“人抗体”意指由人产生的抗体或具有相应于使用本领域中已知的任何技术(例如，在培养物细胞中重组表达、或在转基因动物中表达)由人制备产生的抗体的氨基酸序列的抗体。因此，术语人抗体还涵盖具有相应于最初由人(或其工程化的变体或衍生物)产生但在非人系统中表达(例如，由化学合成产生；在微生物、哺乳动物或昆虫细胞中重组表达；或在动物受试者中表达)的抗体的氨基酸序列的抗体。因此，从人受试者或从人细胞(例如，表达重组抗体或其片段的杂交瘤或细胞系)中获得并且随后在例如小鼠的动物中表达的抗体被认为是人抗体。人抗体的这种定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多核苷酸的抗体，诸如例如包含鼠轻链和人重链多核苷酸的抗体。术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列从两种或更多种动物物种中衍生的抗体。典型地，轻链和重链两者的可变区相应于从具有希望的特异性和/或亲和力和/或能力的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)中的一种物种中衍生的抗体的可变区，而恒定区与从另一种物种(通常人)中衍生的抗体中的序列同源以便避免在这些物种中引发免疫应答。如在此所使用的术语“表位”是指能够结合至在此披露的HER2抗体或HER2结合分子的抗原性蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。抗体或结合分子的识别该表位的部分被称为互补位。蛋白质抗原的表位基于它们的结构和与互补位的相互作用而被分成两类(构象表位和线性表位)。构象表位包含抗原的氨基酸序列的不连续区段。这些表位基于抗原的3D表面特征和形状或三级结构而与互补位相互作用。相反，线性表位基于它们的一级结构而与互补位相互作用。线性表位由来自抗原的氨基酸的连续序列形成。术语“抗体结合位点”是指抗原(例如，HER2)中包含互补抗体特异性结合至其上的连续或不连续位点(即，表位)的区域。因此，该抗体结合位点可含有抗原中的另外区域，这些区域超出表位并且可决定诸如结合亲和力和/或稳定性的特性或影响诸如抗原酶促活性或二聚化的特性。因此，即使两个抗体结合至抗原内的相同表位，如果抗体分子建立与表位外部氨基酸的不同分子间接触，则此类抗体被认为结合至不同抗体结合位点。“结合亲和力”通常是指在分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如在此所使用，“结合亲和力”是指反映在结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力通常可以通过解离常数(KD)表示。可以通过本领域中已知的常见方法来测量亲和力，包括在此描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长地保持结合。多种测量结合亲和力的方法在本领域中是已知的，出于本披露的目的而可以使用它们中的任何一种。除非另外说明，否则“效力”通常表达为以nM计的IC50值。IC50是抗原结合分子的中值抑制浓度。在功能性测定中，IC50是将生物应答降低其最大值的50％的浓度。在配体结合研究中，IC50是将受体结合降低最大特异性结合水平的50％的浓度。可以通过本领域中已知的任何数量的手段来计算IC50。效力的改进可通过例如针对39S亲本抗体测量来确定。对于在此披露的抗HER2结合分子的效力改进倍数(例如，与39S亲本抗体、曲妥珠单抗或其组合相比)可以是至少约2倍、至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约4倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、或至少约180倍或更多。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、以及巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌的免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应子细胞能够特异性地结合至带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤该靶细胞。针对靶细胞表面的特异性高亲和力IgG抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所需要的。靶细胞的溶解是细胞外的，要求直接的细胞与细胞接触，并且不涉及补体。应当想到，除了抗体以外，具有特异性结合至带有抗原的靶细胞的能力的包含Fc区的其他蛋白质(确切地Fc融合蛋白)将能够实现细胞介导的细胞毒性。为了简明起见，由Fc融合蛋白的活性产生的细胞介导的细胞毒性在此又称为ADCC活性。“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是以不存在于自然中的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已被纯化至它们不再以存在于自然中的形式的程度的那些。在一些方面中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。术语“受试者”是指有待作为具体处理的接受者的任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。典型地，对于人受试者，在此可互换使用术语“受试者”和“患者”。术语“药物组合物”是指以容许活性成分(例如，在此披露的抗HER2结合分子)的生物活性有效这样的形式的制剂，并且该制剂不含有对向其给予该组合物的受试者有不可接受的毒性的另外组分。此种组合物可以是无菌的。如在此所披露的抗HER2结合分子的“有效量”是足以执行确切说明的目的的量。关于说明的目的，可以根据经验并且以常规方式确定“有效量”。术语“治疗有效量”是指有效于“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的在此披露的抗HER2结合分子或其他药物的量。当在此使用时，词语“标记”是指直接或间接轭合至在此披露的抗HER2结合分子上以便产生“标记的”抗HER2结合分子的可检测化合物或组合物。该标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语诸如“可衍生基团”和“可衍生官能团”可互换使用并且是指能够反应以容许介于在此披露的抗HER2结合分子(例如，HER2抗体)与另一种物质之间形成共价键的官能团。在一些方面中，此种物质是治疗部分(例如，细胞毒素)、可检测标记、聚合物(例如，PEG)等。示例性可衍生基团包括巯基、羟基、氨基、羧基、以及酰胺、以及其改性的形式，诸如被活化或被保护的形式。术语诸如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(totreat)”或“减轻(alleviating)”或“减轻(toalleviate)”是指(1)治愈、减缓、减轻诊断的病理病状或病症的症状和/或停止诊断的病理病状或病症的进展的治疗性措施以及(2)防止和/或减慢靶向的病理病状或病症的发展的预防性或防御性措施两者。因此，有治疗需要的那些包括已经患有病症的那些；倾向于患有病症的那些；以及其中有待防止病症的那些。在某些方面中，如果患者表现出例如全部、部分或暂时消退某种类型的癌症，则受试者根据本披露的方法被成功地“治疗”癌症。术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性”以及“恶性”是指或描述哺乳动物中典型地特征在于不规则细胞生长的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、以及白血病。此类癌症的更多具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌诸如肝细胞癌和肝细胞瘤、膀胱癌、乳癌(包括激素介导的乳癌，参见例如，英尼斯(Innes)等人(2006)英国癌症杂志(Br.J.Cancer)94：1057-1065)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、不同类型的头颈部癌和粘液性来源的癌症，诸如粘液性卵巢癌、胆管癌(肝脏)以及肾乳头状癌。在一些方面中，如在此所使用的术语癌症确切地是指表达HER2的癌症。在一些特定方面中，术语癌症是指表达低水平HER2的癌症。如在此所使用的“低水平HER2”是指当使用(DakoCytomation加利福利亚公司，卡奔塔利亚(Carpenteria)，CA)分类时表现出小于2+(例如，1+)分数的癌症细胞、受试者或患者，或例如通过FISH已鉴定为如此的癌症、癌症细胞、受试者或患者。为了确定癌症中的HER2表达，不同诊断/预后测定是可用的。在一个方面中，HER2过表达可通过IHC，例如通过使用(Dako)来分析。来自肿瘤活组织检查的石蜡包埋的组织切片可受到IHC测定并且根据如下的HER2蛋白质染色强度标准。替代地或另外地，可在福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤组织上进行FISH测定诸如INFORMTM(由塔纳亚利桑那州(Ventana，Ariz.)销售)或PATHVISIONTM(Vysis，Ill.)，以便确定肿瘤中的HER2过表达的程度(如果存在的话)。“低”是指小于正常、小于标准(诸如预先确定的量度)的量度，或相对小于另一个亚组量度的亚组量度的术语。例如，低HER2意指小于HER2阳性的一个具体患者样品组中的正常HER2量度的HER2的量度。正常HER2量度可以根据本领域技术人员可用的任何方法来确定。低HER2还可以意指小于预先确定的量度的HER2的量度，诸如预先确定的截止低HER2还可以意指其中低HER2亚组相对低于另一个亚组的量度。例如，但不限于，根据本说明书，两个不同的患者亚组可通过在数学上确定的点(诸如但不限于中值)周围对样品进行划分来创建，从而创建了其量度相对于量度高的另一个组是较低的(即，小于该中值)的组。HER2可通过本领域技术人员已知的任何方法来测量，诸如例如但不限于，使用eTag方法或使用任何标准IHC方法诸如作为另一个实例，低水平HER2是指低水平HER2同源二聚体，这意指小于HER2阳性的一个具体样品或患者组中的正常HER2同源二聚体量度的HER2同源二聚体的量度。低HER2同源二聚体还可以意指小于预先确定的量度(诸如预先确定的截止)的量度。低HER2同源二聚体还可以意指其中低HER2同源二聚体亚组相对低于另一个亚组的量度。HER2同源二聚体可通过本领域中已知的任何方法来测量，诸如荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、邻位连接测定(PLA)、二聚体特异性抗体或eTag或本领域技术人员熟知的任何其他方法。如在此所使用，术语“癌瘤”是指上皮细胞的癌症，这些上皮细胞是覆盖身体表面、产生激素并且构成腺体的细胞。癌瘤的实例是皮肤癌、肺癌、结肠癌、胃癌、乳癌、前列腺癌以及甲状腺癌。如在此可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。这些核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶掺入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和它们的类似物。先前描述适用于在此提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。术语“载体”意指能够递送，并且在一些方面中，在宿主细胞中表达感兴趣的一个或多个基因或一个或多个序列的构建体。载体的实例包括，但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相连的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体、以及某些真核细胞诸如生产者细胞。术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在此可互换使用是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可包含修饰的氨基酸，并且它可被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然地或通过介入而修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分轭合。还包括在定义内的是例如，含有氨基酸(包括例如，非天然氨基酸等)的一种或多种类似物、以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应当理解，因为本披露的多肽是基于抗体的，所以在某些方面中，多肽可作为单链或相连的链存在。“重组”多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。如同已经通过任何适合的技术来分离、分级分离或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽一样，出于本发明的目的，在工程化的宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被认为是分离的。在此披露的多肽可使用本领域中已知的方法来重组产生。替代地，在此披露的蛋白质和肽可被化学合成。除非另外说明，否则在对细胞毒性剂(即微管溶素)的化学结构进行修饰的背景下在此所使用的术语“取代的”涉及带有一个或多个取代基的母体基团。在常规意义上在此使用术语“取代基”，并且是指共价附接至、或如果适当的话融合至母体基团上的化学部分。各种各样的取代基是熟知的，并且用于这些取代基形成和引入到各种母体基团中的方法也是熟知的。化学取代基的实例在以下更详细地进行了描述。在对细胞毒性剂的化学结构进行修饰的背景下在此所使用的短语“任选取代的”涉及可以是未取代的或可以是取代的母体基团。在多肽背景下在此所使用的术语“取代的”、“氨基酸取代”等是指使用另一个氨基酸残基替换存在于母体多肽中的氨基酸残基。可例如通过化学肽合成或通过本领域中已知的重组方法来在母体多肽中取代氨基酸。因此，提到“位置X处的取代”或“位置X处的取代”是指使用替代的氨基酸残基取代位置X处存在的氨基酸。在一些方面中，可根据模式AXY描述取代方式，其中A是相应于在位置X处天然存在的氨基酸的单字母代码，并且Y是取代的氨基酸残基。因此，L234F将是指使用苯丙氨酸(F)取代位置234处的亮氨酸氨基酸(L)。在其他方面中，可根据模式XY描述取代方式，其中Y是相应于取代在位置X处天然存在的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码。因此，239C将是指使用半胱氨酸(C)取代位置239处的天然氨基酸。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的取代。在本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一种氨基酸替换，则取代被认为是保守的。在另一个方面中，氨基酸串可被在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同、在结构上类似的串保守地替换。非保守氨基酸取代包括以下那些，其中(i)具有正电性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)被取代成负电性残基(例如，Glu或Asp)或被负电性残基取代，(ii)亲水性残基(例如，Ser或Thr)被取代成疏水性残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被疏水性残基取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸被取代成任何其他残基或被任何其他残基取代，或(iv)具有大体积疏水性或芳香族侧链的残基(例如，Val、His、Ile或Trp)被取代成具有更小侧链的残基(例如，Ala、Ser)或无侧链的残基(例如，Gly)或被具有更小侧链的残基或无侧链的残基取代。其他氨基酸取代可通过普通技术人员容易地鉴定。例如，对于氨基酸丙氨酸，可从D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸以及D-半胱氨酸中的任一个中得到取代。对于赖氨酸，替代可以是D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、同源精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸、或D-鸟氨酸中的任一个。通常，可预期诱导分离多肽的特性变化的功能重要区域中的取代是以下那些，其中(i)极性残基例如丝氨酸或苏氨酸被取代成疏水性残基例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、或丙氨酸(或被其取代)；(ii)半胱氨酸残基被取代成任何其他残基(或被其取代)；(iii)具有正电性侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸被取代成具有负电性侧链的残基例如谷氨酸或天冬氨酸(或被其取代)；或(iv)具有大体积侧链的残基例如苯丙氨酸被取代成不具有这样侧链的残基例如甘氨酸(或被其取代)。前述非保守取代中的一种可改变蛋白质的功能特性的可能性还与关于蛋白质的功能重要区域的取代位置相关：一些非保守取代可因此对生物特性具有较小或没有作用。术语“氨基酸插入”是指在亲本序列中存在的两个氨基酸残基之间引入新的氨基酸残基。可例如通过化学肽合成或通过本领域中已知的重组方法来在亲本序列中插入氨基酸。因此，如在此所使用，短语“在位置X与Y之间插入”或“在卡巴特位置X与Y之间插入”是指在X位置与Y位置之间插入氨基酸，而且是指在编码位置X与Y处的氨基酸的密码子之间在编码氨基酸的密码子的核酸序列中的插入，其中X和Y相应于氨基酸位置(例如，位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入)。可根据模式AXins描述插入方式，其中A是相应于插入的氨基酸的单字母代码，并且X是该插入之前的位置。因此，C239ins将是指在位置239之后插入半胱氨酸氨基酸(C)(即，在位置239与240之间插入)。术语两个多肽或多核苷酸序列之间的“序列一致性百分比”是指考虑到为了最佳比对这两个序列而必须引入的添加或缺失(即，空隙)，在比较窗口上由这些序列共用的相同匹配位置的数目。匹配位置是其中相同核苷酸或氨基酸呈现在靶标序列与参考序列两者中的任何位置。呈现在靶标序列中的空隙未计数，因为空隙并非核苷酸或氨基酸。同样地，呈现在参考序列中的空隙未计数，因为对靶标序列核苷酸或氨基酸进行计数，而不对来自参考序列的核苷酸或氨基酸进行计数。序列一致性百分比的计算是通过确定相同氨基酸残基或核酸碱基出现在两个序列中的位置的数目以便产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘以100，从而产生序列一致性百分比。序列的比较和两个序列之间的序列一致性百分比的确定可以使用供在线使用与下载两者的易于得到的软件来完成。适合的软件程序可从不同来源获得，并且用于比对蛋白质与核苷酸序列两者。确定序列一致性百分比的一种适合程序是bl2seq，该程序是可从美国政府的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间执行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他适合程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，它们是EMBOSS生物信息学程序套件的一部分并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute；EBI)获得。与多核苷酸或多肽参考序列比对的单一多核苷酸或多肽靶标序列内的不同区域可各自具有其本身的序列一致性百分比。应当指出的是序列一致性百分比值被四舍五入至最近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13以及80.14向下舍入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18以及80.19向上舍入至80.2。还应当指出的是长度值将总是整数。在某些方面中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的一致性百分比“X”被计算为100×(Y/Z)，其中Y是在该第一序列和该第二序列比对中作为相同匹配计分的氨基酸残基数(如通过目测检查或具体序列比对程序所比对)并且Z是该第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于该第二序列，该第一序列与该第二序列的一致性百分比将高于该第二序列与该第一序列的一致性百分比。本领域技术人员应当了解用于计算序列一致性百分比的序列比对的产生不限于完全由基本序列数据驱动的二元序列-序列比较。序列比对可得自多重序列比对。产生多重序列比对的一种适合程序是可从www.CLUSTAL.org获得的ClustalW2。另一种适合程序是可从www.drive5.com/muscle/获得的MUSCLE。ClustalW2和MUSCLE可替代地从例如EBI获得。还应当了解序列比对可以通过将序列数据与来自异类来源的数据诸如结构数据(例如，结晶学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变位置)或系统发生数据集成来产生。将异类数据集成以便产生多重序列比对的适合程序是T-Coffee，它可从www.tcoffee.org获得，并且替代地可从例如EBI获得。还应当了解用于计算序列一致性百分比的最终比对可以自动或手动地管理(curate)。II.抗HER2结合分子本披露提供特异性结合HER2的抗HER2结合分子，例如包含其HER2结合片段的抗HER2抗体或分子。对于HER2的全长氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列是本领域中已知的(参见，例如对于人HER2的UniProt登录号P04626)。参见，例如耀司(Yamamoto)等人，自然319：230-234(1986)；寇森斯(Coussens)等人，科学230：1132-1139(1985)；涛(Tal)等人，分子细胞生物学7：2597-2601(1987)；萨姆巴(Semba)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)82：6497-6501(1985)；金(King)等人，科学229：974-976(1985)；萨卡尔(Sarkar)等人，DNA细胞生物学(DNACellBiol.)12：611-615(1993)；吉里(Giri)等人，分子细胞生物学25：11005-11018(2005)；阿尼多(Anido)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)25：3234-3244(2006)；必然尼(Birrane)等人，生物化学杂志278：1399-1402(2003)；伊万茨(Ivancic)等人，生物分子学核磁共振杂志(J.Biomol.NMR)27：205-219(2003)；曹(Cho)等人，自然421：756-760(2003)；富兰克林(Franklin)等人，癌症细胞(CancerCell)5：317-328(2004)；博斯特罗姆(Bostrom)等人，科学323：1610-1614(2009)；埃金伯特(Eigenbrot)等人，美国科学院院刊107：15039-15044(2010)；斯蒂芬斯(Stephens)等人，自然431：525-526(2004)；格林曼(Greenman)等人，自然446：153-158(2007)；所有这些参考文献通过引用以其全文结合在此。在某些方面中，这些抗HER2结合分子是抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，这些抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或包含其HER2结合片段的分子)包含Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、单链Fv、scFv、双硫化物稳定的scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgG△CH2、小抗体、F(ab′)3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单一结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、或scFv-Fc。在一些方面中，该抗体具有IgG类型，例如具有IgG1类型。在一些方面中，这些抗HER2结合分子是单特异性的。在其他方面中，这些抗HER2结合分子是双特异性的、三特异性的、四特异性的等。在其他方面中，这些抗HER2结合分子是多特异性的。在一些方面中，这些抗HER2结合分子是单价的、二价的、三价的、四价的等。在又其他方面中，这些抗HER2结合分子是多价的。在特定方面中，这些抗HER2结合分子是二价的，例如包含两个HER2特异性抗原结合位点的抗体。在特定方面中，这些抗HER2结合分子是双特异性的，即，分子可特异性结合至两个不同抗原(例如，相同或不同分子上的两个不同表位)。在一些特定方面中，这些抗HER2结合分子是二价的和四价的，例如，包含能够结合至两个不同抗原(例如，相同或不同分子上的两个不同表位)的四个抗原结合位点的抗体。在特定方面中，这些抗HER2结合分子包括具有与1.39.1抗体的结合位点基本上相同的结合位点的抗体或其抗原结合片段(参见PCT公开号WO2008/019290，该专利通过引用以其全文结合在此)。在特定方面中，这些抗HER2结合分子包括结合SEQIDNO：52的一个或多个氨基酸残基的抗体或其抗原结合片段。在某些方面中，这些抗HER2结合分子包括具有重叠1.39.1抗体的结合位点的结合位点的抗体或其抗原结合片段。在某些方面中，这些抗HER2结合分子包括包含与亲本1.39.1抗体的VH(SEQIDNO：43)和/或VL(SEQIDNO：44)相比已被修饰的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段(参见PCT公开号WO2008/019290)。在亲本抗体中引入的修饰可以包括与亲本1.39.1抗体相比在VH和VL的CDR区和/或在FW区中的突变(例如，点突变或替换整个子序列)。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VH-CDR1(SEQIDNO：45)被包含SEQIDNO：1的氨基酸的VH-CDR1替换。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VH-CDR1(SEQIDNO：45)被由SEQIDNO：1的氨基酸组成的VH-CDR1替换。在其他方面中，亲本1.39.1抗体的VH-CDR3(SEQIDNO：46)被包含SEQIDNO：3的氨基酸的VH-CDR3替换。在其他方面中，亲本1.39.1抗体的VH-CDR3(SEQIDNO：46)被由SEQIDNO：3的氨基酸组成的VH-CDR3替换。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VH-CDR1(SEQIDNO：45)和VH-CDR3(SEQIDNO：46)被分别包含SEQIDNO：1的氨基酸和SEQIDNO：3的氨基酸或由其组成的VH-CDR1和VH-CDR3替换。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VL-CDR1(SEQIDNO：47)被包含SEQIDNO：4的氨基酸的VL-CDR1替换。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VL-CDR1(SEQIDNO：3)被由SEQIDNO：4的氨基酸组成的VH-CDR1替换。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VLFW1区(SEQIDNO：48)被包含SEQIDNO：11的氨基酸的VLFW1替换。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VLFW1区(SEQIDNO：48)被由SEQIDNO：11的氨基酸组成的FW1替换。在其他方面中，亲本1.39.1抗体的VLFW2区(SEQIDNO：49)被包含SEQIDNO：12的氨基酸的FW2替换。在其他方面中，亲本1.39.1抗体的VLFW2区(SEQIDNO：49)被由SEQIDNO：12的氨基酸组成的FW2替换。在其他方面中，亲本1.39.1抗体的VLFW3区(SEQIDNO：50)被包含SEQIDNO：13的氨基酸的FW3替换。在其他方面中，亲本1.39.1抗体的VLFW3区(SEQIDNO：50)被由SEQIDNO：13的氨基酸组成的VLFW2替换。在一些方面中，亲本1.39.1抗体的VLFW1区(SEQIDNO：48)和/或FW2区(SEQIDNO：49)和/或FW3区(SEQIDNO：50)被独立地分别包含SEQIDNO：11、12或13的氨基酸或由其组成的FW1和/或FW2和/或FW3替换。在一些方面中，本披露提供包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)的抗HER2结合分子，其中该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸。在一些方面中，本披露提供包含VH和VL的抗HER2结合分子，其中该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸。在一些方面中，该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸并且该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸。在一些方面中，在此披露的抗HER2结合分子包括抗体或其HER2结合片段。在某些方面中，本披露的抗HER2结合分子包含免疫球蛋白重链(VH)和免疫球蛋白轻链(VL)，其中该结合分子包含：(i)包含SEQIDNO：1的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：2的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：3的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：4的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：5的氨基酸的VL-CDR2；以及，(vi)包含SEQIDNO：6的氨基酸的VL-CDR3；在某些方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)包含抗体VL和抗体VH，其中该VL包含与参考VL至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％一致的氨基酸序列，该参考VL包含SEQIDNO：16的氨基酸或由其组成。在其他方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)包含抗体VL和抗体VH，其中该VH包含与参考VH至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％一致的氨基酸序列，该参考VH包含SEQIDNO：15的氨基酸或由其组成。在其他方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)包含VL，该VL包含与参考VL至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％一致的氨基酸序列，该参考VL包含SEQIDNO：16的氨基酸或由其组成，并且进一步包含VH，该VH包含于参考VH至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％一致的氨基酸序列，该参考VH包含SEQIDNO：15的氨基酸或由其组成。在一些方面中，本披露的该抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)包含重链恒定区或其片段。在一些方面中，该重链恒定区是IgG恒定区。该IgG恒定区可包含选自下组的轻链恒定区，该组由以下各项组成：κ恒定区和λ恒定区。在某些方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)可以与1.39.1亲本抗体基本上相同或更好的亲和力结合HER2。因此，在一个方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)特异性结合HER2及其抗原片段，其中解离常数或kd(koff/kon)小于10-6M、或小于10-7M、或小于10-8M、或小于10-9M、或小于10-10M、或小于10-11M、或小于10-12M、或小于10-13M。在另一个方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)以小于1×10-3s-1、或小于2×10-3s-1的koff结合至HER2和/或其抗原片段。在其他方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)结合至HER2及其抗原片段，其中koff小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1、或小于10-10s-1。在另一个方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其HER2结合片段、或双特异性抗HER2抗体)结合至HER2和/或其抗原片段，其中缔合速率常数或kon速率是至少105M-1s-1至少5×105M-1s-1、至少106M-s-1、至少5×106M-1s-1至少108M-1s-1、至少5×107M-1s-1、或至少108M-1s-1、或至少109M-1s-1。在其他方面中，VH和/或VL氨基酸序列可与以上阐述的序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％类似，并且包含1、2、3、4、5或更多个保守取代。具有与SEQIDNO：16的VH区和/或SEQIDNO：15的VL区分别具有高(即，80％或更大)相似性的VH区和VL区的在此披露的抗HER2结合分子，可通过诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)它们各自的编码核酸分子，接着使用在此描述的功能测定对于保留的功能测试改变的抗体来获得。在此披露的抗HER2结合分子对抗原的亲和力和/或亲合力可使用本领域中熟知的任何适合方法来实验确定，例如，流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、或放射免疫测定(RIA)、或动力学(例如，BIACORETM分析)。也可以容易地采用直接结合测定以及竞争结合测定。参见，例如在基础免疫学(FundamentalImmunology)，保罗W.E.(Paul，W.E.)编著，Raven出版社：纽约，N.Y.(1984)中的博卓夫斯基(Berzofsky)等人，“抗体-抗原相互作用”(″Antibody-AntigenInteractions，″)；库彼(Kuby)，免疫学(Immunology)，W.H.弗里曼(W.H.Freeman)和公司：纽约，N.Y.(1992)；以及在此描述的方法。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度)下测量，在此披露的具体抗HER2结合分子与HER2抗原的相互作用的测量的亲和力可改变。因此，使用标准化的抗HER2结合分子和抗原溶液和如本领域中所知的标准化的缓冲液并且诸如在此描述的缓冲液来进行亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD或Kd、kon、koff)的测量。在本领域中还已知的是使用BIACORETM分析测量的亲和力可取决于哪一种反应物被结合至芯片而改变。在这个方面中，可使用其中靶向的抗HER2结合分子被固定到芯片上的形式(称为“IgG向下”形式)或使用其中靶蛋白质(例如，HER2)被固定到芯片上的形式(称为例如“HER2向下”形式)来测量亲和力。III.双特异性抗HER2结合分子本披露还提供包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域的双特异性抗HER2抗体，其中：(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2抗体结合位点；(ii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第一HER2抗体结合位点，该第一HER2抗体结合位点包含HER2的结构域II内的表位；并且，(iii)该第一HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点不同。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域结合至HER2抗体结合位点，该HER2抗体结合位点包含HER2的结构域II内的表位。在一些方面中，该第一HER2抗体结合位点与1.39.1或39S抗体的HER2抗体结合位点相同。在一些方面中，该第一HER2抗体结合位点与1.39.1或39S抗体的HER2抗体结合位点部分重叠。在其他方面中，该第一HER2抗体结合位点与1.39.1或39S抗体的HER抗体结合位点不同。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第二HER2抗体结合位点，该第二HER2抗体结合位点包含HER2的结构域IV内的表位。在一些方面中，该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER2抗体结合位点相同。在一些方面中，该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER2抗体结合位点部分重叠。在其他方面中，该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER抗体结合位点不同。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2抗体结合位点，(ii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第一HER2抗体结合位点，该第一HER2抗体结合位点包含HER2的结构域II内的表位并且与帕妥珠单抗的抗体结合位点不同，并且(iii)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与竞争结合至HER2的结构域IV。本披露还提供结合与以上披露的抗HER2结合分子相同的表位或从以上披露的抗HER2结合分子中衍生的双特异性抗HER2分子(即，从1.39.1亲本抗体例如39S抗体中衍生的前导优化的抗体)。在一些方面中，此类双特异性抗HER2分子是双特异性抗HER2抗体和从此类双特异性抗体中衍生的分子。在一些方面中，从在此描述的这些双特异性抗HER2分子中衍生的此类分子是抗体-药物轭合物(ADC)。在某些方面中，在此提供的这些ADC具有降低的ADCC活性。在一些方面中，从在此描述的这些双特异性抗HER2分子中衍生的此类分子具有增强的ADCC活性。本披露还提供包含第一免疫球蛋白和第二免疫球蛋白抗原结合结构域的双特异性HER抗体，其中(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位；并且(ii)其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域将HER2结合至SEQIDNO：52中的一个或多个氨基酸残基上。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域在结构域IV内的表位处结合HER2。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域将HER2结合至SEQIDNO：53中的一个或多个氨基酸残基上。因此，在一个方面中，本披露提供包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，该重链可变区和该轻链可变区包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)序列；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)序列；(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)序列；(iv)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)序列；(v)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)序列；以及，(vi)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)序列；其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含相对于包含VH(包含SEQIDNO：43的氨基酸)和VL(包含SEQIDNO：44的氨基酸)的免疫球蛋白抗原结合结构域的FW区不同的至少一个异源可变结构域构架区(FW)。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含：(i)包含SEQIDNO：11的氨基酸的可变轻链构架1(VL-FW1)；(ii)包含SEQIDNO：12的氨基酸的可变轻链构架2(VL-FW2)；(iii)包含SEQIDNO：13的氨基酸的VL-可变轻链构架3(VL-FW3)；(iv)包含SEQIDNO：14的氨基酸的可变轻链构架4(VL-FW4)；或(v)其任何组合。在一些方面中，该双特异性HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含：(i)由SEQIDNO：11的氨基酸组成的VL-FW1；(ii)由SEQIDNO：12的氨基酸组成的VL-FW2；(iii)由SEQIDNO：13的氨基酸组成的VL-FW3；(iv)由SEQIDNO：14的氨基酸组成的VL-FW4；或(v)其任何组合。在其他方面中，在此披露的该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中：(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH包含SEQIDNO：15或SEQIDNO：43的氨基酸；(ii)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，(iii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在其他方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中：(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH由SEQIDNO：15或SEQIDNO：43的氨基酸组成；(ii)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，(iii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中：(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VL包含SEQIDNO：16或SEQIDNO：44的氨基酸；(ii)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，(iii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中：(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VL由SEQIDNO：16或SEQIDNO：44的氨基酸组成；(ii)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，(iii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中：(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VL包含SEQIDNO：16或SEQIDNO：44的氨基酸，并且该VH包含SEQIDNO：15或SEQIDNO：45的氨基酸；(ii)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，(iii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中：(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VL由SEQIDNO：16或SEQIDNO：44的氨基酸组成，并且该VH由SEQIDNO：15或SEQIDNO：43的氨基酸组成；(ii)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，(iii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含以下各项或由其组成：(a)VH和VL，该VH进一步包含重链恒定区或其片段，并且该VL包含轻链恒定区(LC)或其片段；(b)单链Fv(“scFv”)；(c)双体抗体；(d)小抗体；(e)F(ab’)2；或(f)F(ab)。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该重链恒定区或其片段是IgG恒定区。在一些方面中，该IgG恒定区或其片段是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4恒定区。在特定方面中，该IgG恒定区是IgG1恒定区。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VL，该VL包含轻链恒定区(LC)，其中该LC恒定区是κ恒定区。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VL，该VL包含轻链恒定区(LC)，其中该LC恒定区是λ恒定区。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是例如单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或亲和力优化的抗体。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是例如人抗体。在一些方面中，该人抗体在转基因小鼠中表达(参见，例如布吕格曼(Bruggemann)，“在转基因小鼠中的人抗体表达”(″Humanantibodyexpressionintransgenicmice″)，实验免疫学与治疗学文献(Arch.Immunol.Therap.Exper.)49：203-208，2001，该参考文献通过引用以其全文结合在此)。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗竞争表位结合。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，这些不同HER2表位是非重叠的。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域(i)特异性结合至与曲妥珠单抗抗体相同的HER2表位；和/或(ii)通过曲妥珠单抗抗体竞争性地抑制HER2结合；和/或(iii)包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个互补决定区(CDR)，这些互补决定区包含SEQIDNO：54至59中的任一个的氨基酸。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv。在一些特定方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含二硫化物稳定的scFv(ds-scFv)。在一些方面中，该二硫化物稳定的scFv特异性结合至与曲妥珠单抗抗体相同的HER2表位。可通过在选择使得半胱氨酸残基可形成二硫键的位置处引入半胱氨酸取代而在scFv的VH区和VL区之间对稳定的二硫化物进行工程化。具体地说，可在构架区中引入这种二硫化物以使得VL区和VH区通过二硫键来连接。表2中提供了VH区和VL区中满足这些标准的代表性但非限制性的残基的位置。表2：VH-VL对VH44+VL100VH55+VL101VH101+VL46VH44+VL105VH100+VL50VH105+VL43VH45+VL87VH98+VL46VH106+VL57表2中的编号根据在卡巴特中所阐述的卡巴特索引。将理解，在这些位置处的野生型氨基酸残基将发生变化。无论是否是野生型氨基酸残基，给定对的每个位置都将由半胱氨酸取代。在此披露的scFv可获自或通过任何适合的来源(无论天然与否)产生，或它可以是重组scFv、合成scFv、半合成scFv、衍生化的scFv、发酵优化的scFv、其融合蛋白或等效物、突变体以及衍生物，只要它保持本披露的scFv要求的结合特异性。这些包括具有氨基酸取代或具有附接至氨基酸官能团上的糖或其他分子的带有结合特异性的scFv。关于scFv如在此所使用的术语“衍生物”或“衍生化”包括scFv的化学改性。此类改性的示例将是通过烷基、酰基、或氨基基团来替换氢。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域是scFv，该scFv包含：(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：57的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：58的氨基酸的VL-CDR2；以及，(vi)包含SEQIDNO：59的氨基酸的VL-CDR3。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域由特异性结合至与曲妥珠单抗抗体相同的HER2表位的scFv组成，并且包含从曲妥珠单抗抗体的VH和VL中衍生的VH和VL(例如，存在于曲妥珠单抗抗体中的天然VH和/或VL、或具有稳定突变例如在表2中示出的突变对的VH和/或VL突变体)。参见高登格(Goldenger)，临床治疗(Clin.Ther.)21：309-18(1999)。因此，在一些方面中，结合与曲妥珠单抗相同表位的该scFv包含VH和VL，该VH包含SEQIDNO：17的氨基酸并且该VL包含SEQIDNO：18的氨基酸。在一些方面中，结合与曲妥珠单抗相同表位的该scFv包含VH和VL，该VH由SEQIDNO：17的氨基酸组成并且该VL由SEQIDNO：18的氨基酸组成。在一些特定方面中，结合与曲妥珠单抗相同表位的该scFv的该VH和该VL通过肽接头共价连接。在一些方面中，该肽接头包含SEQIDNO：19的氨基酸。在一些方面中，该肽接头由SEQIDNO：19的氨基酸组成。如上所讨论，本领域技术人员将了解，结合与曲妥珠单抗相同表位的scFv包括从曲妥珠单抗衍生的序列，从而包含例如突变序列，其中相对于曲妥珠单抗抗体中的亲本序列，至少一个氨基酸被缺失或取代，只要所得分子能够特异性结合至与曲妥珠单抗抗体相同的HER2表位，例如被设计成在该scFv的VH与VL之间引入至少一个稳定二硫化物的突变。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的羧基末端上。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的羧基末端之间的至少一个接头。在一些特定方面中，一个接头被插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的羧基末端之间。在一些方面中，该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的氨基末端上。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的氨基末端之间的至少一个接头。在特定方面中，一个接头被插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的氨基末端之间。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价嵌入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的序列中。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价嵌入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的CH1区与CH2区之间。在一些方面中，一个或多个接头将该双特异性抗HER2抗体的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域连接至该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的CH1区和/或CH2区上。在一些特定方面中，该双特异性抗HER2抗体包含(i)插入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的CH1区与该第二免疫球蛋白抗原结合结构域之间的接头；以及(ii)插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的HC的CH2区之间的第二接头。在一些方面中，该第一接头和该第二接头是相同的。在一些方面中，该第一接头和该第二接头是不同的。在一些方面中，这些接头中的一个或多个包括肽接头。在一些方面中，该肽接头包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或至少30个氨基酸。在一些方面中，该肽接头包含多于20个氨基酸。在一些方面中，该肽接头包括具有化学式Serx[(Gly)y-Ser4]z的肽，其中x是从0至1，y是从1至4，并且z是从1至10。在一些方面中，该肽接头包含选自SEQIDNO：19、20、21或22的序列。在一些方面中，该双特异性抗HER2抗体包含重链，该重链包含包括Fc结构域的恒定区。在一些方面中，该Fc结构域包含CH2区、和/或CH3区、和/或其片段。在一些方面中，该Fc结构域包含CH2区和CH3区。在一些方面中，该Fc结构域由CH2区和CH区组成。在一些方面中，该Fc结构域是IgGFc结构域，例如，来自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc结构域。在一些方面中，该IgGFc结构域是人或人源化IgGFc结构域。在一些方面中，该Fc结构域是IgG1Fc结构域。在一些方面中，该IgGFc结构域例如IgG1Fc结构域是天然(野生型)结构域。在一些方面中，该天然IgG1Fc结构域包含SEQIDNO：23的氨基酸。在一些方面中，该天然IgG1Fc结构域由SEQIDNO：23的氨基酸组成。在其他方面中，该Fc结构域是突变IgG结构域，例如，突变IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4结构域。在一些特定方面中，该突变Fc结构域是突变IgG1Fc结构域。在一些方面中，该突变IgG结构域例如人或人源化IgG1Fc结构域包含能够降低该双特异性抗HER2抗体的ADCC活性的至少一个突变。在某些方面中，能够降低该抗HER2双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变是氨基酸取代。在一些方面中，具有降低的ADCC活性的该双特异性抗HER2抗体包含选自以下各项的至少一个氨基酸取代：L234F、S239C、S239A、位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据在卡巴特中所阐述的EU索引。能够降低抗体的ADCC活性的众多突变是本领域中已知的。例如，参见描述于WO2012175751、WO2011149999、WO2011066501、WO2000042072、WO2011120134中的突变，这些专利通过引用以其全文结合在此。具有降低的ADCC效应子功能的抗体还包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327以及329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)，其中氨基酸位置编号根据在卡巴特中所阐述的EU索引。此类Fc突变体还包括具有在氨基酸位置265、269、270、297以及327中的两个或更多个处的取代的Fc突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的取代的Fc突变体(美国专利号7,332,581，其中氨基酸位置编号根据在卡巴特中所阐述的EU索引)。在一些方面中，该突变IgG结构域例如人或人源化IgG1Fc结构域包含能够增强该双特异性抗HER2抗体的ADCC活性的至少一个突变。在某些方面中，能够增强该抗HER2双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变是氨基酸取代。在一些方面中，具有增强的ADCC活性的该双特异性抗HER2抗体包含选自以下各项的至少一个氨基酸取代：S239A、S239D、A330L、I332E、E333A、K334A或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据在卡巴特中所阐述的EU索引。增强ADCC活性的另外突变是本领域技术人员已知的，包括但不限于以下各项中的那些：在US6,737,056的表2和表6-10中举例说明的那些；在US2006/024298的图41中呈现的表格；在US2006/235208的图5、图12以及图15中呈现的表格；在US2006/0173170的图8、图9以及图10中呈现的表格以及WO09/058492的图8、图9以及图10中呈现的表格。在一些方面中，该突变IgG1Fc结构域可以包含引入可衍生官能团的至少一个氨基酸取代。在一些方面中，该突变IgG1Fc结构域包含引入可衍生官能团的一至三个氨基酸取代。在一些方面中，该可衍生基团是半胱氨酸氨基酸的氢硫基侧链。在具体方面中，该取代的氨基酸或多个氨基酸发生在该抗HER2结合分子的可接近位点处。通过使用半胱氨酸取代那些氨基酸残基，从而反应性巯基基团被定位在该抗HER2结合分子的可接近位点处并且可以被用来将该抗HER2结合分子轭合至其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)上以便产生如在此进一步所述的免疫轭合物。半胱氨酸工程化的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541中所述的来产生。在一些方面中，该可衍生基团被引入在卡巴特位置239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443或446处、在位置239与240之间插入的氨基酸处、或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在一些方面中，引入可衍生氢硫基基团的氨基酸或氨基酸取代选自下组，该组由以下各项组成：S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C以及446C、位置239与240之间的半胱氨酸插入、或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在一些方面中，引入可衍生氢硫基基团的氨基酸或氨基酸取代是S239C和/或S442C。选择性可衍生的基团是本领域中熟知的，诸如氨基基团、氢硫基基团、侧链氧氨基、或其他亲核基团。可衍生基团可以通过一个或多个接头连接至多肽链上。配体(例如，治疗部分、可检测标记、半衰期延长聚合物等)可以使用适当的附接化学物附接至可衍生基团上。这种偶联化学物可以包括，例如酰胺、脲、硫脲、肟、氨基乙酰胺等。在一些方面中，该Fc结构域具有增强ADCC活性的改变类型的糖基化。该Fc区的糖基化可以被修饰成增加或降低效应子功能(参见例如，优玛娜(Umana)等人，1999，自然生物技术(Nat.Biotechnol)17：176-180；戴维斯(Davies)等人，2001，生物技术与生物工程(BiotechnolBioeng)74：288-294；希尔兹(Shields)等人，2002，生物化学杂志(JBiolChem)277：26733-26740；新川(Shinkawa)等人，2003，生物化学杂志278：3466-3473；美国专利号6,602,684；6,946,292；7,064,191；7,214,775；7,393,683；7,425,446；7,504,256；美国公开号2003/0157108；2003/0003097；2009/0010921；POTELLEGENTTM技术(Biowa公司，新泽西州普林斯顿(Princeton，N.J.))；GLYCOMABTM糖基化工程化技术(GLYCART生物技术股份有限公司(GLYCARTbiotechnologyAG)，瑞士苏黎世(Zurich，Switzerland)))。在一些方面中，该Fc结构域是具有降低量的岩藻糖基残基的低度岩藻糖基化抗体Fc结构域(参见例如美国专利申请公开号2005/0226867)。在一个方面中，如宿主细胞(例如，CHO细胞，浮萍(Lemnaminor))中产生的、具有增加的效应子功能(尤其是ADCC)的这些抗体被工程化来产生ADCC比通过亲本细胞产生的抗体高出100倍以上的高度去岩藻糖基化的抗体(例如，莫里(Mori)等人，2004，生物技术与生物工程88：901-908；考克斯(Cox)等人，2006，自然生物技术24：1591-7)。在一些方面中，该Fc结构域具有增加的等分GlcNAc结构(例如，优玛娜等人，1999，自然生物技术17：176-180；US2009/0010921)。在一些方面中，该突变Fc结构域包含SEQIDNO：24A、24C、25A或25C的氨基酸。在一些方面中，该突变Fc结构域包含SEQIDNO：24B或SEQIDNO：25B的氨基酸。在本披露中还提供包含彼此相关联的第一多肽链和第二多肽链的双特异性抗HER2抗体，其中该第一多肽链选自以下各项：(1)[TZs]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[Fcx](2)[BVH]-[BCH]-[Fcx]-[L2]-[TZs](3)[BVH]-[BCH]-[L3]-[TZs]-[L4]-[Fcx]其中TZs是结合与由曲妥珠单抗抗体识别的相同表位的scFv；L1、L2、L3以及L4是肽接头；Fcx是Fc结构域；BVH和BCH分别是抗体的VH区和CH1区，该抗体能够结合至与曲妥珠单抗抗体识别的表位不同的HER2表位。在一些方面中，该不同的表位包含SEQIDNO：52内的一个或多个氨基酸。在一些方面中，曲妥珠单抗抗体识别的表位包含SEQIDNO：53中的一个或多个氨基酸残基。在一些方面中，该第二多肽链包含[BVL]-[CL]，其中BVL是能够结合至与曲妥珠单抗抗体识别的表位不同的HER2表位的抗体的VL区，并且CL是IgG轻链恒定区。在一些方面中，CL选自下组，该组由以下各项组成：人κ恒定区和人λ恒定区。在一些方面中，BVL包含SEQIDNO：16的氨基酸。在一些方面中，BVL包含SEQIDNO：44的氨基酸。在一些方面中，BVL包含：(i)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及，(iii)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。在一些特定方面中，CL包含SEQIDNO：27A的氨基酸。在一些特定方面中，CL包含SEQIDNO：27B的氨基酸。在一些方面中，[TZs]包含：(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：57的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：58的氨基酸的VL-CDR2；以及(vi)包含SEQIDNO：59的氨基酸的VL-CDR3。在一些方面中，[TZs]是二硫化物稳定的scFv。在一些方面中，[TZs]包含通过肽接头共价连接的(i)VH，该VH包含SEQIDNO：17的氨基酸或其变体或由其组成，以及(ii)VL，该VL包含SEQIDNO：18的氨基酸或其变体或由其组成。适用于连接scFv的VH和VL部分的众多接头(例如，肽接头)是本领域中已知的。在一些方面中，该接头是包含SEQIDNO：19的氨基酸或由其组成的肽接头。在其他方面中，[TZs]包含SEQIDNO：28的氨基酸或由其组成。在一些方面中，铰链多肽连接[BCH]和[Fcx]。在一些方面中，该铰链多肽包含SEQIDNO：26的氨基酸或由其组成。在一些方面中，该[Fcx]包含引入可衍生基团的至少一个氨基酸取代。在其他方面中，该[Fcx]包含引入可衍生基团的一至三个氨基酸取代。在又其他方面中，该[Fcx]包含引入可衍生基团的多于三个氨基酸取代。在一些方面中，所有可衍生基团是相同的。在其他方面中，至少一个可衍生基团与其余的可衍生基团不同。在一些方面中，所有可衍生基团是不同的。在一些方面中，该可衍生基团是氢硫基基团(例如，半胱氨酸的氢硫基基团)。在一些方面中，该可衍生基团是被保护的。在一些方面中，该可衍生基团被引入在位置239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443或446处、或在位置239与240之间、或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在一些方面中，该可衍生基团是至少一个半胱氨酸氨基酸取代中的氢硫基基团，该氨基酸取代包括S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C以及446C、位置239与240之间的半胱氨酸插入、或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在一些方面中，引入可衍生氢硫基基团的氨基酸或氨基酸取代是S239C和/或S442C。在一些方面中，引入可衍生氢硫基基团的氨基酸或氨基酸取代是位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入和/或S442C。在其他方面中，[Fcx]包含SEQIDNO：23、24A、24C、25A或25C中的任一个的氨基酸。在其他方面中，[Fcx]包含SEQIDNO：23、24B或25B中的任一个的氨基酸。在某些方面中，[L1]、[L2]、[L3]以及[L4]包含独立地选自下组的接头序列的氨基酸，该组由以下各项组成：SEQIDNO：19、20、21以及22。在一些方面中，所有接头是不同的。在一些方面中，这些接头中的至少两个是相同的。本领域技术人员将理解，这些接头可以是肽接头、非肽接头、或肽接头和非肽接头的组合。在一些特定方面中，(i)[L1]包含SEQIDNO：20的氨基酸或由其组成；(ii)[L2]包含SEQIDNO：20的氨基酸或由其组成；(iii)[L3]包含SEQIDNO：21的氨基酸或由其组成；并且(iv)[L4]包含SEQIDNO：22的氨基酸或由其组成。在一些方面中，[BVH]包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)；以及(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)。在一些方面中，[BVH]包含SEQIDNO：15或SEQIDNO：43的氨基酸或由其组成。在一些方面中，[BVL]包含：(i)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及，(iii)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。在一些特定方面中，[BVL]包含SEQIDNO：16或SEQIDNO：44的氨基酸或由其组成。在一些方面中，[BCH]包含SEQIDNO：29的氨基酸或由其组成。在一些特定方面中，本披露提供包含第一多肽链和第二多肽链的双特异性抗HER2抗体，其中(i)该第一多肽链包含选自下组的氨基酸序列或由其组成，该组由以下各项组成：SEQIDNO：30、31A、32A、32C、33A、33C、34、34A、35A、36A、36C、37A、37C、38、38A、39A、40A、40C、41A以及41C，并且(ii)该第二多肽链包含SEQIDNO：42A或42B的序列或由其组成，其中该双特异性抗HER2抗体被轭合至治疗部分上。在一些特定方面中，本披露提供包含第一多肽链和第二多肽链的双特异性抗HER2抗体，其中(i)该第一多肽链包含选自下组的氨基酸序列或由其组成，该组由以下各项组成：SEQIDNO：30、31B、32B、33B、34B、35B、36B、37B、38B、39B、40B以及41B，并且(ii)该第二多肽链包含SEQIDNO：42A或42B的序列或由其组成，其中双特异性抗HER2抗体具有增强的ADCC活性。IV.抗体-药物轭合物(ADC)本披露还提供抗体-药物轭合物(ADC)，该抗体-药物轭合物包含轭合至至少一个治疗部分上的在此披露的抗HER2结合分子(例如，结合与39S抗体相同表位或从39S抗体中衍生的抗体或其HER2结合片段、或在此披露的双特异性抗HER2抗体)中的至少一个。因此，在一些方面中，该ADC包含轭合至至少一个治疗部分(例如，细胞毒素)上的在此披露的双特异性抗HER2抗体，其中所述双特异性抗HER2抗体包含(i)第一免疫球蛋白抗原结合结构域和(ii)第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，该重链可变区和该轻链可变区包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)序列；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)序列；(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)序列；(iv)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)序列；(v)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)序列；以及，(vi)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)序列；其中：(a)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段；并且，(b)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，该ADC的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含相对于包含VH(包含SEQIDNO：43的氨基酸)和VL(包含SEQIDNO：44的氨基酸)的免疫球蛋白抗原结合结构域的FW区不同的至少一个异源可变结构域构架区(FW)。在一些方面中，该ADC进一步包含至少一个任选的间隔物，该至少一个任选的间隔物可被嵌入在抗HER2结合分子的多肽链中的氨基酸侧链(例如，在此披露的抗HER2双特异性抗体的重链中的氨基)与治疗部分之间。在一些方面中，该至少一个间隔物是肽间隔物。在其他方面中，该至少一个间隔物是非肽间隔物。在一些方面中，该间隔物是不稳定的，诸如酸不稳定的间隔物(例如，肼)。在其他方面中，该间隔物是酶可裂解的肽，例如可裂解的二肽。在一些方面中，该间隔物是不可裂解的(水解稳定的)，例如硫醚间隔物或位阻的二硫化物间隔物。在一些方面中，嵌入在抗HER2结合分子的多肽链中的氨基酸侧链(例如，在此披露的抗HER2双特异性抗体的重链中的氨基)与另外的治疗部分之间的是MCC(N-琥珀酰亚胺基-4(马来酰亚胺基甲基)环己烷))。水解稳定的间隔物在水中是基本上稳定的并且在有用的pH值下(包括但不限于在生理条件下持续延长的时间周期)不与水反应。水解不稳定或可降解的间隔物在水中或在水溶液(包括例如血液)中可降解。酶促不稳定或可降解的间隔物可被一种或多种酶降解。仅通过举例，PEG和相关的聚合物可以包括聚合物骨架中的可降解间隔物或在聚合物骨架与聚合物分子的末端官能团中的一个或多个之间的接头基团中的可降解间隔物。此类可降解间隔物包括，但不限于由PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基团的反应形成的酯键，其中此类酯基团通常在生理条件下水解以释放该生物活性剂。其他水解可降解的间隔物包括但不限于碳酸酯键；由胺和醛的反应产生的亚胺键；由醇与磷酸盐基团反应形成的磷酸酯键；作为酰肼和醛的反应产物的腙键；作为醛和醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐和醇的反应产物的原酸酯键；由包括但不限于聚合物诸如PEG的一端处的胺基团和肽的羧基基团形成的肽键；以及由包括但不限于聚合物的一端处的亚磷酰胺基团和寡核苷酸的5′羟基基团形成的寡核苷酸键。在一些方面中，该ADC包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个治疗部分。在一些特定方面中，该ADC包含两个、三个、或四个治疗部分。在一些方面中，所有治疗部分是相同的。在一些方面中，至少一个治疗部分与其余的治疗部分不同。在一些方面中，所有治疗部分是不同的。在一些方面中，所有间隔物(例如，肽间隔物和/或非肽间隔物)是相同的。在一些方面中，至少一个间隔物与其余的间隔物不同。在还其他方面中，所有间隔物是不同的。在一些方面中，每个治疗部分被化学轭合至该抗HER2结合分子(例如，在此披露的双特异性抗HER2抗体)的Fc区中的特定位置处的氨基酸侧链上。在一些方面中，Fc区中的特定位置选自下组，该组由以下各项组成：239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443、446、在位置239与240之间的插入、以及其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在一些方面中，Fc区中的特定位置是239、442或两者，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在一些方面中，Fc区中的特定位置由442和位置239与240之间的氨基酸插入组成，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在一些方面中，其中轭合治疗部分的氨基酸侧链是氢硫基侧链，例如半胱氨酸氨基酸的氢硫基基团。在一些方面中，至少一个治疗部分被化学轭合至位于该抗HER2结合分子(例如，在此披露的双特异性抗HER2抗体)的Fc区外的位置处的氨基酸侧链上。在一些方面中，所有治疗部分被化学轭合至位于该抗HER2结合分子(例如，在此披露的双特异性抗HER2抗体)的Fc区外的位置处的氨基酸侧链上。在一些方面中，使用本领域中已知的重组技术将至少一个治疗部分基因掺入到该抗HER2结合分子(例如，在此披露的双特异性抗HER2抗体)的多肽链中。在一些方面中，该治疗部分包括细胞毒素、放射性同位素、放射性同位素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、肽、脂质、碳水化合物、螯合剂或其组合。在一些特定方面中，该细胞毒素是奥瑞他汀、微管溶素、关登木素生物碱或吡咯并苯并二氮杂(PBD)。在另一个特定方面中，该细胞毒素是微管溶素1508。在特定方面中，该ADC包含在此披露的双特异性抗HER2抗体，其中所述抗体包含：(i)包含SEQIDNO：32A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(ii)包含SEQIDNO：33A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iii)包含SEQIDNO：36A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iv)包含SEQIDNO：37A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(v)包含SEQIDNO：40A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；或，(vi)包含SEQIDNO：41A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在特定方面中，该ADC包含在此披露的双特异性抗HER2抗体，其中所述抗体包含：(i)包含SEQIDNO：62的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(ii)包含SEQIDNO：33C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iii)包含SEQIDNO：36C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iv)包含SEQIDNO：37C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素MEDI1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(v)包含SEQIDNO：40C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；或，(vi)包含SEQIDNO：41C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在此披露的ADC分子包含被衍生化或连接(例如，化学地或重组地)至另一个分子(例如，肽、小药物分子、可检测分子等)上的在此披露的抗HER2结合分子(例如，结合与39S抗体相同表位或从39S抗体中衍生的抗体或其HER2结合片段、或在此披露的双特异性抗HER2抗体)中的至少一种。通常，抗HER2抗体或其部分被衍生化使得它们的HER2结合不受衍生化或标记的不利影响。因此，本披露的抗HER2抗体和抗体部分意图包括在此描述的抗HER2结合分子的完整形式和修饰形式两者。例如，在此披露的抗HER2结合分子或其HER2结合部分可以被功能连接(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合、或以另外的方式)至一个或多个其他分子实体上，诸如细胞毒性剂、药物试剂、检测剂、和/或可以介导该抗HER2结合分子与另一个分子(诸如抗生物素蛋白链菌素核心区或聚组氨酸标签)的缔合的蛋白质或肽。一种类型的衍生化的分子可以通过交联两个或更多个分子实体例如在此披露的抗HER2结合分子和治疗部分(例如，细胞毒素诸如微管溶素1508)来产生。适合的交联剂包括杂双官能性(即，具有被适当的间隔物分开的两个不同反应性基团)的那些(例如，间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)；或同双官能性的那些(例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)。此类交联剂可例如购自Pierce化学公司，罗克福德(Rockford)，II。另外的双官能偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚胺基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚胺酸酯的双官能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酸亚氨酯)、活性酯类(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双-叠氮化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(诸如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)、以及双-活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。另一种类型的衍生化的分子可以通过掺入可检测标记来产生。有用的检测剂包括荧光化合物(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等)、可用于检测的酶类(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)、由二级报告分子识别的表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些方面中，可检测标记可以通过至少一个间隔物臂来附接。间隔物臂可以具有不同的长度以便减少潜在的空间位阻。抗HER2结合分子还可以用放射性标记的氨基酸来标记。放射性标记可以用于诊断目的和治疗目的两者。例如，放射性标记可以用来通过X-射线或其他诊断技术诸如正电子发射断层摄影术(PET)来检测HER2表达的细胞。此外，放射性标记可以被治疗用作HER2表达的细胞的毒素，诸如引起不希望的免疫应答的那些。多肽的标记的实例包括，但不限于以下放射性同位素或放射性核素：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I以及131I。在一些方面中，该抗HER2结合分子可以用在成像时可检测的顺磁性、放射性或发荧光的离子来标记。在一些方面中，该顺磁性离子是铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。在其他方面中，该放射性离子是碘-123、锝-99、铟-111、铼-188、铼-186、铜-67、碘-131、钇-90、碘-125、砹-211、以及镓-67。在其他方面中，该抗HER2结合分子用X-射线成像剂来标记，诸如镧(III)、金(III)、铅(II)、以及铋(III)。抗HER2结合分子还可以用化学基团例如聚合物诸如聚乙二醇(PEG)、甲基基团、乙基基团、或碳水化合物基团来衍生化。这些基团有用于改进抗体的生物特征，例如增加血清半衰期或增加组织结合。如在此所使用的术语“细胞毒性剂”被广泛地定义并且是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏(细胞死亡)和/或施加抗肿瘤/抗增殖作用的物质。例如，细胞毒性剂直接或间接防止赘生性肿瘤细胞的发展、突变、或扩散。该术语还包括仅引起细胞抑制作用而无纯粹的细胞毒性作用的此类试剂。该术语包括如下说明的化疗剂、以及其他HER2拮抗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白质激酶A抑制剂、细胞因子家族的成员、放射性同位素、以及毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素。术语“化疗剂”是包括天然或合成化学化合物的术语“细胞毒性剂”的子集。化疗剂或试剂的实例包括烷基化剂，例如氮芥、亚乙基亚胺化合物、烷基磺酸盐以及具有烷基化行为的其他化合物，诸如亚硝基脲、顺铂以及达卡巴嗪；抗代谢物，例如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂，例如长春花生物碱和鬼臼毒素的衍生物；细胞毒性抗生素和喜树碱衍生物。其他化疗剂是氨磷汀顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(mechlorethamine)(氮芥(nitrogenmustard))、链脲霉素、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、阿霉素()、阿霉素脂质体吉西他滨()、柔红霉素、柔红霉素脂质体丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春花碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇()、多西他赛阿地白介素、门冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、吉非替尼()、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、关司钠、干扰素α、干扰素β、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康、利普安、甲地孕酮、关法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、米托坦、培加帕酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链脲霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫代乌嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥芳香化酶抑制剂、以及其组合。IV.A微管溶素在一些方面中，该ADC包含轭合至一个或多个微管溶素分子上(参见以下微管溶素A和微管溶素1508的结构)的在此披露的抗HER2结合分子(例如，39S抗体或其衍生物、或在此披露的双特异性抗HER2抗体中的一种)。微管溶素是从粘细菌物种中分离的一类天然产物的成员(萨斯(Sasse)等人，抗生素杂志(J.Antibiot.)53：879-885(2000))。作为细胞骨架相互作用剂，微管溶素是抑制微管蛋白聚合并且引起细胞周期停止和细胞凋亡的有丝分裂毒剂(施泰因梅茨(Steinmetz)等人，德国应用化学(Chem.Int.Ed.)43：4888-4892(2004)；卡里尔(Khalil)等人，生物化学(ChemBioChem.)7：678-683(2006)；考尔(Kaur)等人，生物化学杂志(Biochem.J.)396：235-242(2006))。微管溶素是超越任何临床相关的传统化疗剂(例如，埃坡霉素、紫杉醇、以及长春花碱)的细胞生长抑制的极其有效的细胞毒性分子。此外，它们对多药物抗性的细胞系是有效的(多姆灵(Domling)等人，分子多样性(Mol.Diversity)9：141-147(2005))。这些化合物对具有低皮摩尔范围内的ICs0值的一组癌症细胞系示出所测试的高细胞毒性；因此，它们作为抗癌治疗剂是感兴趣的。参见，例如WO2012019123，该专利通过引用以其全文结合在此。微管溶素轭合物被披露于例如美国专利号7,776,814中。在一些方面中，该微管溶素分子或其衍生物是前药。IV.B美登素和美登木素生物碱在一些方面中，该ADC包含轭合至一个或多个关登木素生物碱分子上的在此披露的抗HER2结合分子(例如，39S抗体或其衍生物、或在此披露的双特异性抗HER2抗体中的一种)。关登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。关登素首先是从东非灌木齿叶关登木(Maytenusserrata)中分离的(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生关登木素生物碱，诸如关登醇和C-3关登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成关登醇及其衍生物和类似物被披露于例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；以及4,371,533中。关登木素生物碱药物部分在抗体药物轭合物中是有吸引力的药物部分，因为它们：(i)通过发酵或化学改性、衍生化发酵产物相对易于制备，(ii)适于使用适合从非二硫化物接头轭合至抗体的官能团进行衍生化，(iii)在血浆中稳定的，并且(iv)对各种肿瘤细胞系有效的。含有关登木素生物碱的免疫轭合物、制备这些免疫轭合物的方法、以及这些免疫轭合物的治疗用途被披露于例如美国专利号5,208,020、5,416,064以及欧洲专利EP0425235B1；刘(Liu)等人，美国科学院院刊93：8618-8623(1996)(描述包含称为DM1的关登木素生物碱的免疫轭合物)；以及查丽(Chari)等人，癌症研究52：127-131(1992)中。曲妥珠单抗emtansine(ado-曲妥珠单抗emtansine，T-DM1，商品名)是由轭合至关登木素生物碱关登素(DM1)上的单克隆抗体曲妥珠单抗组成的抗体-药物轭合物。参见，例如洛鲁索(LoRusso)等人，临床癌症研究(Clin.CancerRes.)20：6437-47(2011)，该参考文献通过引用以其全文结合在此。工程化的硫代-曲妥珠单抗-DM1ADC还被描述于朱那托尔(Junutual)等人，临床癌症研究16：4769-78(2010)中，该参考文献通过引用以其全文结合在此。抗体-关登木素生物碱轭合物通过将抗体化学连接至关登木素生物碱分子上而不明显减弱该抗体或该关登木素生物碱分子的生物活性来制备。参见，例如美国专利号5,208,020。每个抗体分子轭合平均3-4个关登木素生物碱分子在增强靶细胞的细胞毒性方面显示功效而不负面影响该抗体的功能或溶解性，虽然毒素/抗体的即使一个分子将预期在使用裸抗体过程中增强细胞毒性。关登木素生物碱是本领域中熟知的并且可以通过已知的技术来合成或从天然来源中分离。适合的关登木素生物碱被披露于例如美国专利号5,208,020中。在一些方面中，该关登木素生物碱分子、其变体或衍生物是前药。IV.C奥瑞他汀和多拉司他汀在一些方面中，该ADC包含轭合至多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物和衍生物、奥瑞他汀上(美国专利号5,635,483；5,780,588)的在此披露的抗HER2结合分子(例如，39S抗体或其衍生物、或在此披露的双特异性抗HER2抗体中的一种)。显示多拉司他汀和奥瑞他汀干扰微管动力学、GTP水解以及细胞核和细胞分裂(沃克(Woyke)等人，抗微生物制剂和化学疗法(Antimicrob.AgentsandChemother.)45：3580-3584(2001))并且具有抗癌活性(美国专利号5,663,149)。多拉司他汀或奥瑞他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端被附接至抗体上(参见，例如WO2002088172)。在一些方面中，该奥瑞他汀或多拉司他汀分子、其变体或衍生物是前药。IV.D卡奇霉素在一些方面中，该ADC包含轭合至一个或多个卡奇霉素分子上的在此披露的抗HER2结合分子(例如，39S抗体或其衍生物、或在此披露的双特异性抗HER2抗体中的一种)。抗生素的卡奇霉素家族成员能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。卡奇霉素是从细菌棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)中衍生的一类烯二炔抗生素，其中卡奇霉素γ1是最著名的。其他卡奇霉素是β1Br、γ1Br、a2I、α3I、β1I、γ1I、以及Δ1I。参见，李(Lee)等人，抗生素杂志(JournalofAntibiotics)42(7)：1070-87(1989)。对于卡奇霉素家族的轭合物的制备，参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296。可以使用的卡奇霉素的结构类似物包括，但不限于γ1I、a2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG以及θ11(欣曼(Hinman)等人，癌症研究53：3336-3342(1993)，洛得(Lode)等人，癌症研究58：2925-2928(1998)以及前面提到的美国氰胺公司(AmericanCyanamid)的美国专利)。在一些方面中，该卡奇霉素分子、其变体或衍生物是前药。IV.E多卡米素在一些方面中，该ADC包含轭合至一个或多个多卡米素分子上的在此披露的抗HER2结合分子(例如，39S抗体或其衍生物、或在此披露的双特异性抗HER2抗体中的一种)。多卡米素是首先从链霉菌属中分离的一系列相关天然产物的成员并且它们是有效的抗肿瘤抗生素。参见博格(Boger)(1991)Chemtracts：有机化学(Chemtracts：OrganicChemistry)4(5)：329-349(1991)；特塞尔(Tercel)等人，英文国际版化学杂志(Chem.Int.Ed.Engl.)52(21)：5442-6(2013)；博格和道格拉斯(Douglas)，美国科学院院刊92(9)：3642-3649(1995)；卡恰里(Cacciari)等人，治疗术专利专家评论(ExpertOpiniononTherapeuticPatents)10(12)：1853-71(2000)。天然多卡米素包括多卡米素A、多卡米素B1、多卡米素B2、多卡米素C1、多卡米素C2、多卡米素D、多卡米素SA、以及CC-1065。合成类似物包括阿多来新、比折来新、以及卡折来新(U-80244)。在一些方面中，该多卡米素分子、其变体或衍生物是前药。IV.F吡咯并苯并二氮杂在一些方面，该药物是吡咯并苯并二氮杂(PBD)。PBD是相对小的分子并且一些具有识别且共价结合至DNA小沟中的特定序列的能力，并且因此展现出抗生素/抗肿瘤活性。许多PBD及其衍生物是本领域中已知的，例如PBD二聚体(例如，SJG-136或SG2000)、C2-不饱和的PBD二聚体、带有C2芳基取代的吡咯并苯并二氮杂二聚体(例如，SG2285)、通过水解活化的PBD二聚体前药(例如，SG2285)、以及聚吡咯-PBD(例如，SG2274)。WO2000/012507、WO2007/039752、WO2005/110423、WO2005/085251以及WO2005/040170以及美国专利号7,612,062PBD进一步描述了PBD，这些专利中的每一个通过引用以其全文结合在此。IV.G其他细胞毒性剂在一些方面中，该ADC包含轭合至其他抗肿瘤剂例如BCNU、蒽环类(例如，e.g.，道诺霉素或阿霉素)、紫杉烷类(例如，紫杉醇)、链佐星、长春花生物碱(例如，长春新碱)、5-氟尿嘧啶、共同作为LL-E33288复合体已知的试剂的家族(参见美国专利号5,053,394和5,770,710)、埃斯波霉素(参见美国专利号5,877,296)上的在此披露的抗HER2结合分子(例如，39S抗体或其衍生物、或在此披露的双特异性抗HER2抗体中的一种)。该ADC还可以包含轭合至酶促活性毒素及其片段上的在此披露的抗HER2结合分子(例如，39S抗体或其衍生物、或在此披露的双特异性抗HER2抗体中的一种)，可以使用的这些酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII、以及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、以及单端孢霉烯类。参见，例如WO199321232。在一些方面中，该细胞毒性剂是光活化药物。V.结合至与39S抗体相同表位的抗HER2结合分子在另一个方面中，本披露提供结合至与39S抗体相同的一个或多个表位的抗HER2结合分子(例如，从39S抗体中衍生的抗体或其抗原结合片段、双特异性抗HER2抗体、或ADC)。结合至与39S抗体相同表位的此类抗HER2结合分子可以基于它们在标准HER2结合测定中与39S抗体交叉竞争(例如，以统计学显著的方式竞争性地抑制结合)的能力来进行鉴定。因此，在一个方面中，本披露提供与39S抗体或其抗原结合片段竞争结合至HER2的抗HER2结合分子(例如，从39S抗体中衍生的抗体或其抗原结合片段、双特异性抗HER2抗体、或ADC)。测试抗体抑制例如39S抗体或从39S抗体中衍生的结合分子(例如，双特异性抗体或ADC)的结合的能力证实了该测试抗体可以与39S抗体竞争结合至HER2；此种抗HER2结合分子可以根据非限制性理论结合至与其竞争的与39S抗体或其抗原结合片段相同或相关(例如，结构上类似或空间上接近)的HER2上的表位。在一个方面中，结合至与39S抗体或从39S抗体中衍生的结合分子相同的HER2上的表位的该抗HER2分子是人单克隆抗体或其抗原结合片段、双特异性抗HER2抗体(例如，包含两个HER2结合区的双特异性抗体，这两个HER2结合区中的至少一个识别与39S抗体相同的表位)、或ADC(例如，包含识别与39S相同表位的至少一个抗原结合部分的ADC；或包含包含有两个HER2结合区的双特异性抗体的ADC，这两个HER2结合区中的至少一个识别与39S抗体相同的表位)。VI.抗HER2结合分子的作用机制本披露提供包含结合与1.39.1或39S抗体相同表位或从1.39.1或39S抗体中衍生的HER2结合结构域的抗HER2结合分子(例如，双特异性抗HER2抗体、或ADC)，其中此类抗HER2结合分子在结合至该HER2靶标时诱导内化。还提供包含结合与1.39.1或39S抗体相同表位或从1.39.1或39S抗体中衍生的HER2结合结构域的抗HER2结合分子(例如，双特异性抗HER2抗体、或ADC)，其中此类抗HER2结合分子在内化之后促进有效的溶酶体运输。本披露还提供包含结合与1.39.1或39S抗体相同表位或从1.39.1或39S抗体中衍生的HER2结合结构域的抗HER2结合分子(例如，双特异性抗HER2抗体、或ADC)，其中此类抗HER2结合分子诱导HER2靶标内化和/或降解。在一些方面中，在此披露的抗HER2结合分子可以诱导、阻断、或压制HER2磷酸化。在其他方面中，在此披露的抗HER2结合分子可以诱导、阻断、或压制配体诱导的AKT磷酸化。在一些方面中，该抗HER2结合分子可以诱导、阻断、或压制低HER2表达癌症细胞中的配体诱导的AKT磷酸化。在还其他方面中，本披露中所披露的抗HER2结合分子例如抗HER2抗体或其抗原结合片段可以诱导、破坏、或压制配体诱导的HER2-HER3二聚化。在一些方面中，包含在此披露的抗HER2结合分子的ADC可以抑制癌症干细胞(CSC)球体形成和/或增殖。在一些方面中，在此披露的抗HER2结合分子展现出对CSC的细胞毒性作用。在一些方面中，包含在此披露的抗HER2结合分子的ADC可以在表达低水平HER2的肿瘤中抑制肿瘤生长和/或诱导肿瘤消退(例如，通过HercepTest的+1至+2)。在某些方面中，包含在此披露的抗HER2结合分子的ADC可以在对T-DMl有抗性的肿瘤中抑制肿瘤生长和/或诱导肿瘤消退。在一些方面中，HER2结合分子例如抗HER2抗体或其抗原结合片段缺乏ADCC活性。在特定方面中，抗HER2结合分子例如抗HER2抗体或其抗原结合片段可以通过配体非依赖性作用机制降低或压制HER2磷酸化、AKT磷酸化和/或肿瘤集落形成。VII.抗HER2结合分子的制备可以根据本领域中已知的方法来制备本披露的抗HER2结合分子(例如，结合与1.39.1或39S抗体相同表位或从1.39.1或39S抗体中衍生的抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体以及包含这些抗体的ADC)。例如，使用诸如由科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)自然256：495所描述的那些杂交瘤方法来产生在此披露的结合与39S抗体相同表位的抗HER2结合分子。使用该杂交瘤方法，小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物被如上所述免疫成诱导通过抗体的淋巴细胞进行的产生，这些淋巴细胞将特异性结合至免疫抗原。淋巴细胞还可以被体外免疫。免疫之后，分离这些淋巴细胞并且使用例如聚乙二醇与适合的骨髓瘤细胞系融合，以便形成随后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选择离开的杂交瘤细胞。如通过免疫沉淀、免疫印迹、或通过体外结合测定(例如，放射免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))所确定的特异性针对所选择抗原的产生单克隆抗体的杂交瘤随后可以使用标准方法(高定(Goding)，单克隆抗体：原理和实践(MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice)，美国学术出版社，1986)在体外培养物中或在体内作为动物中的腹水肿瘤来繁殖。这些单克隆抗体随后可以对于上述的多克隆抗体从所述的培养基或腹水中纯化出来。还可以使用如在美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法来制备本披露的抗HER2结合分子(例如，结合与1.39.1或39S抗体相同表位或从1.39.1或39S抗体中衍生的抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体以及包含这些抗体的ADC)。诸如通过使用特异性扩增编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸引物的RT-PCR，将编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟B细胞或杂交瘤细胞中分离出来，并且使用常规程序确定它们的序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，当转染时这些表达载体进入不另外产生免疫球蛋白的蛋白质的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，通过这些宿主细胞来产生单克隆抗体。同样，如所述的可以将希望物种的重组抗HER2单克隆抗体或其包含抗原结合片段的分子从表达希望物种的CDR的噬菌体展示文库中分离出来(麦卡弗蒂(McCafferty)等人，自然348：552-554(1990)；克莱森(Clarkson)等人，自然352：624-628(1991)；以及马克斯(Marks)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991))。可以使用重组DNA技术以多种不同方式进一步修饰编码本披露的抗HER2结合分子的一种或多种多核苷酸(例如，结合与39S抗体相同表位或从39S抗体中衍生的抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体以及包含这些抗体的ADC)，以便产生替代的抗HER2结合分子。在一些方面中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被取代成(1)例如人抗体的那些区以便产生嵌合抗体或(2)非免疫球蛋白多肽以便产生融合抗体。在一些方面中，恒定区被截断或去除以产生单克隆抗体的希望的抗体片段。可变区的定点或高密度诱变可以被用来优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。在某些方面中，本披露的抗HER2结合分子是人抗体或其抗原结合片段。人抗体可以使用本领域中已知的不同技术来直接制备。可以产生体外免疫或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体中分离的永生化人B淋巴细胞(参见，例如科尔(Cole)等人，单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy)，阿兰R.丽丝(AlanR.Liss)，第77页(1985)；波伊默(Boemer)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)47：86-95(1991)；以及美国专利号5,750,373)。然后可以制备在永生化人B淋巴细胞中编码抗体的一个或多个cDNA并且插入表达载体和/或异源宿主细胞中以便用于表达抗体的非天然存在的重组形式。同样，抗HER2人抗体或其抗原结合片段可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库将人抗体或其片段表达为具有异源噬菌体蛋白质的融合蛋白，如例如在沃恩(Vaughan)等人，自然-生物技术(Nat.Biotech.)14：309-314(1996)；希茨(Sheets)等人，美国科学院院刊95：6157-6162(1998)；霍金布姆(Hoogenboom)和温特(Winter)，分子生物学杂志227：381(1991)以及马克斯等人，分子生物学杂志222：581(1991))中所述。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还被描述于美国专利号5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；以及7,264,963中，这些美国专利中的每一个通过引用以其全文结合。亲和力成熟策略和链改组策略(马克思等人，生物技术(BioTechnology)10：779-783(1992)，该参考文献通过引用以其全文结合)是本领域中已知的，并且可以被用来产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，本披露的抗HER2结合分子可以是人源化抗体。也可以使用用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法并且这些方法是本领域中熟知的。人源化、表面重修或类似工程化的抗体可以具有来自非人来源例如但不限于小鼠、大鼠、非人灵长类动物或其他哺乳动物的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基被经常称为“输入”残基的残基替换，这些输入残基典型地取自已知人序列的“输入”可变、恒定或其他结构域。此类输入的序列可以被用来降低免疫原性或降低、增强或改进结合、亲和力、开(on)速率、关(off)速率、亲合力、特异性、半衰期、或本领域中所知的任何其他适合的特征。通常，CDR残基是直接和最主要地参与影响HER2结合的。因此，非人或人CDR序列的部分或全部被维持而可变区和恒定区的非人序列可以用人或其他氨基酸替换。在某些方面中，人CDR被插入非人抗体支架中以便在动物模型系统中制备具有降低免疫原性的抗体，例如“鼠源化”抗体。抗HER2结合分子例如抗体可以任选地被人源化、表面重修、或工程化，其中保留对抗原HER2的高亲和力和其他有利的生物特性。为了实现这个目标，人源化(或人)或工程化的抗HER2抗体和表面重修的抗体可以任选地通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型对亲本序列和不同概念人源化和工程化产物进行分析的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是普遍可得到的并且是本领域技术人员熟知的。例证和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可用的。对这些展示的检查容许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原诸如HER2能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入序列中选择并合并构架残基以使得实现希望的抗体特征，诸如对一个或多个靶抗原的亲和力增加。对在此披露的抗HER2结合分子的人源化、表面重修或工程化可以使用任何已知的方法来进行，诸如但不限于描述于以下参考文献中的那些：琼斯等人，自然321：522(1986)；瑞彻曼等人，自然332：323(1988)；威霍英等人，科学239：1534(1988))、斯姆斯(Sims)等人，免疫学杂志151：2296(1993)；乔西亚和莱斯克，分子生物学杂志196：901(1987)、卡特等人，美国科学院院刊89：4285(1992)；普雷斯塔(Presta)等人，免疫学杂志151：2623(1993)、美国专利号5,639,641；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567；7,557,189；7,538,195；以及7,342,110；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；以及EP229246，这些参考文献中的每一个通过引用整体结合在此，包括其中引用的参考文献。在某些方面中，提供抗HER2抗体片段。已知不同技术用于产生抗体片段。在传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化而衍生的(例如森本晃司(Morimoto)等人，生物化学与生物物理杂志方法(J.Biochem.Biophy.Methods)24：107-117(1993)；布伦南(Brennan)等人，科学，229：81(1985))。在某些方面中，重组产生抗HER2抗体片段。所有Fab、Fv和scFv抗体片段都可以表达在大肠杆菌或其他宿主细胞中并且从其分泌，因而允许产生大量的这些片段。还可以从以上讨论的抗体噬菌体文库中分离此类抗HER2抗体片段。这些抗HER2抗体片段还可以是如在美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。技术可以适用于产生对与39S抗体相同HER2表位有特异性的单链抗体(参见，例如美国专利号4,946,778)。另外，方法可以适用于构建Fab表达文库(参见，例如休斯(Huse)等人，科学246：1275-1281(1989))以便允许快速和有效的鉴定对HER2、或其衍生物、片段、类似物或同源物具有希望的特异性的单克隆Fab片段。抗体片段可以通过本领域的技术来产生，这些抗体片段包括但不限于：(a)由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段；(b)由还原F(ab′)2片段的二硫化物桥键产生的Fab片段；(c)由使用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段以及(d)Fv片段。在一些方面中，尤其在抗体片段的情况下，抗HER2抗体或其抗原结合片段可以被修饰以便增加它的血清半衰期。这可以例如通过以下方式来实现：通过突变抗体或抗体片段中的适当的区域将补救受体结合表位掺入抗体或抗体片段中或通过将表位掺入随后融合至任一端或在中间处的抗体或抗体片段的肽标签中(例如，通过DNA或肽合成)、或通过YTE突变。增加抗体或其抗原结合片段的血清半衰期的其他方法(例如，轭合至异源分子诸如PEG)是本领域中熟知的。杂轭合物抗HER2结合分子例如在此披露的结合与39S抗体相同表位或从39S抗体中衍生的双特异性抗体或ADC可以使用重组生物学技术以及体外使用合成蛋白质化学方面的方法(包括涉及交联剂的那些)来制备。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来化学构建双特异性抗体或ADC。出于这个目的的适合试剂是本领域中已知的，并且包括亚氨基硫醇酯和4-巯基丁亚胺酸甲酯。应当指出的是在某些方面中，抗HER2结合分子可以被工程化成直接将CH3结构域融合至对应修饰的抗体或其片段的铰链区。在其他构建体中，肽间隔物可以被插入在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可以表达相容的构建体，其中CH2结构域已缺失并且剩余的CH3结构域(修饰或未修饰的)使用5-20个氨基酸的间隔物而连接至铰链区。可以例如添加这样一种间隔物以便确保恒定结构域的调节元件保持游离并且可接近或确保铰链区保持柔性。然而，应当指出氨基酸间隔物可在一些情况下被证明是免疫原性的并且针对构建体引发不希望的免疫应答。因此，在某些方面中，添加至构建体的任何间隔物将是相对非免疫原性的，或甚至总体上省略的，以便维持修饰抗体的希望的生物化学品质。除了缺失整个恒定区结构域之外，应当了解抗HER2结合分子可以通过部分缺失或取代几个或甚至单个氨基酸来提供。例如，对CH2结构域的选择区域中的单个氨基酸进行突变可足以基本上降低Fc结合并且因而增加肿瘤定位。此外，如上所暗示，披露的抗HER2结合分子的恒定区可以通过突变或取代增强所得构建体的特征(profile)的一个或多个氨基酸来修饰。在这个方面，可能破坏由保守结合位点(例如，Fc结合)提供的活性而维持修饰的抗体或其抗原结合片段的构象和免疫原性特征。某些方面可以包括将一个或多个氨基酸添加至恒定区以便增强希望的特征诸如降低或增加效应子功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物附接。在此类方面中，从选择的恒定区结构域中衍生的特定序列可以被插入或复制。VIII.编码HER2结合分子的多核苷酸在某些方面中，本披露提供包含编码特异性结合HER2的在此披露的抗HER2结合分子的核酸序列的多核苷酸。例如，本披露提供包含编码抗HER2结合分子诸如抗体或其片段(例如，结合与39S抗体相同表位或从39S抗体中衍生的分子)的核酸序列的多核苷酸。本披露的多核苷酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA、以及合成DNA；并且可以是双链或单链的，并且如果是单链的，可以是编码链或非编码(反义)链。在某些方面中，该DNA是用来产生非天然存在的重组抗体的cDNA。在某些方面中，这些多核苷酸是分离的。在某些方面中，这些多核苷酸是基本上纯的。在某些方面中，这些多核苷酸包含被融合在与例如辅助从宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸(天然或异源的)相同阅读构架中的成熟多肽的编码序列(例如，用作控制多肽从细胞运输的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白并且可以具有由宿主细胞裂解的前导序列以便形成多肽的成熟形式。这些多核苷酸还可以编码作为成熟蛋白加上另外的5′氨基酸残基的抗HER2结合分子前蛋白。在某些方面中，这些多核苷酸被改变成针对某一宿主细胞优化密码子使用。在某些方面中，这些多核苷酸包含被融合在与异源标记序列相同阅读构架中的成熟抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其抗原结合片段)的编码序列，该异源标记序列允许例如纯化编码的多肽。例如，该标记序列可以是例如由pQE-9载体供应的以便提供在细菌宿主的情况下融合至标记物的成熟多肽的纯化的六组氨酸(His6)标签。在其他方面中，该标记序列可以是在使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，例如从流感血凝素蛋白中衍生的血凝素(HA)标签。本披露进一步涉及例如编码本披露的抗HER2结合分子的HER2结合片段、类似物、以及衍生物的所述多核苷酸的变体。这些多核苷酸变体可以在编码区、非编码区、或两者中含有改变。在一些方面中，这些多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失的改变，但不改变编码的多肽的特性或活性。在一些方面中，通过由于遗传密码的简并性引起的沉默取代来产生核苷酸变体。可以出于各种原因来产生多核苷酸变体，例如为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主诸如大肠杆菌优选的那些)。还提供包含在此描述的多核苷酸的载体和细胞。在一些方面中，编码抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其抗原结合片段)的DNA序列可以通过化学合成，例如使用寡核苷酸合成仪来构建。可以基于希望多肽的氨基酸序列并且选择有利于其中将产生感兴趣重组多肽的宿主细胞的那些密码子来设计此类寡核苷酸。标准方法可以适用于合成编码感兴趣的分离多肽的分离多核苷酸序列。例如，可以使用完整的氨基酸序列来构建反向翻译的基因。此外，可以合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA低聚物。例如，可以合成编码希望多肽的部分的若干小寡核苷酸并且然后进行连接。各个寡核苷酸典型地含有用于互补组装的5′或3′突出端。一旦组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码感兴趣的特定分离多肽的多核苷酸序列将被插入表达载体中并且可操作地连接至适用于在希望的宿主中表达蛋白质的表达控制序列上。合适的组装可以例如通过核苷酸测序、限制性图谱以及在适合宿主中表达生物活性多肽来证实。正如本领域中熟知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因必须可操作地连接至在选择的表达宿主中有功能性的转录和翻译表达控制序列上。在某些方面中，重组表达载体被用来扩增和表达编码抗HER2结合分子的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，这些DNA构建体具有编码例如抗HER2抗体或和其抗原结合片段的多肽链、可操作地连接至从哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因中衍生的适合转录或翻译调节元件上的合成或cDNA衍生的DNA片段。转录单元通常包括对以下各项的组装：(1)在基因表达方面具有调节作用的基因元件或多个元件，例如转录启动子或增强子，(2)被转录到mRNA中并且翻译成蛋白质的结构或编码序列，以及(3)如下详细所述的适当转录和翻译起始序列和终止序列。此类调节元件可以包括控制转录的操纵子序列。可以另外地掺入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力、以及促进识别转化体的选择基因。当DNA区是功能上彼此相关的时候，它们可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导)的DNA被表达为参与多肽分泌的前体，则它可操作地连接至多肽的DNA上；如果启动子控制序列的转录，则它可操作地连接至编码序列上；或如果核糖体结合位点为了容许翻译而定位，则它可操作地连接至编码序列上。意图用于酵母表达系统中的结构元件包括能实现通过宿主细胞细胞外分泌翻译的蛋白质的前导序列。可替代地，在不使用前导或运输序列表达重组蛋白的情况下，它可以包括N-末端的甲硫氨酸残基。这个残基可以任选地随后从表达的重组蛋白中裂解，以便提供最终产物。表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以采用各种各样的表达宿主/载体组合。对于真核宿主的有用表达载体包括例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主的有用表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生物、更宽宿主范围的质粒，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。用于表达抗HER2结合分子(例如抗HER2抗体或其抗原结合片段)的适合宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核细胞、酵母、昆虫或更高等真核细胞。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或细菌。更高等真核细胞包括如下所述已确立的哺乳动物来源的细胞系。还可以采用无细胞的翻译系统。用于与细菌、真菌、酵母以及哺乳动物细胞宿主一起使用的适当克隆和表达载体由泊威斯(Pouwels)等人(克隆载体：实验室手册(CloningVectors：ALaboratoryManual)，纽约，爱思唯尔(Elsevier，N.Y.)，1985)所述，该参考文献的相关披露内容特此通过引用结合。关于蛋白质产生(包括抗体产生)的方法的另外信息可见于例如关国公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501、以及国际专利公开号WO04009823中，这些专利中的每一个特此通过引用以其全文结合。还可以有利地采用不同哺乳动物或昆虫细胞培养物系统来表达重组抗HER2结合分子，例如抗HER2抗体或其抗原结合片段。可以进行哺乳动物细胞中的重组蛋白的表达，因为此类蛋白质通常是正确折叠、适当修饰并且完全有功能的。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T，由格祖曼(Gluzman)(细胞(Cell)23：175，1981)所述的COS-7猴肾脏细胞系；以及其他细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO、HeLa、以及BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制起点、连接至有待表达的基因上的适合启动子和增强子、及其他5′或3′侧翼非转录序列、以及5′或3′非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统由卢科(LuckoW)和萨默斯(Summers)，生物技术6：47(1988)进行了综述。可以根据任何适合的方法来纯化由转化的宿主产生的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其抗原结合片段)。此类标准方法包括，例如色谱法(例如，离子交换、亲和力以及定大小柱色谱法)、离心、差别溶解性、或通过蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和力标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列、谷胱甘肽S-转移酶等可以被附接至蛋白质上，以便允许通过在适当亲和力柱上穿过而简单纯化。还可以使用例如蛋白水解、核磁共振或x-射线结晶学来物理表征分离蛋白质。例如，可以首先使用商业上可获得的蛋白质浓缩过滤器例如或Millipore超滤单元来浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液。在浓缩步骤之后，可以将浓缩物施加至适合的纯化基质中。可替代地，可以采用阴离子交换树脂，例如具有侧链二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。这些基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或常用于蛋白质纯化的其他类型。可替代地，可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括包含磺基丙基或羧甲基基团的不同不溶性基质。最后，可以采用使用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有侧链甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱法(RP-HPLC)步骤来进一步纯化HER2结合分子。还可以不同的组合采用前述纯化步骤中的一些或全部来提供均质重组蛋白。可以例如通过初始从细胞沉淀物中提取、接着进行一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或大小排阻色谱法步骤来分离在细菌培养物中产生的重组抗HER2结合分子，例如抗HER2抗体或其抗原结合片段。可以采用高效液相色谱法(HPLC)用于最终的纯化步骤。在重组蛋白的表达中采用的微生物细胞可以通过任何合宜方法来破坏，包括冻融循环、超声、机械破坏、或使用细胞裂解剂。本领域中已知的用于纯化抗体和其他蛋白质的方法还包括例如描述于美国专利公开号US20080312425、US20080177048以及US20090187005中的那些，这些专利中的每一个特此通过引用以其全文结合。IX.使用治疗性抗HER2结合分子的治疗方法本披露还提供涉及使用抗HER2结合分子(例如抗体，包括其抗原结合片段、变体以及衍生物)来治疗患有与HER2表达或HER2表达细胞相关联的疾病的患者的方法。“HER2表达细胞”意指表达HER2蛋白的细胞。用于检测和/或定量细胞中的HER2表达的方法是本领域中熟知的，并且包括但不限于PCR技术、免疫组织化学(例如，HerceptestTM)、流式细胞术、蛋白质印迹、ELISA等。在一些方面中，在此披露的方法适用于其中癌症细胞以低水平表达HER2的治疗和诊断方法。用于使用在此披露的抗HER2结合分子诊断和治疗不同疾病和病症的方法是指保留本披露的抗HER2结合分子的希望特性的抗HER2抗体(例如，39S抗体、变体、衍生物、以及HER2结合片段；本披露的双特异性抗HER2分子；以及本披露的ADC分子)例如能够特异性结合HER2并且中和HER2活性。在一些方面中，抗HER2结合分子是介导人ADCC的人或人源化抗HER2结合分子；或包括介导ADCC的已知抗HER2抗体；或包括工程化成使得它们介导ADCC的抗HER2结合分子。在一些方面中，抗HER2结合分子是不介导人ADCC的人或人源化抗HER2结合分子；或包括不介导ADCC的已知抗HER2抗体；或包括工程化成使得它们不介导ADCC的抗HER2结合分子。在一个方面中，治疗包括向受试者或患者施加或给予本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)，或向来自受试者或患者的分离组织或细胞系施加或给予该抗HER2结合分子，其中该受试者或患者具有疾病、疾病的症状、或易患疾病的倾向。在另一个方面中，治疗还意图包括向受试者或患者施加或给予包含本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)的药物组合物，或向来自受试者或患者的分离组织或细胞系施加或给予包含抗HER2结合分子的药物组合物，该受试者或患者具有疾病、疾病的症状、或易患疾病的倾向。本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)有用于治疗不同癌症。在一个方面中，本披露涉及用作药剂、具体地用于治疗或预防癌症的抗HER2结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物。癌症的实例包括，但不限于乳癌、结肠癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、或前列腺癌。在一些特定情况下，如例如通过HERCEPTESTTM所确定，该癌症表达低水平的HER2。根据本披露的方法，如在此其他地方所定义的至少一种抗HER2结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)被用来促进关于癌症的阳性治疗应答。关于癌症治疗的术语“阳性治疗应答”是指改进与这些抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)的活性相关联的疾病，和/或改进与疾病相关联的症状。例如，疾病的改进可被表征为完全应答。术语“完全应答”是指使用对任何先前测试结果进行归一化而不存在临床可检测的疾病。可替代地，疾病的改进可被归类为部分应答。“阳性治疗应答”涵盖由给予本披露的抗HER2结合分子产生的降低或抑制癌症的进展和/或持续时间、降低或改善癌症的严重性、和/或改善其一种或多种症状。在特定方面中，此类术语是指在给予本披露的抗HER2结合分子之后的一种、两种或三种或更多种结果：(1)稳定、降低或消除癌症细胞群；(2)稳定或降低癌症生长；(3)损害癌症形成；(4)消灭、去除、或控制原发性、局部性和/或转移性癌症；(5)降低死亡率；(6)增加无疾病、无复发、无进展、和/或总体存活率、持续时间、或速率；(7)增加应答速率、应答持久性、或响应或处于缓解的患者数；(8)降低住院治疗率；(9)减小住院期；(10)维持癌症大小(例如，以体积计)并且不增加或增加小于10％、优选地小于5％、优选地小于4％、优选地小于2％，以及(11)增加处于缓解的患者数；(12)减少将另外地要求治疗癌症的辅助疗法(例如，化疗或激素疗法)数。临床应答可以使用筛选技术来评价，这些筛选技术诸如PET、磁共振成像(MRI)扫描、x-射线照相成像、计算机断层摄影(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活细胞分选仪(FACS)分析、组织学、粗略病理学、以及血液化学，包括但不限于通过ELISA、RIA、色谱法等可检测的变化。除了这些阳性治疗应答以外，经受使用抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)的疗法的受试者可以经历与疾病相关联的症状改进的有益作用。本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)可与任何已知的癌症疗法(包括已知有用、或已使用或目前正使用的任何试剂或试剂组合)组合使用，以便用于治疗癌症，例如结肠癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、以及乳癌。药物组合配制品或给药方案的第二试剂或试剂组合优选地具有与本披露的一种或多种抗HER2结合分子互补的活性，这样使得它们不会彼此不利地影响。抗癌剂包括用来治疗恶性肿瘤诸如癌性生长的药物。可以单独地、或与其他治疗诸如外科手术或放射疗法组合使用药物疗法。取决于涉及的器官性质，可以在癌症治疗中使用若干种类的药物。例如，乳癌通常通过雌激素来刺激，并且可以使用使性激素失活的药物来治疗。类似地，前列腺癌可以使用使雄激素(雄性激素)失活的药物来治疗。用于本披露的某些方法中的抗癌剂尤其包括抗体(例如，结合IGF-IR的抗体、结合EGFR的抗体、结合HER2或HER3的抗体)、靶向IGFIR的小分子、靶向EGFR的小分子、靶向HER2的小分子、抗代谢物、烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管靶向剂、激酶抑制剂、蛋白质合成抑制剂、免疫治疗剂、激素疗法、糖皮质激素、芳香酶抑制剂、mTOR抑制剂、化疗剂、蛋白激酶B抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、RLr9、CD289、酶抑制剂、抗TRAIL、MEK抑制剂等。在特定方面中，在此披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)可与靶向表皮生长因子受体(EGFR)的其他抗体或抗体片段(例如(西妥昔单抗)或帕尼单抗)组合给予。在其他方面中，在此披露的抗HER2结合分子可与激酶抑制剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)组合给予。在一些其他特定方面中，在此披露的抗HER2结合分子可与具有与EGFR和/或HER2/neu相关联的酪氨酸激酶活性的抑制剂(例如，拉帕替尼)组合给予。在一些方面中，本披露的抗HER2结合分子可与抗有丝分裂剂组合给予。在一些特定方面中，本披露的抗HER2结合分子可与稳定有丝分裂纺锤体微管组件的试剂(例如紫杉醇或多西他赛)组合给予。在组合疗法包括与另一种治疗剂给予组合而给予抗HER2结合分子的情况下，本披露的方法涵盖使用分开的配制品或单一药物配制品、以及以任一顺序的连续给予来进行的共同给予。在一些方面中，与其他药物组合给予在此描述的抗HER2结合分子，其中可依次、以任一顺序、或同时(即，同时地或在相同时间范围内)给予抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物以及一种或多种治疗剂。组合疗法可提供“协同作用”并且被证明是“协同的”，即，当一起使用活性成分时所实现的作用大于由分开使用化合物产生的作用的总和。当活性成分(1)共同配制和同时给予或递送在组合单位剂量配制品中；(2)作为分开的配制品通过交替或平行的方式递送；或(3)通过一些其他方案时，可获得协同作用。当以交替疗法递送时，当例如通过分开的注射器中的不同注射依次给予或递送化合物时，可获得协同作用。通常，在交替疗法的过程中，依次即连续给予每种活性成分的有效剂量，而在组合疗法中，一起给予两种或更多种活性成分的有效剂量。在一些方面中，可与生长因子受体(EGFR)抑制剂协同组合给予本披露的抗HER2结合分子，例如抗HER2抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，该EGFR抑制剂是抗体。在特定方面中，该EGFR抑制剂抗体是(西妥昔单抗)或(帕尼单抗)。在特定方面中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)可与具有与EGFR和/或HER2/neu相关联的酪氨酸激酶活性的抑制剂(例如，拉帕替尼)协同组合给予。在一些方面中，本披露的抗HER2结合分子可与抗有丝分裂剂协同组合给予。在一些特定方面中，该抗有丝分裂剂稳定有丝分裂纺锤体微管组件。在一些特定方面中，该抗有丝分裂剂是紫杉醇或多西他赛。另一方面是本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)用于诊断监测组织中的蛋白质水平的用途，该诊断监测作为临床测试程序中的一部分例如以便确定给定治疗方案的功效。例如，通过使抗体偶联到可检测物质上可促进检测。可检测物质的实例包括不同酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、以及放射性材料。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合体的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；适合的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。另一方面是本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)治疗对HER2靶向的治疗剂(例如靶向HER2的结构域IV内的表位的抗体诸如曲妥珠单抗)有抗性的癌症患者的用途。在一些方面中，该治疗剂包含靶向与曲妥珠单抗相同表位的部分、以及细胞毒性部分。在一些方面中，此种细胞毒性部分是美登木素生物碱。在一些特定方面中，该美登木素生物碱是DM-1。在一些方面中，在此披露的治疗方法包括给予抗HER2结合分子，该抗HER2结合分子是包含重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)的抗HER2抗体，该重链可变区和轻链可变区包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)；(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)；(iv)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(v)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及，(vi)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。在一些方面中，在此披露的治疗方法包括给予抗HER2结合分子，该抗HER2结合分子是包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域的双特异性抗HER2抗体，其中(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2抗体结合位点，(ii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第一HER2抗体结合位点，该第一HER2抗体结合位点包含HER2的结构域II内的表位，并且(iii)该第一HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点不同。在一些方面中，在此披露的治疗方法包括给予抗HER2结合分子，该抗HER2结合分子是包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，该重链可变区和该轻链可变区包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)；(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)；(iv)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(v)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及，(vi)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。在一些方面中，此种抗HER2结合分子的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含相对于包含VH(包含SEQIDNO：43的氨基酸)和VL(包含SEQIDNO：44的氨基酸)的免疫球蛋白抗原结合结构域的FW区不同的至少一个异源可变结构域构架区(FW)。在一些方面中，该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含：(i)包含SEQIDNO：11的氨基酸的可变轻链构架1(VL-FW1)；(ii)包含SEQIDNO：12的氨基酸的VL-FW2；(iii)包含SEQIDNO：13的氨基酸的VL-FW3；(iv)包含SEQIDNO：14的氨基酸的VL-FW4；或(vi)其任何组合。在一些方面中，此种抗HER2结合分子的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH包含SEQIDNO：15或43的氨基酸；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，此种抗HER2结合分子的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VL包含SEQIDNO：16或44的氨基酸；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。在一些方面中，此种抗HER2结合分子的该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸；并且其中该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸。在一些方面中，此种抗HER2结合分子的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域(a)特异性结合至与曲妥珠单抗抗体相同的HER2表位；和/或(b)通过曲妥珠单抗抗体竞争性地抑制HER2结合；和/或(c)包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个互补决定区(CDR)，这些互补决定区包含SEQIDNO：54至59中的任一个的氨基酸。在一些方面中，此种抗HER2结合分子的该第二免疫球蛋白抗原结合结构域是scFv，该scFv包含：(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：57的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：58的氨基酸的VL-CDR2；以及(vi)包含SEQIDNO：59的氨基酸的VL-CDR3。在其他方面中，在此披露的治疗方法包括给予抗HER2结合分子，该抗HER2结合分子是包含双特异性抗HER2抗体的ADC，其中所述抗体包含：(i)包含SEQIDNO：32A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(ii)包含SEQIDNO：33A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iii)包含SEQIDNO：36A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iv)包含SEQIDNO：37A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(v)包含SEQIDNO：40A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；或，(vi)包含SEQIDNO：41A的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。在其他方面中，在此披露的治疗方法包括给予抗HER2结合分子，该抗HER2结合分子是包含双特异性抗HER2抗体的ADC，其中所述抗体包含：(i)包含SEQIDNO：32C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(ii)包含SEQIDNO：3C3的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iii)包含SEQIDNO：36C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iv)包含SEQIDNO：37C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(v)包含SEQIDNO：40C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分(例如，微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；或，(vi)包含SEQIDNO：67的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分(例如，两个微管溶素1508分子)，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。X.药物组合物和给予方法制备抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)并且向有需要的受试者给予这些抗HER2结合分子的方法对于本领域技术人员来说是熟知的或容易由本领域技术人员来确定。抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)的给予途径可以是例如口服、肠胃外、吸入或局部。如在此所使用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给予。然而，在与在此的传授内容相容的其他方法中，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)可以直接递送至有害细胞群的部位，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。如在此所讨论，本披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)可以用于体内治疗HER2表达细胞介导的疾病诸如某些类型的癌症的药学上有效的量来给予。药物组合物可以包含药学上可接受的载体，包括例如水、离子交换剂、蛋白质、缓冲物质、以及盐。还可以存在防腐剂和其他添加剂。该载体可以是溶剂或分散介质。用于在此披露的治疗方法中的适合配制品被描述于《雷明登氏药学全书》(Remington′sPharmaceuticalSciences)(Mack出版公司)，第16版(1980)中。在任何情况下，无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：以要求的量将活性化合物(例如，单独或与其他活性剂组合的抗HER2抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物，例如ADC诸如Bs2-4T)掺入在适当溶剂中，接着进行过滤灭菌。此外，制剂可以被包装并且呈试剂盒的形式销售。此类制造物品可以具有标签或包装说明书(packageinsert)，从而指示相关组合物是有用于治疗遭受、或易患疾病或病症的受试者。肠胃外配制品可以是单次推注剂量、输注剂量或负荷推注剂量随后是维持剂量。可以具体固定的或可变的间隔给予这些组合物，例如，每日一次，或以“在需要时”为基础。可以作为单次剂量、多次剂量或以输注形式在确立的时间周期内给予组合物。也可以调整剂量方案以便提供最佳期望反应(例如治疗性或预防性反应)。用于治疗HER2表达细胞介导的疾病诸如某些类型的癌症(包括例如，结肠癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、以及乳癌)的本披露的组合物的治疗有效量取决于许多不同因素而改变，这些因素包括给予方式、目标部位、患者的生理状态、患者是否是人或动物、给予的其他药剂、以及治疗是否是预防性或治疗性的。在一些特定方面中，如例如使用HERCEPTESTTM所确定，该癌症表达低水平的HER2。通常，该患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物(包括转基因哺乳动物)。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定，以便最优化安全性和功效。有待给予的至少一种抗HER2结合分子(例如，抗体或其结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)的量可以在没有过分实验的情况下通过本领域技术人员容易地确定。影响至少一种抗HER2结合分子(例如，抗体、其抗原结合片段、变体或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)的给予方式和对应的量的因素包括，但不限于经历疗法的个体的疾病严重性、疾病史、以及年龄、身高、体重、健康以及身体状况。类似地，有待给予的抗HER2结合分子(例如，抗体或其片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)的量将取决于给予方式以及该受试者是否将经历这种试剂的单次剂量或多次剂量。本披露还提供抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)在制造用于治疗一种类型癌症的药剂中的用途，该癌症包括例如乳癌、结肠癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、以及前列腺癌。在一些特定方面中，如例如使用HERCEPTESTTM所确定，该癌症表达低水平的HER2。本披露还提供抗HER2结合分子(例如，本披露的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)在制造用于治疗受试者以便用于治疗一种类型癌症的药剂中的用途。在一些特定方面中，如例如使用HERCEPTESTTM所确定，该癌症表达低水平的HER2。在某些方面中，在已使用至少一种其他疗法预先治疗的受试者中使用该药剂。“预先治疗(pretreated)”或“预先治疗(pretreatment)”意图是指受试者在接受包含抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)的药剂之前已接受一种或多种其他疗法(例如，使用至少一种其他抗癌疗法进行治疗)。受试者不必是对使用先前的疗法或多个疗法进行的预先治疗的响应者。因此，接受包含抗HER2结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)的药剂的受试者可以响应于、较差响应于、或可以不响应于使用先前疗法进行的预先治疗、或其中包括多个疗法的预先治疗的先前疗法中的一种或多种。因此，本披露提供治疗对其他疗法(例如，使用抗体或ADC诸如T-DM1的治疗)是较差响应者或未响应者的患者的方法，这些方法包括给予在此披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)。还提供预防对癌症疗法有抗性(例如，对使用抗体或ADC诸如T-DM1的治疗有抗性)的方法，这些方法包括给予在此披露的抗HER2结合分子(例如，抗体或其结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)。即使先前已使用HER2抑制剂对患者进行治疗，但本领域技术人员可以确定人们在使用该HER2抑制剂治疗之后是否显示无应答。例如，对抑制剂的无应答可以反映在患癌增加中，诸如癌症/肿瘤生长增加和/或肿瘤大小增加、转移形成(增加)或转移数目或大小增加。无应答还可以是肿瘤或转移发展(例如在肿瘤切除之后)、疾病进展的时间缩短、或一种或多种肿瘤和/或一种或多种转移大小增加(例如在新辅助疗法中)。基于本领域中已知的这些参数或其他参数，可以鉴定不响应于使用HER2抑制剂(像帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、或T-DM1)的治疗的患者组。此种患者组然后可以使用在此披露的抗HER2结合分子(例如，本披露的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)来治疗。本披露还提供治疗例如对另一种疗法是较差响应者或未响应者的患者的方法。如在此所使用的术语“未响应者”可以是指不太可能响应于使用HER2抑制剂(例如，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、或T-DM1)的治疗的个体/患者/受试者。如在此所使用的“不太可能响应”是指在使用HER2抑制剂治疗的患者中将发生病理学完全应答的可能性降低。在一些方面中，患者开始可以是良好响应者，并且对HER2抑制剂的抗性可以在使用此类HER2抑制剂(例如，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、或T-DM1)治疗的过程中发展，从而引起对该治疗的较差应答或无应答。如在此所使用的术语“良好响应者”是指在使用HER2抑制剂(像帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、或T-DM1)治疗过程中或之后，其肿瘤不表现出生长、转移、转移数目或大小增加等的个体，例如基于连续成像研究；在时间周期(例如，在初始诊断之后约1年)内不经历肿瘤生长、转移、转移数目和大小增加等的个体；和/或经历某一寿命(例如，在初始诊断之后约2年或更长)的个体。如在此所使用的术语“较差响应者”是指例如使用HER2抑制剂(像帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、或T-DM1)在标准疗法过程中或之后的短期内其肿瘤生长或转移、或经历归因于肿瘤的不良临床作用的个体。在其中评价受试者是“未响应者”、“较差响应者”或“不太可能响应”(例如基于在癌症细胞中存在某些生物标记物)的情况下，受试者可以使用在此披露的抗HER2结合分子(例如，本披露的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)来治疗。本披露还提供共同给予抗HER2结合分子(例如，本披露的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)以及至少一种其他疗法。该抗HER2结合分子和该至少一种其他疗法可以一起共同给予在单个组合物中，或可以同时或在重叠的时间里一起共同给予在分开的组合物中。在一些方面中，抗HER2结合分子(例如，本披露的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)可以用作辅助疗法。本披露还提供抗HER2结合分子(例如，本披露的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)(例如，ADC诸如Bs2-4T)在制造用于治疗受试者以便用于治疗癌症的药剂中的用途，其中该抗HER2结合分子在受试者用至少一种其他疗法治疗之前给予。XI.诊断学本披露进一步提供有用于在诊断HER2表达细胞介导的疾病诸如某些类型癌症过程中的诊断方法，这些癌症包括例如结肠癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、以及乳癌，这些诊断方法涉及测量来自个体的组织或其他细胞或体液中的HER2蛋白或转录物的表达水平并且将测量的表达水平与正常组织或体液中的标准HER2表达水平进行比较，因而与标准相比的表达水平增加指示病症。使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，本披露的抗HER2结合分子及其抗原结合片段、变体、以及衍生物可以被用来测定生物样品中的HER2蛋白水平(例如，参见加坎能(Jalkanen)等人，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)101：976-985(1985)；加坎能等人，细胞生物学杂志105：3087-3096(1987))。可用于检测HER2蛋白表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、或蛋白质印迹。适合的测定在此其他地方更详细地描述。“测定HER2多肽的表达水平”意图是指直接(例如，通过确定或评估绝对蛋白质水平)或相对(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关联的多肽水平进行比较)定性地或定量地测量或评估第一生物样品中的HER2多肽水平。可以测量或评估该第一生物样品中的HER2多肽表达水平并且与标准HER2多肽水平进行比较，该标准得自从不具有病症的个体获得的第二生物样品或通过对来自不具有病症的个体群体的水平进行平均化来确定。正如本领域中将了解的，一旦已知“标准”HER2多肽水平，它可以被重复地使用作为比较的标准。“生物样品”意图是指从个体、细胞系、组织培养物、或潜在表达HER2的其他细胞来源获得的任何生物样品。用于从哺乳动物获得组织活检物和体液的方法是本领域中熟知的。XII.包括抗HER2结合分子的试剂盒本披露还提供可用来进行在此描述的方法、包括在此披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其抗原结合片段)的试剂盒。在某些方面中，试剂盒包括在一个或多个容器中的至少一种纯化的抗HER2结合分子或其抗原结合片段。在一些方面中，这些试剂盒含有进行检测测定所必需和/或足以进行检测测定的所有组分(包括用于进行测定的所有控制、指导)，以及用于分析和呈现结果的任何必需软件。本领域技术人员将易于认识到，在此披露的所披露的抗HER2结合分子(例如，抗HER2抗体或其抗原结合片段)可易于与本领域中熟知的已建立的试剂盒形式相结合。XIII.免疫测定抗HER2结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、本披露分子的变体或衍生物)可以通过在本领域中已知的任何方法来针对免疫特异性结合进行测定。可使用的免疫测定包括但不限于使用诸如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，仅举几个例子。此类测定是常规的并且在本领域是熟知的(参见，例如奥苏贝尔(Ausubel)等人编著，(1994)，现代分子生物学实验技术(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(约翰威利父子公司，纽约(JohnWiley&Sons，Inc.，NY))第1卷，该参考文献通过引用以其全文结合在此)。在此披露的抗HER2结合分子(例如双特异性抗HER2抗体或其抗原结合片段、本披露的变体或其衍生物)可以如在免疫荧光、免疫电子显微术或非免疫测定中被组织学地采用，以便用于原位检测HER2受体或其保守变体或肽片段。原位检测可以通过以下方式来实现：从患者中取得组织学样本，并且向其施加标记的HER2结合分子(例如，双特异性抗HER2抗体或其抗原结合片段、其变体或衍生物，优选地通过覆盖该标记的HER2结合分子(例如，抗体或片段)来施加)到生物样品上。通过使用这样一个程序，不仅可能确定HER2、或保守变体或肽片段的存在，而且可能确定它在所检查的组织中的分布。使用本披露，技术人员将容易地认识到可以修改任何各种组织学方法(诸如染色程序)以便实现这样的原位检测。可以根据熟知的方法来确定给定批次抗HER2结合分子(例如，双特异性抗HER2抗体或其抗原结合片段、其变体或衍生物)的结合活性。本领域技术人员将能够通过采用常规实验来确定每种确定的操作和最优测定条件。适用于确定本披露的抗HER2结合分子(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段、其变体或改变/突变的衍生物)的结合特征的方法和试剂在本领域中是已知的和/或是商业上可获得的。设计用于此类动力学分析的仪器和软件是商业上可获得的(例如，BIAcore，BIA评估软件，通用健康医疗公司(GEHealthcare)；KinExa软件，Sapidyne仪器公司(SapidyneInstruments))。除非另外指示，否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。此类技术在文献中得到充分解释。参见，例如桑布鲁克(Sambrook)等人编著(1989)分子克隆实验室手册(MolecularCloningALaboratoryManual)(第2版；冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))；桑布鲁克等人编著(1992)分子克隆实验室手册，(冷泉港实验室，纽约)；D.N.格洛弗(D.N.Glover)编著，(1985)DNA克隆(DNACloning)，第1和II卷；盖特(Gait)编著(1984)寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)；穆利斯(Mullis)等人美国专利号4,683,195；哈莫斯(Hames)和希金斯(Higgins)编著(1984)核酸杂交(NucleicAcidHybridization)；哈莫斯和希金斯编著(1984)转录和翻译(TranscriptionAndTranslation)；弗雷什尼(Freshney)(1987)动物细胞培养(CultureOfAnimalCells)AlanR.Liss公司(AlanR.Liss，Inc.)；固定的细胞和酶(ImmobilizedCellsAndEnzymes)(IRL出版社)(1986)；培博(Perbal)(1984)分子克隆的实践指导；酶学论文、方法(APracticalGuideToMolecularCloning；thetreatise，MethodsInEnzymology)(美国学术出版社公司，纽约)；米勒(Miller)和卡洛(Calos)编著(1987)哺乳动物细胞的基因转移载体(GeneTransferVectorsForMammalianCells)，(冷泉港实验室)；吴(Wu)等人编著，酶学方法(MethodsInEnzymology)，第154和155卷；迈尔(Mayer)和沃克(Walker)编著(1987)细胞和分子生物学中的免疫化学方法(美国学术出版社，伦敦)；维尔(Weir)和布莱克威尔(Blackwell)编著(1986)实验免疫学手册(HandbookOfExperimentalImmunology)，第1-IV卷；操纵小鼠胚胎(ManipulatingtheMouseEmbryo)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，(1986)；以及奥苏贝尔等人(1989)现代分子生物学实验技术(约翰威利父子公司，马里兰州巴尔的摩)。在博雷贝克(Borrebaeck)编著(1995)抗体工程化(AntibodyEngineering)(第2版；牛津大学出版社)中阐述了抗体工程化的普遍原理。在里克伍德(Rickwood)等人编著(1995)蛋白质工程化，实践方法(ProteinEngineering，APracticalApproach)(英国牛津，牛津大学出版社的IRL出版社)中阐述了蛋白质工程化的普遍原理。抗体和抗体-半抗原结合的普遍原理被阐述于：尼森夫(Nisonoff)(1984)分子免疫学(MolecularImmunology)(第2版；SinauerAssociates公司，桑德兰，Mass.)；以及斯特华(Steward)(1984)抗体、它们的结构和功能(Antibodies，TheirStructureandFunction)(查普曼(Chapman)和霍尔(Hall)，纽约)中。另外，本领域中已知的并且不明确描述的免疫学标准方法通常如下所述：现代免疫学实验技术，约翰威利父子公司，纽约；斯蒂茨(Stites)等人编著(1994)基本和临床免疫学(BasicandClinicalImmunology)(第8版；康涅狄格州阿普尔顿和兰格，诺瓦克(Appleton&Lange，Norwalk，Conn.))以及米歇尔(Mishell)和师伊吉(Shiigi)(编著)(1980)细胞免疫学的选定方法(SelectedMethodsinCellularImmunology)(W.H.弗里曼和有限公司，纽约)。阐述免疫学普遍原理的标准参考著作包括现代免疫学实验技术，约翰威利父子公司，纽约；克莱因(Klein)(1982)免疫学杂志：自身-非自身区别科学(J.，Immunology：TheScienceofSelf-NonselfDiscrimination)(约翰威利父子公司，纽约)；肯尼特(Kennett)等人编著(1980)单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新局面(MonoclonalAntibodies，Hybridoma：ANewDimensioninBiologicalAnalyses)(纽约Plenum出版社)；坎贝尔(Campbell)(1984)生物化学和分子生物学实验技术中的“单克隆抗体技术”(″MonoclonalAntibodyTechnology″inLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)，布登(Burden)等人编著，(Elsevere，Amsterdam)；戈尔兹比(Goldsby)等人编著(2000)Kuby免疫学(KubyImmunnology)(第4版；H.弗里曼和有限公司)；罗义特(Roitt)等人(2001)免疫学(第6版；伦敦：莫斯比(London：Mosby))；阿巴斯(Abbas)等人(2005)细胞和分子免疫学(CellularandMolecularImmunology)(第5版；Elsevier健康科学部(ElsevierHealthSciencesDivision))；康特曼(Kontermann)和迪贝尔(Dubel)(2001)抗体工程化(SpringerVerlan)；桑布鲁克和拉塞尔(Russell)(2001)分子克隆：实验室手册(冷泉港出版社)；列文(Lewin)(2003)基因VIII(GenesVIII)(PrenticeHall2003)；哈洛(HarloW)和莱恩(Lane)(1988)抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratoryManual)(冷泉港出版社)；迪芬巴赫(Dieffenbach)和维克斯列尔(Dveksler)(2003)PCR引物(PCRPrimer)(冷泉港出版社)。XIV.实施例根据“EnXm”模式命名实施例，其中E意指“实施例”；n是实施例序数；X是任选的并且可以是A或B，其中A指代确切地与ADC构建体相关的实施例，并且B指代确切地与具有增强的ADCC的构建体相关的实施例；并且m是指示类别内的另外实施例的任选子序数(例如，A1、B1等)。E1.一种双特异性抗HER2抗体，包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中(i)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2抗体结合位点，(ii)该第一免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第一HER2抗体结合位点，该第一HER2抗体结合位点包含HER2的结构域II内的表位，并且(iii)该第一HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点不同。E2.如E1所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域结合至第二HER2抗体结合位点，该第二HER2抗体结合位点包含HER2的结构域IV内的表位。E3.如E2所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER2抗体结合位点相同。E4.如E2所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER2抗体结合位点部分重叠。E5.如E2所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的HER抗体结合位点不同。E6.一种双特异性HER2抗体，包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域将HER2结合至SEQIDNO：52中的一个或多个氨基酸残基上。E7.根据E6所述的双特异性抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域在结构域IV内的表位处结合HER2。E8.根据E6所述的双特异性抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域将HER2结合至SEQIDNO：53中的一个或多个氨基酸残基上。E9.根据E1-E8所述的双特异性抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，该重链可变区和该轻链可变区包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)；(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)；(iv)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(v)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及，(vi)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。E10.根据E9所述的双特异性抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含相对于包含VH(包含SEQIDNO：43的氨基酸)和VL(包含SEQIDNO：44的氨基酸)的免疫球蛋白抗原结合结构域的FW区不同的至少一个异源可变结构域构架区(FW)。E11.根据E10所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含：(i)包含SEQIDNO：11的氨基酸的可变轻链构架1(VL-FW1)；(ii)包含SEQIDNO：12的氨基酸的VL-FW2；(iii)包含SEQIDNO：13的氨基酸的VL-FW3；(iv)包含SEQIDNO：14的氨基酸的VL-FW4；或(v)其任何组合。E12.一种双特异性抗HER2抗体，包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH包含SEQIDNO：15或43的氨基酸；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。E13.一种双特异性抗HER2抗体，包含第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VL包含SEQIDNO：16或44的氨基酸；并且其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。E14.如E12或E13所述的双特异性抗HER2抗体，其中该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸；并且其中该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸。E15.根据E1至E14中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段。E16.根据E1至E15中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含scFv抗体片段。E17.根据E1至E16中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含以下各项或由其组成：(a)VH和VL，该VH进一步包含重链恒定区或其片段，并且该VL包含轻链恒定区(LC)或其片段；(b)单链Fv(“scFv”)；(c)双体抗体；(d)小抗体；(e)F(ab')2；或(f)F(ab)。E18.根据E17所述的双特异性抗HER2抗体，其中该重链恒定区或其片段是IgG恒定区。E19.根据E18所述的双特异性HER2抗体，其中该IgG恒定区或其片段是IgG1恒定区。E20.根据E17至E19中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中该LC恒定区是κ恒定区。E21.根据E17至E19中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中该LC恒定区是λ恒定区。E22.根据E1至E21中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是单克隆抗体。E23.根据E1至E22中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是人源化抗体。E24.根据E1至E22中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是人抗体。E25.根据E1至E22中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是嵌合抗体。E26.根据E1至E25中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域是亲和力优化的抗体。E27.根据E1至E26中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗竞争表位结合。E28.根据E1至E27中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一免疫球蛋白抗原结合结构域和该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同的非重叠HER2表位。E29.根据E1至E28中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中：(a)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至与该曲妥珠单抗抗体相同的HER2表位；(b)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域通过该曲妥珠单抗抗体竞争性地抑制HER2结合；或(c)该第二免疫球蛋白抗原结合结构域包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个互补决定区(CDR)，这些互补决定区包含SEQIDNO：54至59中的任一个的氨基酸。E30.根据E29所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域是scFv，所述scFv包含：(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：57的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：58的氨基酸的VL-CDR2；以及(vi)包含SEQIDNO：59的氨基酸的VL-CDR3。E31.根据E30所述的双特异性抗HER2抗体，其中该scFv是二硫化物稳定的scFv。E32.根据E30或E31所述的双特异性抗HER2抗体，其中所述scFv包含VH和VL，该VH包含SEQIDNO：17的氨基酸并且该VL包含SEQIDNO：18的氨基酸。E33.根据E32所述的双特异性抗HER2抗体，其中该scFv的该VH和该VL通过肽接头共价连接。E34.根据E33所述的双特异性抗HER2抗体，其中该肽接头包含SEQIDNO：19的氨基酸。E35.根据E29至E34中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的羧基末端上。E36.根据E35所述的双特异性抗HER2抗体，包含插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的羧基末端之间的接头。E37.根据E29至E34中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的氨基末端上。E38.根据E37所述的双特异性抗HER2抗体，包含插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的氨基末端之间的接头。E39.根据E29至E34所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价嵌入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的多肽链中。E40.根据E39所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价嵌入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的CH1区与CH2区之间。E41.根据E40所述的双特异性抗HER2抗体，包含：(i)插入在该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的CH1区与该第二免疫球蛋白抗原结合结构域之间的接头；以及(ii)插入在该第二免疫球蛋白抗原结合结构域与该第一免疫球蛋白抗原结合结构域的该HC的CH2区之间的第二接头。E42.根据E41所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一接头和该第二接头是相同的。E43.根据E41所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第一接头和该第二接头是不同的。E44.根据E36、E38以及E41至E43中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中这些接头中的一个或多个包括肽接头。E45.根据E44所述的双特异性抗HER2抗体，其中该肽接头包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少20个、或至少30个氨基酸。E46.根据E44或E45中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该肽接头包括具有化学式Serx[(Gly)y-Ser4]z的肽，其中x是从0至1，y是从1至4，并且z是从1至10。E47.根据E46所述的双特异性抗HER2抗体，其中该肽接头包含SEQIDNO：19-22。E48.根据E1至E47中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该重链包含恒定区，该恒定区包含Fc结构域。E49.根据E48所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域包含CH2区和CH3区。E50.根据E48所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域是IgG1Fc结构域。E51.根据E50所述的双特异性抗HER2抗体，其中该IgG1Fc结构域是天然IgG1Fc结构域。E52.根据E51所述的双特异性抗HER2抗体，其中该天然IgG1Fc结构域包含SEQIDNO：23的氨基酸。E53.根据E48所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域是突变IgG1Fc结构域。E54A.根据E53所述的双特异性抗HER2抗体，其中该突变IgG1Fc结构域包含能够降低该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变。E54B.根据E53所述的双特异性抗HER2抗体，其中该突变IgG1Fc结构域包含能够增强该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变。E55A.根据E54A所述的双特异性抗HER2抗体，其中能够降低该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变是氨基酸取代。E55B.根据E54B所述的双特异性抗HER2抗体，其中能够增强该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变是氨基酸取代。E56A.根据E55A所述的双特异性抗HER2抗体，包含至少一个氨基酸取代，该至少一个氨基酸取代包括L234F、S239A、S239C、位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据在卡巴特中所阐述的EU索引。E56B.根据E55B所述的双特异性抗HER2抗体，包含至少一个氨基酸取代，该至少一个氨基酸取代包括S239A、S239D、A330L、1332E、E333A、K334A或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据在卡巴特中所阐述的EU索引。E57A.根据E55A或E56A所述的双特异性抗HER2抗体，其中所述突变IgG1Fc结构域包含引入可衍生基团的至少一个氨基酸取代。E57B.根据E48至E53、E54B、E55B或E56B中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域具有增强ADCC活性的改变类型的糖基化。E58A.根据E57A所述的双特异性抗HER2抗体，其中所述突变IgG1Fc结构域包含引入可衍生基团的一至三个氨基酸取代。E58B.根据E57B所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域是具有减少量的岩藻糖基残基的无岩藻糖基化的抗体。E59A.根据E57A或E58A所述的双特异性抗HER2抗体，其中该可衍生基团是氢硫基基团。E59B.根据E57B或E58B所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域具有增加的等分GlcNAc结构。E60.根据E59A所述的双特异性抗HER2抗体，其中该至少一个氨基酸取代包括S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C、位置239与240之间的半胱氨酸插入、以及446C、或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。E61A.根据E54A、E55A、E56A、E57A、E58A、E59A、或E60中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该突变Fc结构域包含SEQIDNO：24A、SEQIDNO：24C、SEQIDNO：25A或SEQIDNO：25C的氨基酸。E61B.根据E54B、E55B、E56B、E57B、E58B、E59B、或E60中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该突变Fc结构域包含SEQIDNO：24B或SEQIDNO：25B的氨基酸。E62.一种双特异性抗HER2抗体，包含彼此相关联的第一多肽链和第二多肽链，其中该第一多肽链选自以下各项：(1)[TZs]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[Fcx](2)[BVH]-[BCH]-[Fcx]-[L2]-[TZs](3)[BVH]-[BCH]-[L3]-[TZs]-[L4]-[Fcx]其中TZs是结合与曲妥珠单抗相同的表位的scFv；L1、L2、L3以及L4是肽接头；Fcx是Fc结构域；BVH和BCH分别是抗体的VH区和CH1区，该抗体能够结合至与该曲妥珠单抗抗体识别的该表位不同的HER2表位。E63.根据E62所述的双特异性抗HER2抗体，其中该不同表位包含SEQIDNO：52内的一个或多个氨基酸。E64.根据E62或E63所述的双特异性抗HER2抗体，其中该第二链包含[BVL]-[CL]，其中BVL是能够结合至与该曲妥珠单抗抗体识别的该表位不同的HER2表位的抗体的VL区，并且CL是IgG轻链恒定区。E65.根据E64所述的双特异性抗HER2抗体，其中CL选自下组，该组由以下各项组成：人K恒定区和人λ恒定区。E66.根据E64或E65所述的双特异性抗HER2抗体，其中BVL包含：(i)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及，(iii)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。E67.根据E64、E65或E66所述的双特异性抗HER2抗体，其中BVL包含SEQIDNO：16或44的氨基酸。E68.根据E65所述的双特异性抗HER2抗体，其中CL包含SEQIDNO：27A或SEQIDNO：27B的氨基酸。E69.根据E62至E68中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[TZs]包含：(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：57的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：58的氨基酸的VL-CDR2；以及(vi)包含SEQIDNO：59的氨基酸的VL-CDR3。E70.根据E62至E69中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[TZs]是二硫化物稳定的scFv。E71.根据E62至E70中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[TZs]包含通过肽接头共价连接的VH和VL，该VH包含SEQIDNO：17的氨基酸并且该VL包含SEQIDNO：18的氨基酸。E72.根据E71所述的双特异性抗HER2抗体，其中该肽接头包含SEQIDNO：19的氨基酸。E73.根据E69至E72中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[TZs]包含SEQIDNO：28的氨基酸。E74.根据E62至E73中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中铰链多肽连接该[BCH]和[FcX]。E75.根据E74所述的双特异性抗HER2抗体，其中该铰链多肽包含SEQIDNO：26的氨基酸或由其组成。E76A.根据E62至E75中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该[Fcx]包含引入可衍生基团的至少一个氨基酸取代。E76B.根据E62至E75中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[Fcx]包含能够增强该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变。E77A.根据E76A所述的双特异性抗HER2抗体，其中该[Fcx]包含引入可衍生基团的一至三个氨基酸取代。E77B.根据E76B所述的双特异性抗HER2抗体，其中能够增强该双特异性抗体的ADCC活性的至少一个突变是氨基酸取代。E78A.根据E76A或E77A所述的双特异性抗HER2抗体，其中该可衍生基团是氢硫基基团。E78B.根据E77B所述的双特异性抗HER2抗体，包含至少一个氨基酸取代，该至少一个氨基酸取代包括S239A、S239D、A330L、1332E、E333A、K334A或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据在卡巴特中所阐述的EU索引。E78B1.根据E62至E75、E76B、E77B或E78B中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域具有增强ADCC活性的改变类型的糖基化。E78B2.根据E78B1所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域是具有减少量的岩藻糖基残基的无岩藻糖基化的抗体。E78B3.根据E78B1或E78B2所述的双特异性抗HER2抗体，其中该Fc结构域具有增加的等分GlcNAc结构。E79.根据E78A所述的双特异性抗HER2抗体，其中该至少一个氨基酸取代包括S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C、446C、位置239与240之间的半胱氨酸插入、或其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。E80A.根据E62至E75、E76A、E77A、E78A、或E79中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[Fcx]包含SEQIDNO：23、24A、24C、25A以及25C中的任一个的氨基酸。E80B.根据E62至E75、E76B、E77B、E78B、E78B1、E78B2、E78B3、或E79中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[Fcx]包含SEQIDNO：23、24B、以及25B中的任一个的氨基酸。E81.根据E62至E79中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[L1]、[L2]、[L3]以及[L4]包含独立地选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：SEQIDNO：19、20、21以及22。E82.根据E62至E79中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中：(i)[L1]包含SEQIDNO：19的氨基酸；(ii)[L2]包含SEQIDNO：20的氨基酸；(iii)[L3]包含SEQIDNO：21的氨基酸；以及，(iv)[L4]包含SEQIDNO：22的氨基酸。E83.根据E62至E82中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[BVH]包含：(i)与SEQIDNO：1相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：1相同的可变重链CDR-1(VH-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：2相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：2相同的可变重链CDR-2(VH-CDR2)；以及(iii)与SEQIDNO：3相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：3相同的可变重链CDR-3(VH-CDR3)。E84.根据E62至E82中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[BVH]包含SEQIDNO：15或43。E85.根据E62至E84中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[BCH]包含SEQIDNO：29的氨基酸。E86.根据E64至E85中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[BVL]包含：(i)与SEQIDNO：4相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：4相同的可变轻链CDR-1(VL-CDR1)；(ii)与SEQIDNO：5相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：5相同的可变轻链CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)与SEQIDNO：6相同或除了高达1、2、3或4个氨基酸取代以外与SEQIDNO：6相同的可变轻链CDR-3(VL-CDR3)。E87.根据E64至E85中任一项所述的双特异性抗HER2抗体，其中[BVL]包含SEQIDNO：16或44的氨基酸。E88A.根据E62至E87中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中第一多肽链包含SEQIDNO：30、31A、32A、32C、33A、33C、34、35A、36A、36C、37A、37C、38、38A、39A、40A、40C、41A或41C中的任一个的氨基酸，并且第二多肽链包含SEQIDNO：42A或42B的氨基酸，其中该双特异性HER2抗体被轭合至治疗部分上。E88B.根据E62至E87中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中第一多肽链包含SEQIDNO：30、31B、32B、33B、34、35B、36B、37B、38、38B、39B、40B或41B中的任一个的氨基酸，并且第二多肽链包含SEQIDNO：42A或42B的氨基酸，其中该双特异性HER2抗体具有增强的ADCC活性。E89.根据E1至E88B中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中该双特异性HER2抗体在结合至该HER2靶标时诱导内化。E90.根据E89所述的双特异性HER2抗体，其中该双特异性HER2抗体在内化之后促进有效的溶酶体运输。E91.根据E1至E88B中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中该双特异性HER2抗体诱导HER2靶标降解。E92.根据E1至E88B中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中该双特异性HER2抗体阻断低HER2表达癌症细胞中的配体诱导的AKT磷酸化。E93.根据E1至E88B中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中该双特异性HER2抗体破坏配体诱导的HER2：HER3二聚化。E94.一种抗HER2结合分子，包含免疫球蛋白重链(VH)和免疫球蛋白轻链(VL)，其中该结合分子包含：(i)包含SEQIDNO：1的氨基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQIDNO：2的氨基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQIDNO：3的氨基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQIDNO：4的氨基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQIDNO：5的氨基酸的VL-CDR2；以及，(vi)包含SEQIDNO：6的氨基酸的VL-CDR3；E95.一种抗HER2结合分子，包含免疫球蛋白重链(VH)和免疫球蛋白轻链(VL)，其中该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸。E96.一种包含VH和VL的抗HER2结合分子，其中该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸。E97.如E94或E95或E96所述的结合分子，其中该VH包含SEQIDNO：15的氨基酸并且该VL包含SEQIDNO：16的氨基酸。E98.如权利要求E94至E97中任一项所述的结合分子，包括抗体或其抗原结合片段。E99A.一种抗体-药物轭合物(ADC)，包含根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体或根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子以及至少一个治疗部分。E100A.根据E99A所述的ADC，进一步包含至少一个任选的间隔物。E101A.根据E100A所述的ADC，其中至少一个间隔物是肽间隔物。E102A.根据E100A所述的ADC，其中至少一个间隔物是非肽间隔物。E103A.根据E99A至E102A中任一项所述的ADC，包含两个、三个、或四个治疗部分。E104A.根据E99A至E103A中任一项所述的ADC，其中所有治疗部分是相同的。E105A.根据E99A至E104A中任一项所述的ADC，其中每个治疗部分被化学轭合至该双特异性抗体的该Fc区中的特定位置处的氨基酸侧链上。E106A.根据E105A所述的ADC，其中这些特定位置选自下组，该组由以下各项组成：239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443、446、在位置239与240之间的插入、以及其任何组合，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。E107A.根据E105A或106A所述的ADC，其中这些特定位置是239、442或两者，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。E108A.根据E105A或106A所述的ADC，其中这些特定位置是442和位置239与240之间的氨基酸插入，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。E109A.根据E105A至E108A所述的ADC，其中该氨基酸侧链是氢硫基侧链。E110A.一种ADC，包含根据E1至E98中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中所述抗体包含：(i)包含SEQIDNO：32A的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(ii)包含SEQIDNO：33A的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iii)包含SEQIDNO：36A的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iv)包含SEQIDNO：37A的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(v)包含SEQIDNO：40A的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239处的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；或(vi)包含SEQIDNO：41A的氨基酸的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至分别位于位置239和442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。E111A1.一种ADC，包含根据权利要求1至113中任一项所述的双特异性HER2抗体，其中所述抗体包含：(i)包含SEQIDNO：32C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(ii)包含SEQIDNO：33C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iii)包含SEQIDNO：36C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(iv)包含SEQIDNO：37C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；(v)包含SEQIDNO：40C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基酸上的治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引；或，(vi)包含SEQIDNO：41C的氨基酸或由其组成的第一多肽链和包含SEQIDNO：42A的氨基酸或由其组成的第二多肽链，其中该第一多肽链包含共价连接至位置239与240之间插入的半胱氨酸氨基和位于位置442处的半胱氨酸氨基酸上的两个治疗部分，其中氨基酸位置编号根据如在卡巴特中所阐述的EU索引。E112A.根据E99A至E111A中任一项所述的ADC，其中该治疗部分包括细胞毒素、放射性同位素、放射性同位素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、肽、脂质、碳水化合物、螯合剂或其组合。E113A.根据E112A所述的ADC，其中该细胞毒素是微管溶素、奥瑞他汀、美登木素生物碱或吡咯并苯并二氮杂(PBD)。E114.一种分离的核酸分子或核酸分子组，编码根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体或根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子、或其补体。E115.一种载体或载体组，包含如E114所述的核酸分子或核酸分子组、或其补体。E116.一种宿主细胞，包含根据E114所述的分离的核酸分子或核酸分子组、或根据E115所述的载体或载体组。E117.一种宿主细胞，表达根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体或根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子。E118.一种用于产生根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体或根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子的方法，该方法包括培养根据E116或E117中任一项所述的宿主细胞并且从培养基中回收该抗体。E119.一种药物组合物，包含根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体、根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子、或根据E99A至E113A1中任一项所述的ADC、以及药学上可接受的载体。E120.一种治疗HER2表达癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体、根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子、根据E99A至E113A1中任一项所述的ADC或根据E119所述的组合物。E121.根据E120所述的方法，其中该癌症是低HER2表达癌症。E122.如E120或E121中任一项所述的方法，进一步包括给予至少一种另外的治疗剂。E123.根据E122所述的方法，其中该至少一种另外的治疗剂是放射性核素或化疗剂。E124.一种将治疗部分靶向至表达HER2的细胞上的方法，该方法包括给予融合或轭合至根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体、根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子、或根据E99A至E113A1中任一项所述的ADC上的该治疗部分。E125.一种增加治疗部分的活性的方法，该方法包括将该部分轭合至根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体、根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子、或根据E99A至E113A1中任一项所述的ADC上。E126.一种改进治疗部分的药物代谢动力学特性的方法，该方法包括将该部分轭合至根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体、根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子、或根据E99A至E113A1中任一项所述的ADC上。E127.根据E112至E126中任一项所述的方法，其中该治疗部分是细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、肽、脂质、碳水化合物、或螯合剂。E128.根据E127所述的方法，其中该细胞毒素是微管溶素、奥瑞他汀、美登木素生物碱或吡咯并苯并二氮杂(PBD)。E129.根据E113A所述的ADC或根据E128所述的方法，其中该细胞毒素是具有以下结构的微管溶素1508：E130.一种治疗对HER2靶向治疗剂的抗性的方法，该方法包括向有需要的患者给予根据E1至E93中任一项所述的双特异性HER2抗体、根据E94至E98中任一项所述的抗HER2结合分子、或根据E99A至E113A中任一项所述的ADC。XV.序列以下表3提供了序列参考号(SEQIDNO：)、氨基酸序列以及关于这些序列的评述。表3通过说明而不是通过限制的方式，提供以下实例。实例本披露的多方面可以进一步通过参考以下非限制性实例进行定义，这些非限制性实例详细描述了本披露的某些抗体的制备以及使用本披露抗体的方法。对于本领域技术人员来说将会清楚的是，在不背离本披露的范围的情况下，可以对材料和方法两者做出许多修改。许多HER2抗体被批准用于治疗其一种或多种肿瘤过表达HER2的乳癌患者，包括曲妥珠单抗(参见美国专利号5,821,337)、帕妥珠单抗(PERJETATM；专利公开号WO2001/00245)和T-DM1(ado-曲妥珠单抗emtansine，KADCYLATM，由连接至细胞毒性剂美登素(DM1)上的单克隆抗体曲妥珠单抗组成的抗体-药物轭合物，尼古莱斯库(Niculescu)-杜凡斯(Duvaz)等人，2010，分子治疗新进展(Curr.Opin.Mol.Ther.)12：350-60)。然而，这些疗法并没有被指出供表达低水平HER2的大部分患者使用。另外地，存在不响应于这些疗法或变得抗性的患者。因此，存在对解决这些患者的卓越治疗学的未能满足的医疗需求。如在以下提供的具体实例中详细说明，通过将结合HER2的结构域II内的新描述的表位的优化全人抗HER2抗体与结合HER2的结构域IV内的已知表位的scFv组合来产生高度有效的双特异性抗体。产生并且测试了许多不同双特异性抗体构象。所提供的独特双特异性抗体展现出对于任何所测试的单特异性抗HER2抗体未看出的生物活性。在许多测定中，双特异性抗体还证实了优于单特异性抗HER2抗体的协同活性。在此提供的双特异性抗体的许多体外和体内活性通过在不存在或对Fcγ受体的结合活性严重减少的情况下添加细胞毒性剂(例如，微管溶素1508)来进一步增强。另外，发现在此提供的独特双特异性抗体的体外活性还可以通过增强ADCC活性，例如通过改变糖基化(例如，使用POTELLEGENTTM技术(新泽西州普林斯顿Biowa公司(Biowa，Inc.Princeton，N.J.))以产生具有增强ADCC活性的无岩藻糖基化的抗体来增强。这些数据表明双特异性抗体可以具有治疗用途，具体地作为ADC或作为ADCC增强的抗体，以便用于治疗表达宽范围HER2水平的癌症，包括当前不适合使用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或T-DM1治疗的患者。另外，双特异性抗体可以具有用于治疗对现有抗HER2疗法以失败告终的癌症患者的治疗用途。实例11.1.前导优化AZ1.39.1是不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗竞争结合的针对人HER2的全人单克隆抗体(专利公开号WO2008/019290)。39S是如下详细说明的从AZ1.39.1中产生的前导优化抗体(图1)。定点诱变被用来使用Ile替换轻链CDR1中的未配对Cys残基，并且重链CDR3中的潜在异构化位点(DG)通过将该DG改变成DA来去除。所得变体证实了与AZ1.39.1相同的结合特异性和体外抗增殖活性(数据未示出)。为了产生更高亲和力结合剂，对重链的CDR残基施加诱变，并且突变体被表达为哺乳动物细胞中的IgG并且通过捕获ELISA对它们与重组人HER2细胞外结构域蛋白的结合活性进行筛选。对具有比野生型对照显著更高的结合信号的克隆进行测序以揭示突变信息。从鉴定的突变中构建组合文库并且通过捕获ELISA对与重组人HER2细胞外结构域蛋白的结合活性进行筛选。发现39S具有最高结合活性，并且进一步的序列分析揭示39S携带重链CDR1中的单个N5S突变。通过BIAcore所确定，39S与人HER2的亲和力(KD)是大约1.0nM，相反所报道的亲本1.39.1抗体的亲和力是大约2.0nM。因此，这单个突变引起优于亲本抗体的2倍结合亲和力增加。为了改进抗体表达水平，构架序列(具体地轻链FR1、FR2以及FR3)从IGKV4-1+Jk3.01换至IGVK2D种系序列，从而引起培养7天后测量的IgG表达水平增加大约2倍(图2)。1.2.前导优化抗体39S的结合特异性和物种交叉反应性为了确定39S是否保留其亲本抗体AZ1.39.1的结合特异性和物种交叉反应性，通过捕获ELISA来检查39S与人ErbB家族的受体(EGFR、HER2、HER3以及HER4)、小鼠Her2、以及食蟹猴Her2的结合。简单地说，使用以下重组细胞外结构域蛋白中的一种涂布96孔板：人EGFR、人HER2、人HER3、人HER4、小鼠Her2、或食蟹猴Her2。通过在从50nM降至0.28pM范围内以逐步1∶3系列稀释进行稀释并且然后一式二份添加至孔中来制备有待测试的抗体。在孵育1小时之后，对板进行洗涤，并且将山羊抗人IgGFabHRP-轭合的二级抗体添加至每个孔中并且将板孵育1小时。对板进行洗涤并且添加TMB底物且孵育5-20min以便允许显色。在反应结束时将停止溶液添加至孔中并且在450nm处对板进行读数。使用Prism软件，针对抗体浓度对结合信号(450nm处的吸光度)进行绘图。结果显示类似于AZ1.39.1的39S可以结合至人HER2和食蟹猴Her2，但不能结合至人EGFR、HER3、HER4、或小鼠Her2(数据未示出)。1.3.39S表位作图和表征通过在人Her2分子与小鼠Her2分子之间交换结构域，将人HER2的结构域II鉴定为39S的表位。将小鼠Her2选择为嵌合配偶体，因为它不能被39S识别但与人HER2共享85％的序列一致性。如在表4中所列，构建靶向HER2的每个结构域的嵌合变体(参见以下方法)，包括使用小鼠对应部分替换人HER2的结构域I、II、III或IV的四个敲除(KO，丧失功能)变体，以及将人HER2的结构域II移植到小鼠Her2分子中的一个敲入(KI，获得功能)变体。嵌合变体命名指代变体的类型(KO/KI)和所交换的结构域数。使用基于SPR的仪器ProteOnTM，通过使用抗人和小鼠Her2多克隆抗体捕获传感器表面上的变体来表征39S与这些变体的结合特征(参见以下方法)。通过使用ProteOnTM的抗His多克隆抗体来监测变体的表达。39S与丧失功能的变体的结合结果证实了结构域II是含有表位的结构域。39S不结合至编码小鼠结构域II的KO_II的变体(表4)，而保留结合至编码小鼠结构域I的KO_I的变体。虽然敲除人结构域III和IV(KO_III和KO_IV)的变体不表达，但基于获得功能的变体KI_II的结合结果，这两个结构域被排除作为39S的表位。这种编码小鼠结构域I、III以及IV和人结构域II的获得功能的变体(KI_II)被具有与人HER2(84pM)类似的结合亲和力(168pM)的39S识别。因此，通过丧失功能和获得功能的变体，人HER2的结构域II(氨基酸146-310)被鉴定为39S的含有表位的结构域。我们进一步细化了39S的表位并且将结构域II中的氨基酸192-208的区鉴定为关键表位区。构建一系列靶向结构域II的短区的嵌合人/小鼠变体，这些结构域II的短区在人Her2蛋白与小鼠Her2蛋白之间具有不同的氨基酸序列，如在表4中所列。通过使用小鼠对应部分替换以下人HER2区中的每一个来产生七个敲除变体，包括氨基酸146-208、159-162、171-187、192-208、250-261、276-285、以及295-296。另外，通过将人HER2的氨基酸192-208的区移植至小鼠分子中来构建一个敲入变体。变体命名指代变体的类型(KO/KI)和具有氨基酸编号的交换区。所有变体具有通过抗His多克隆抗体得到的可检测表达水平(表4)。39S不结合至任何嵌合变体，其中人HER2的氨基酸192-208的区被小鼠残基(KO_146-208、KO_192-208)替换。当用小鼠氨基酸(KO_159-162、KO_171-187、KO_250-261、KO_276-285、以及KO_295-296)取代人HER2的任何其他区时，39S的结合不受影响。此外，与人HER2的KD(84pM)相比，39S以72pM的KD结合至编码人192-208的KI变体(KI_192-208)。总的来说，人HER2结构域II中的氨基酸192-208的区被鉴定为39S的功能表位。变体命名指代变体的类型(KO/KI)和具有氨基酸编号的交换区。基于不具有其信号肽的成熟人HER2序列的编号方案来指代氨基酸位置。通过抗His多克隆抗体来监测所有变体的表达水平。使用基于SPR的仪器ProteOnTM，通过使用抗人和小鼠Her2多克隆抗体捕获传感器表面上的变体来表征39S与这些变体的结合特征。通过捕获传感器表面上的Her2蛋白，预期39S的测量的表观结合亲和力高于以将39S固定在芯片表面上的形式的单价结合亲和力。表4.39S与嵌合人/小鼠Her2变体的结合特征如下构建嵌合人/小鼠Her2变体的构建和表达。简单地说，组装编码具有His标签的嵌合人/小鼠Her2变体的DNA，并且使用人和小鼠Her2质粒作为模板(MedImmune)通过重叠PCR来扩增。将组装的DNA克隆到哺乳动物表达载体pEBNA(MedImmune)中。然后根据制造商说明书(英杰公司(Invitrogen))，使用293fectin和标准方案用不同构建体瞬时转染HEK293F细胞。使用ProteOnTMXPR36仪器(BioRad)研究39S与嵌合人/小鼠变体的结合特征。使用标准胺偶联将在10mM乙酸钠(pH5.0)中的抗人或小鼠Her2多克隆抗体(R&D系统公司(R&DSystem))以对于每个通道大约5000个共振单位(RU)固定至GLC生物传感器芯片的表面上。注射细胞培养上清液中的嵌合蛋白并且通过抗人或小鼠多克隆抗体捕获到GLC表面上，其中具有大约200RU反应。将抗HER2mAb39S稀释在具有0.005％吐温-20的从10nM至0.625nM(1∶2稀释)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中，并且以100μL/min注射持续180秒，其中具有600秒解离时间。通过在与注射39S相同的条件下使抗His多克隆抗体(MedImmune)流动来监测嵌合变体的表达水平。通过以100μL/min注射甘氨酸缓冲液(10mM，pH1.5)持续30秒来使表面再生两次。使用ProteOnTMManager3.0.1软件处理所有传感图数据。使用基于FACS的结合竞争测定来确定抗体是否竞争结合至与曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗相同的表位。收获BT-474细胞，重新悬浮于FACS缓冲液中，并且将2.5×105个细胞/孔添加至96孔U型底板中。通过在从500μg/mL降至1.9ng/mL范围内以逐步1∶4系列稀释来稀释在含有2μg/mLAlexa-Fluor647-标记的39S抗体的FACS缓冲液中制备有待测试的抗体(R347IgG1同种型对照、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、AZ1.39.1以及39S)，并且然后一式三份添加至细胞中。在冰上染色1小时之后，用冰冷FACS缓冲液洗涤细胞3次并且然后用2％PFA固定。通过具有BDFACSDivaTM软件的BDLSRII机器来分析细胞。使用FlowJo软件分析数据并且作为平均MFI±SEM(n＝3)呈现。图4示出39S结合至与其亲本抗体AZ1.39.1相同的表位；并且39S不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗竞争结合。在图3中提供的HER2的带状结构上通过箭头指示39S、帕妥珠单抗以及曲妥珠单抗的结合位点。1.4.39S的体外活性选择一组表达不同水平HER2的人癌症细胞系以用于评估抗体或抗体组合的抗增殖活性。通过和定量FACS来确定细胞中的HER2表达水平(表5)。表5：人癌症细胞系上的HER2表达水平增殖抑制测定：以100μL的体积，以96孔板的每个孔5,000至20,000的密度(取决于每种细胞系的生长动力学)将细胞铺放在含有血清的培养基中。通过将测试物品稀释在培养基中制备有待测试的每种剂量抗体或抗体组合的2X浓缩物。一式三份将100微升每种测试物品添加至细胞中，这样使得最终剂量曲线在以逐步1∶4系列稀释从10μg/mL降至0.15ng/mL范围内。对于配体依赖性增殖抑制测定，将细胞铺放在无血清的培养基中，并且通过将测试物品稀释在无血清培养基中制备有待测试的每种剂量抗体或抗体组合的4X浓缩物。一式三份将50微升每种测试物品添加至细胞中，并且然后将以32ng/mL浓度稀释在无血清培养基中的50μL调蛋白-β1添加至细胞中以便实现8ng/mL的最终调蛋白-β1浓度，并且最终抗体剂量曲线以逐步1∶4系列稀释从100μg/mL降至6.1ng/mL范围内。在37℃/5％CO2下培养经过处理的细胞持续4至7天(取决于每种具体细胞系的生长动力学)。根据制造商说明书，使用来自普洛麦格公司(Promega)的细胞滴度Glo来确定细胞活力。使用GraphPadPrism软件分析数据，并且作为相对于未处理的对照的生长抑制百分比呈现。图5示出39S具有与帕妥珠单抗类似的在抑制MCF-7细胞中的配体驱动的增殖方面的活性。与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗组合，39S示出与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合相比具有功效的对配体依赖性增殖的加和或协同抑制。在其他细胞系诸如MDA-MB-361和RT-112中观察到类似结果(数据未示出)。图6示出39S(像帕妥珠单抗)在含有血清的培养基中抑制NCI-N87细胞增殖方面具有限制的活性。然而，当与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗组合时，39S证实了在抑制细胞生长方面的强协同作用。39S与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗之间的协同性比对于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合看出的协同性要大得多。在BT-474细胞中观察到类似的结果(数据未示出)。实例22.1.双特异性抗体构建对Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH进行克隆。通过将抗HER2结构域IV抗体(SEQIDNO：17和18，其中X是C)、抗HER2抗体39S(SEQIDNO：15和16)的可变结构域克隆到包含适当恒定区的表达载体中来产生双特异性表达构建体。将抗HER2结构域IV可变结合结构域构建为单链Fv(scFv)。使用以上SEQIDNO：17和18(其中X-C)的氨基酸序列，设计并且合成用于最大哺乳动物蛋白质表达的密码子优化的DNA序列。使用类似于描述于迪马斯(Dimasi)等人，(2009)分子生物学杂志393，672-692中的那些方法来产生Bs2Ab和Bs3Ab构建体。使用类似于描述于专利公开号WO2013070565A1中的那些方法来产生Bs4Ab构建体。最终合成的基因含有两个半胱氨酸突变，分别是在位置100处的轻链中的一个突变和在位置44处的重链上的一个突变。这些半胱氨酸将在VL结构域与VH结构域之间形成链间二硫键以便稳定scFv。使用20个氨基酸残基(G4S)4来连接scFv的两个VL结构域和VH结构域。通过使用10个氨基酸残基接头(G4S)2来将Bs2Ab中的scFv连接至重链N-末端上。通过使用10个氨基酸残基接头(G4S)2来将Bs3Ab形式中的scFv连接至抗体CH3结构域的C-末端上。具有序列(G4S)2的两个接头用于连接Bs4Ab骨架中的scFv。使用DNA序列来确定构建一致性和保真度。图7提供产生用于结合至HER2抗原的Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH双特异性抗体形式中的每一种的示意图(分别是图A、图B以及图C)。双特异性抗体具有两个结合单元，这两个结合单元中的每一个结合相同抗原上的不同表位。在图中标记了这些结合单元。关于这些结合单元，分子是双侧对称的。如所描绘，Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH形式是指其中scFv通过接头(例如(G4S)2)被融合至可变区的氨基末端(Bs2Ab-39SH)、插入修饰的铰链区(Bs4Ab-39SH)或重链的CH3的羧基-末端(Bs3Ab-39SH)的双特异性抗体。所示的三种双特异性构建体包含通过甘氨酸丝氨酸接头(例如(G4S)2)融合至抗HER2结构域II人IgG1的抗HER2结构域IV结合scFv。Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH构建体的氨基酸序列提供于图8中(还参见SEQIDNO：30、34以及38天然Fc区)。图8A示出Bs2Ab-39SH的双特异性抗体重链氨基酸序列和用于增强的ADCC的可能取代位点和或对于两种和四种药物负载的位点特异性抗体药物轭合。抗HER2结构域IVscFv是以VL-(G4S)4接头-VH形式并且通过(G4S)2接头基因连接至抗HER2结构域II抗体重链的氨基末端上。可在抗体的CH2和CH3中进行所描绘的氨基酸取代和或插入，以便用于增强的ADCC和位点特异性轭合。图8B示出Bs3Ab-39SH的双特异性抗体重链氨基酸序列和用于增强的ADCC的可能取代位点和或对于两种和四种药物负载的位点特异性抗体药物轭合。抗HER2结构域IVscFv是以VL-(G4S)4接头-VH形式并且通过(G4S)2接头基因连接至抗HER2结构域II抗体重链的羧基末端上。可在抗体的CH2和CH3中进行所描绘的氨基酸取代和或插入，以便用于增强的ADCC和位点特异性轭合。图8C示出Bs4Ab-39SH的双特异性抗体重链氨基酸序列和用于增强的ADCC的可能取代位点和或对于两种和四种药物负载的位点特异性抗体药物轭合。抗HER2结构域IVscFv是以VL-(G4S)4接头-VH形式并且通过两个(G4S)2接头插入抗HER2结构域II抗体重链的修饰的铰链区中。可在抗体的CH2和CH3中进行所描绘的氨基酸取代和或插入，以便用于增强的ADCC和位点特异性轭合。2.2.双特异性抗体的结合特异性和物种交叉反应性通过如在实例1中所述的捕获ELISA来确定双特异性抗体与人EGFR、人HER2、人HER3、人HER4、小鼠Her2、或食蟹猴Her2的重组细胞外结构域蛋白的结合特异性和物种交叉反应性。结果显示所测试的所有双特异性抗体(包括Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH)能够以类似功效结合至人HER2和食蟹猴Her2并且它们中没有一个显示结合至人EGFR、HER3、HER4或小鼠Her2(数据未示出)，从而表明双特异性抗体保留其亲本单克隆抗体的物种交叉反应性的结合特异性。通过BIAcore来确定双特异性抗体与人HER2和食蟹猴Her2的结合动力学(数据未示出)。针对Bs2Ab-39SH对人HER2的亲和力(KD)是113pM，并且针对Bs4Ab-39SH是236pM。2.3.双特异性抗体的体外活性使用在实例1中描述的方法来确定双特异性抗体在抑制配体驱动的细胞增殖方面的活性。结果显示Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH在MDA-MB-361细胞(图9A)和MCF-7细胞(图9B)中具有类似的功效，这还与亲本抗体组合(39S加上曲妥珠单抗)的活性可比较。在其他细胞系(包括NCI-N87和RT-112)中观察到类似结果(数据未示出)。2.4.通过双特异性抗体来破坏HER2：HER3异源二聚化收获T47D细胞，洗涤并且重新悬浮于无血清培养基中。以1×106个细胞/孔的密度将细胞种于6孔板中，并且然后在37℃/5％CO2下孵育过夜。第二天，使用500nM浓度下的有待测试的抗体(R347IgG1同种型对照、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、39S以及Bs2Ab-39SH)对细胞进行预处理1小时。在预处理后，以最终浓度8ng/mL添加调蛋白-β1并且在37℃/5％CO2下孵育细胞5min。然后使用冰冷1xPBS洗涤细胞两次，溶解并且根据制造商说明书使用小鼠抗人HER2(克隆44E7)抗体和来自赛默飞科技公司(ThermoScientific)的Pierce经典IP试剂盒来进行免疫沉淀。用含有2-巯基乙醇的Laemmli缓冲液洗脱免疫沉淀的蛋白质样品，并且使用标准方案通过蛋白质印迹来进行分析。在蛋白质印迹分析中，兔抗人HER2(克隆29D8)抗体被用来检测HER2并且兔抗人HER3(C-17)多克隆抗体被用来检测HER3。图10示出Bs2Ab-39SH和39S(类似于帕妥珠单抗)可以破坏由配体刺激诱导的HER2：HER3异源二聚化。2.5.通过双特异性抗体进行的HER2聚集为了检查双特异性抗体是否可以交联HER2以形成大型复合体，以不同摩尔比将重组人HER2细胞外结构域蛋白与Bs2Ab-39SH或曲妥珠单抗混合，并且在室温下孵育30min。通过HPLC大小排阻色谱法来分离所形成的免疫复合体；然后通过多角度光散射(MALS)测定来分析这些免疫复合体的大小。图11示出来源于1∶1摩尔比的抗体：HER2的代表性数据(以其他摩尔比的数据未示出)。结果指示Bs2Ab-39SH可交联许多HER2分子以形成大小为1716kDa大的蛋白质复合体，而曲妥珠单抗最大仅可结合至两个HER2分子以形成320kDa复合体。对于Bs4Ab-39SH观察到类似的结果(数据未示出)。2.6.通过双特异性抗体进行的增强的内化和溶酶体运输通过FACS来测量抗体内化。从T150烧瓶中收获BT-474细胞，重新悬浮于冰冷培养基中并且然后以1×106个细胞/孔添加至96孔U型底板中。在4℃下通过离心来沉淀细胞。弹去培养基，并且一式三份将细胞沉淀物重新悬浮于150μL的含有10μg/mL有待测试的抗体或抗体组合(R347IgG1同种型对照、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、AZ1.39.1、39S、曲妥珠单抗+39S、曲妥珠单抗+帕妥珠单抗、帕妥珠单抗+39S、曲妥珠单抗+帕妥珠单抗+39S、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH)的冰冷培养基中。在冰上孵育细胞1小时并且然后洗涤以去除未结合抗体。将等分试样的细胞保持在冰上；剩余细胞在37℃/5％CO2下孵育不同的时间周期(30min、1小时、2小时或4小时)，并且然后立即在冰上冷却。使用冰冷FACS缓冲液洗涤细胞两次并且然后使用4％PFA固定20min。固定之后，使用抗人IgGAlexa-Fluor488对细胞进行染色，并且通过BDLSRII机器和BDFACSDivaTM软件来进行分析。使用FlowJo软件分析数据。受体-抗体复合体内化被计算为相对于在扣除来源于未处理对照的MFI背景值之后在冰上的荧光强度的在37℃下的平均荧光强度(MFI)损失百分比。图12示出双特异性抗体(Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH)可以诱导比任何单一单特异性抗体或抗体组合更快和更强的内化。帕妥珠单抗、AZ1.39.1、曲妥珠单抗+帕妥珠单抗、帕妥珠单抗+39S以及曲妥珠单抗+帕妥珠单抗+39S具有类似于或低于39S的内化特征并且在图形中未示出。在细胞系NCI-N87、MDA-MB-361以及RT-112中观察到类似结果(数据未示出)。共聚焦显微镜方法被用来可视化抗体内化和溶酶体运输。从T-150烧瓶中收获BT-474细胞并且重新悬浮于冰冷培养基中，并且然后以2.5×105个细胞/孔添加至96孔U型底板中。在4℃下通过离心来沉淀细胞。弹去培养基，并且将细胞沉淀物重新悬浮于150μL的存在10μg/mL有待测试的抗体(诸如R347IgG1同种型对照、曲妥珠单抗、Bs2Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH)的冰冷培养基中。将细胞在37℃/5％CO2下孵育不同的时间周期(30min、2小时、4小时或6小时)，并且然后立即在冰上冷却。使用冰冷FACS缓冲液洗涤细胞两次并且然后根据制造商说明书使用BD生物科技公司(BDBiosciences)Cytofix/CytopermTM固定/透化溶液进行固定和透化。使用抗人IgGAlexa-Fluor488和小鼠抗人LAMP-1(克隆H4A3)接着使用抗小鼠IgGAlexa-Fluor647在黑暗中对细胞进行染色。染色后，将细胞旋转涂片到正电荷载玻片上并且使用含有DAPI的GoldAntifade试剂用盖玻片盖好。然后通过LeicaSP5共聚焦显微镜和Leica应用套件高级荧光软件套件来可视化细胞。图13示出抗体内化和对溶酶体的运输。Bs2Ab-39SH和Bs4Ab-39SH两者促进比曲妥珠单抗更快的内化和更强的溶酶体运输，这显示很少甚至没有内化(针对Bs4Ab-39SH的数据未示出)。蛋白质印迹分析被用来监测HER2的溶酶体降解。收获BT-474细胞，洗涤并且重新悬浮于培养基中。以5×104个细胞/孔的密度将细胞种于96孔板中并且使用500nM浓度下的有待测试的抗体(R347IgG1同种型对照、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、39S、曲妥珠单抗+帕妥珠单抗、曲妥珠单抗+39S、帕妥珠单抗+39S、曲妥珠单抗+帕妥珠单抗+39S、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH以及Bs4Ab-39SH)在37℃/5％CO2下进行处理，持续2小时、6小时或24小时。在处理结束时，使用冰冷1xPBS洗涤细胞两次并且然后根据制造商说明书溶解于来自赛默飞科技公司的M-PER哺乳动物蛋白质提取缓冲液中。通过BCA测定来测量每种溶解产物的蛋白质浓度。将等量每种溶解产物中的蛋白质负载到蛋白质印迹中的凝胶上。兔抗人HER2(克隆29D8)抗体和兔抗人GAPDH(克隆D16H11)抗体被用来分别检测HER2和GAPDH。图14示出使用双特异性抗体(Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH或Bs4Ab-39SH)的处理引起BT-474细胞中的显著HER2降解，并且单特异性抗体或抗体组合诱导没有或有限的HER2降解。实例33.1.对用于位点特异性轭合和用于消融Fcγ受体结合活性的位点特异性突变体进行克隆标准重叠PCR方法被用来独立地或组合地(L234F-S239C(FC)和L234F-S239C-S442C(FCC))将突变L234F、S239C以及S442C引入Bs2Ab-39SH和Bs4Ab-39SH构建体的Fc部分中。引物被设计成含有希望的突变，并且含有限制性位点以促进定向克隆的侧翼引物被用来扩增含有特定突变的Fc片段。使用限定的限制性位点将修饰的FcPCR产物克隆到哺乳动物表达载体中。通过DNA序列分析来证实Fc突变的身份。图15示出具有用于位点特异性轭合的氨基酸取代的三种抗HER2双特异性抗体(Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH)的说明。另外，抗体重链CH2上的L234F取代(图中未描绘)被用来使Fcγ受体结合最小化。在希望2DAR的情况下，在位点1(例如，S239C)或位点2(例如，S442C)处工程化半胱氨酸取代，并且对于4DAR，在这两个位点处工程化半胱氨酸取代。双特异性药物构建体在此又称为Bs2-2T/Bs2-4T、Bs3-2T/Bs34T以及Bs4-2T/Bs4-4T。所得双特异性抗体被轭合至主要如下所述的微管溶素1508有效负载上(参见实例5)。3.2.双特异性ADC的结合特异性和物种交叉反应性为了确定轭合微管溶素1508是否改变抗原结合特异性和物种交叉反应性，通过如在实例1中所述的捕获ELISA来证实双特异性ADC与人EGFR、人HER2、人HER3、人HER4、小鼠Her2以及食蟹猴Her2的重组细胞外结构域蛋白的结合活性。结果显示轭合不改变双特异性ADC的抗原结合特异性和物种交叉反应性。Bs2-4T和Bs4-4T两者可以与其未轭合形式相同的功效结合至人HER2和食蟹猴Her2；并且它们中没有一个显示结合至人EGFR、HER3、HER4或小鼠Her2(数据未示出)。通过BIAcore来确定双特异性ADC与人HER2的结合动力学，并且结果显示针对Bs2-4T对人HER2的亲和力(KD)是120pM，并且针对Bs4-4T是271pM。3.3.通过双特异性ADC来破坏细胞内微管网络为了检查通过抗HER2ADC对细胞内微管网络的破坏，选择了三种细胞系：SKOV-3、JIMT-1以及RT112，这些分别代表T-DM1适合、T-DM1未响应者以及T-DM1不适合。在第1天，通过胰蛋白酶消化来收获细胞，将其重新悬浮于培养基中，并且然后以6×104个细胞/孔的密度种于8孔腔室载玻片中。在37℃/5％CO2下孵育载玻片过夜。在第2天，吸出培养基以去除任何未附着的细胞并且然后将含有5nM有待测试的ADC的新鲜培养基添加至细胞中。在37℃/5％CO2下孵育载玻片过夜。在第3天，使用1xPBS洗涤每个腔室两次。然后使用4％PFA固定细胞，持续20min。在固定结束时，去除腔室并且根据标准免疫荧光程序对载玻片进行染色。简单地说，使用TritonX-100透化细胞并且使用含有吐温-20的1xPBS洗涤。以1∶100将兔抗人α-微管蛋白Alexa-Fluor488(克隆11H10)稀释在DAKO抗体稀释物中并且添加至载玻片中。在室温下孵育1小时之后，使用含有DAPI的GoldAntifade试剂用盖玻片盖好。通过LeicaSP5共聚焦显微镜和Leica应用套件高级荧光软件套件来可视化染色的细胞。图16A示出，在SKOV-3(代表T-DM1适合的患者的细胞系)中，T-DM1和Bs2-4T两者能够破坏微管网络。在SKBR-3细胞中观察到类似的结果(数据未示出)。图16B示出，在JIMT-1(代表T-DM1未响应者患者的细胞系)中，仅Bs2-4T能够破坏细胞内微管网络。图16C示出，在RT-112(代表T-DM1不适合的患者的细胞系)中，Bs2-4T能够破坏细胞内微管网络，而T-DM1是无效的。3.4.双特异性ADC的体外活性表达不同水平HER2的一组人癌症细胞系被用来评估双特异性ADC的细胞毒性活性(实例1中的表5)。简单地说，收获细胞，将其重新悬浮并且以100μL的体积，以96孔板的每个孔5,000至20,000的密度(取决于每种细胞系的生长动力学)将细胞铺放在含有血清的培养基中。通过将测试物品稀释在培养基中制备有待测试的每种剂量抗体或ADC的2X浓缩物。一式三份将100微升每种测试物品添加至细胞中，这样使得最终剂量曲线在以逐步1∶4系列稀释从5nM降至0.08pM范围内。在37℃/5％CO2下孵育经过处理的细胞持续3至4天，取决于每种具体细胞系的生长动力学。根据制造商说明书，使用细胞滴度Glo来确定细胞活力。通过GraphPadPrism软件分析数据，并且作为相对于未处理的对照的生长抑制百分比呈现。使用具有GraphPadPrism软件的S形非线性回归分析来确定EC50值并且概括于表6中。表6：一组癌症细胞系中抗HER2ADC的体外功效(以pM计的EC50)细胞系T-DM1Bs2-2TBs4-2TBs2-4TBs4-4TSKBR-382.612.910.44.02.6NCI-N87275.136.825.623.720.0SKOV-3116.113.68.98.75.6MDA-MB-361266.015.110.04.02.7JIMT-1无活性的13.37.15.13.1MDA-MB-453344.319.013.010.58.6RT-112无活性的4635293836.523.5MCF7-GTU无活性的无活性的无活性的84.561.4ZR-75-1无活性的1543753.518.120.9T47D无活性的无活性的无活性的无活性的无活性的MCF-7无活性的无活性的无活性的无活性的无活性的MDA-MB-468无活性的无活性的无活性的无活性的无活性的图17A示出在SKBR-3(代表T-DM1适合的患者的人乳癌细胞系)中，Bs2-2T和Bs2-4T相对于T-DM1和不同对照的细胞毒性活性。数据指示在SKBR-3细胞中，Bs2-2T和Bs2-4T两者比T-DM1更有效。图17B示出在SKBR-3(代表T-DM1适合的患者的人乳癌细胞系)中，Bs4-2T和Bs4-4T相对于T-DM1和不同对照的细胞毒性活性。数据指示在SKBR-3细胞中，Bs4-2T和Bs4-4T两者比T-DM1更有效。图18A示出在JIMT-1(代表T-DM1适合但未响应者的患者的人乳癌细胞系)中，Bs2-2T和Bs2-4T相对于T-DM1和不同对照的细胞毒性活性。数据指示Bs2-2T和Bs2-4T两者在杀伤JIMT-1细胞上是非常有效的，而T-DM1示出无活性。图18B示出在JIMT-1(代表T-DM1适合但未响应者的患者的人乳癌细胞系)中，Bs4-2T和Bs4-4T相对于T-DM1和不同对照的细胞毒性活性。数据指示Bs4-2T和Bs4-4T两者在杀伤JIMT-1细胞上是非常有效的，而T-DM1示出无活性。图19A示出在ZR-75-1(代表T-DM1不适合的患者的人乳癌细胞系)中，Bs2-2T和Bs2-4T相对于T-DM1和不同对照的细胞毒性活性。数据指示Bs2-4T在杀伤ZR-75-1细胞上是最有活性的，而Bs2-2T具有较低水平的活性并且T-DM1示出无细胞毒性活性或限制的细胞毒性活性。图19B示出在ZR-75-1(代表T-DM1不适合的患者的人乳癌细胞系)中，Bs4-2T和Bs4-4T相对于T-DM1和不同对照的细胞毒性活性。数据指示Bs4-4T在杀伤ZR-75-1细胞上是最有活性的，而Bs4-2T具有较低水平的活性并且T-DM1示出无细胞毒性活性或限制的细胞毒性活性。图20示出在MDA-MB-468(不具有HER2表达的人乳癌细胞系)中，Bs2-2T和Bs2-4T相对于T-DM1和不同对照的细胞毒性活性。数据指示Bs2-2T或Bs2-4T在MDA-MB-468细胞中都不是有效的，从而指示Bs2-2T和Bs2-4T的细胞毒性活性是靶标(即HER2)依赖的。对于Bs4-2T和Bs4-4T观察到类似的结果(数据未示出)。3.5.双特异性ADC构建体的体内活性基于细胞系的异种移植物(CBX)肿瘤模型和患者来源的异种移植物(PDX)肿瘤模型：依从实验室动物护理评估和鉴定协会(AAALAC)公开的准则和MedImmune公司机构动物保护和使用委员会批准的方案进行所有小鼠实验。在研究中使用4-8周龄之间的无胸腺裸鼠。在皮下CBX模型中，使用从特定传代批下的培养物中收获的肿瘤细胞在右翼上对动物进行单侧注射。在正位CBX模型中，通过将每个小鼠5×106个细胞(悬浮于50％基质胶中)注入动物右翼上的乳房脂垫中来建立异种移植物。在PDX模型中，使用从宿主动物中收获的肿瘤片段在侧翼上对动物进行单侧植入，每种宿主动物从特定传代批中植入。在其评估开始日期之前大约一周开始对每个实验记录研究前肿瘤体积。当肿瘤达到适当的肿瘤体积开始(TVI)范围(典型地150-250mm3)时，将动物随机化成处理组和对照组并且开始给药。除非另外指出，否则每周一次对动物进行给药，其中测试物品通过静脉内或腹膜内注射。每日观察动物并且测量肿瘤尺寸和体重，并且每周两次进行记录。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝π÷6(长度×宽度2)。肿瘤生长曲线呈现为平均肿瘤体积(mm3)±SEM。图21A示出甚至在更低浓度(1mg/kg)下，Bs2-4T在MDA-MB-361模型(代表T-DM1不适合的患者的人乳癌CBX肿瘤模型)中相对于T-DM1(3mg/kg)和不同对照(所有都在3mg/kg下)具有更高的体内活性。数据证实了Bs2-4T诱导剂量依赖性肿瘤生长抑制，并且在3mg/kg剂量下，Bs2-4T诱导完全肿瘤消退而T-DM1示出限制的活性。在3mg/kg下，Bs4-4T还展现出相对于T-DM1的更高体内活性(图21B)。图22示出在ST996模型中，Bs2-2T相对于Bs2-4T和T-DM1的体内活性。ST996是来源于三阴性乳癌患者(HER2IHC：1+；ER-；PR-)的原代PDX模型。数据证实了在3mg/kg剂量下的Bs2-2T诱导有力的肿瘤生长抑制，虽然与Bs2-4T相比它的抗肿瘤功效略微降低。相反，T-DM1在ST996模型中示出无活性。在另外的低HER2表达PDX模型ST738、ST455B以及ST821中观察到类似的结果(数据未示出)。图23示出在ST225模型(代表T-DM1适合的患者的人乳癌PDX肿瘤模型)中，Bs2-4T相对于T-DM1和不同对照的体内活性。数据证实了在3mg/kg剂量下的Bs2-4T诱导完全和持久的肿瘤消退。相反，T-DM1仅在处理期过程中诱导肿瘤停滞并且停止在处理之后迅速地肿瘤重新生长。图24示出在JIMT-1模型(代表T-DM1适合但未响应者的患者的人乳癌CBX正位肿瘤模型)中，Bs2-4T相对于T-DM1和不同对照的体内活性。数据证实了在3mg/kg剂量下的Bs2-4T诱导完全和持久的肿瘤消退。相反，T-DM1或T-DM1加上帕妥珠单抗组合示出无活性。图25示出在ST455B模型中，Bs2-4T相对于T-DM1和不同对照的体内活性。ST455B是来源于三阴性乳癌患者(HER2IHC：1+、ER-、PR-)的原代PDX模型。数据证实了在3mg/kg剂量下的Bs2-4T诱导完全肿瘤消退而T-DM1示出无活性。为了进一步扩大在图25中示出的发现，我们检查了在另外16个PDX模型中的Bs2-4T，这些模型来源于具有相对低水平HER2表达(通过HercepTest得到的+1至+2)的乳癌患者。在这些模型的选择中还考虑到其他标准(包括HER2表达的异质性程度、ER/PR状态以及病理组织学子类)来使研究中的肿瘤亚型多样性最大化。表7概括了在这些17个不同PDX乳癌模型中的Bs2-4T体内活性。Bs2-4T证实了与肿瘤的病理组织学子类和ER/PR状态无关的有效抗肿瘤活性。在1mg/kg的剂量下，41％的肿瘤模型示出肿瘤消退并且6％示出肿瘤停滞。在3mg/kg的剂量下，71％的模型示出肿瘤消退并且12％示出肿瘤停滞。这些研究证实了与单特异性ADC疗法(例如T-DM1)相比，本发明的双特异性ADC在宽范围乳癌模型上的卓越活性。具体地说，本发明的双特异性ADC在具有低水平HER2表达的癌症模型和在T-DM1未响应者患者的模型中具有体内活性。表7：Bs2-4T在一组代表低HER2/T-DM1不适合的患者的PDX乳癌模型中的体内功效的概述。在示出对Bs2-4T处理的最大应答的时间点处，如果与开始给药下的肿瘤体积(TVI)相比肿瘤体积减小，则体内功效表达为随TVI的肿瘤体积变化百分比。另外，体内功效表达为相对于媒介物对照的肿瘤体积变化百分比。如果肿瘤体积减小＞20％，对处理的响应性分类为“消退”，如果肿瘤体积变化＜20％，则分类为“停滞”并且如果肿瘤体积增加＞20％，则分类为“进展”。3.6.双特异性ADC在具有获得性T-DM1抗性的肿瘤模型中的活性通过使用逐渐增加浓度高达至5μg/mL的T-DM1的连续处理来产生具有获得性对T-DM1的抗性的NCI-N87细胞。如在实例3中所述，在亲本和抗性细胞系两者中检查Bs2-4T相对于T-DM1的体外细胞毒性活性。图26A中示出的结果指示Bs2-4T和T-DM1两者在亲本NCI-N87细胞中是有效的，虽然Bs2-4T比T-DM1更有效(左图)。在抗性细胞系中，T-DM1失去活性，而Bs2-4T仍在杀伤抗性细胞上有效的(右图)。还通过使用T-DM1(包括BT-474、SKOV-3以及MDA-MB-361)的连续处理来产生其他抗性细胞系，并且在这些抗性细胞系中针对Bs2-4T观察到类似的细胞毒性活性(数据未示出)。为了建立具有获得性T-DM1抗性的体内肿瘤模型，将T-DM1抗性的NCI-N87细胞皮下注入免疫缺陷的小鼠中。使用3mg/kg的T-DM1来处理荷瘤小鼠。可以看出，体外T-DM1抗性不能完全翻译成体内抗性，通过动物之中的肿瘤生长大量的变化来反映。因此，选择具有大型顽固性肿瘤(以体积计大约1000mm3)的小鼠，并且将肿瘤组织片段传代至新小鼠直到在3mg/kgT-DM1的每周处理存在下肿瘤一致生长。在三代之后，稳定的抗性肿瘤演变并且对这些肿瘤进行片段化并且植入小鼠中，以便评估Bs2-4T的体内活性。如在图26B中所证实，由重复的T-DM1处理复发的肿瘤不仅对T-DM1有抗性，而且对T-DM1和曲妥珠单抗组合处理无反应。相反，Bs2-4T在处理之后诱导有力和持续的肿瘤消退，从而表明其作为用于T-DM1复发/顽固性患者的有效疗法的潜力。图26B示出Bs2-4T在T-DM1抗性NCI-N87肿瘤模型中诱导肿瘤消退。响应于每周静脉内给药Bs2-4T(3mg/kg)、T-DM1(3mg/kg)或其他对照抗体/ADC(3mg/kg，除了对于帕妥珠单抗是10mg/kg)总共4次剂量的肿瘤生长曲线作为平均肿瘤体积(mm3)±SEM(n＝7)示出。与未处理的对照组比较，由学生t检验得到*P＜0.001。3.7.双特异性ADC的体内抗肿瘤活性不会被曲妥珠单抗的预处理所衰减在无胸腺裸鼠的侧翼上单侧地植入ST225PDX肿瘤片段。将小鼠随机化成处理组和对照组并且当肿瘤体积达到200-250mm3时开始给药。在处理组中，使用媒介物缓冲液或曲妥珠单抗(3mg/kg)对小鼠进行给药。三天后，小鼠接受每周静脉内注射Bs2-4T总共4次剂量。图27示出曲妥珠单抗的预处理不会衰减Bs2-4T在ST225PDX模型中的抗肿瘤活性，从而表明如果使用Bs2-4T来治疗对曲妥珠单抗或T-DM1复发/顽固性的患者的话，可以不需要清洗期。ST225是具有HER2过表达的原代乳癌PDX模型。响应于不同处理的肿瘤生长曲线在图27中作为平均肿瘤体积(mm3)±SEM(n＝10)呈现。3.8.双特异性ADC的旁观者效应使用绿色荧光蛋白(GFP)稳定转染NCI-N87细胞，并且使用红色荧光蛋白(RFP)稳定转染MDA-MB-468细胞。收获这两种细胞系，洗涤，重新悬浮于培养基中，并且然后种于6孔板的相同孔中作为共培养物。作为对照，将每个细胞系种于不同6孔板中作为单一培养物(图28A)。为了调节至不同生长动力学，以5×105个细胞/孔种下NCI-N87细胞并且以2×105个细胞/孔种下MDA-MB-468细胞。在37℃/5％CO2下孵育细胞2天。吸出培养基并且将含有5nM有待测试的抗体或ADC的新鲜培养基添加至细胞中，并且在37℃/5％CO2下孵育板4天。在处理结果时，收集每个孔中的细胞，洗涤，重新悬浮于100μL的冰冷FACS缓冲液中并且然后使用2％PFA来固定。通过BDLSRII机器和BDFACSDivaTM软件来分析细胞。使用FlowJo软件分析数据。图28证实了Bs2-4T可杀伤共培养物中的HER2过表达细胞和无HER2细胞两者，从而表明Bs2-4T具有旁观者效应。相反，T-DM1不能杀伤共培养物中的无HER2细胞，从而表明它不具有旁观者效应。作为对照，Bs2-4T和T-DM1两者示出对单一培养物中的NCI-N87细胞的有效杀伤，并且Bs2-4T或T-DM1都没有示出对单一培养物中的MDA-MB-468细胞的杀伤。3.9.双特异性ADC对抗癌症干细胞的活性癌症干细胞球体测定：在标准组织培养条件下，在补充有20％FBS的莱博维茨(Leibovitz)的L-15培养基中培养MDA-MB-361细胞。通过胰蛋白酶消化收获细胞，使用PBS洗涤两次，并且重新悬浮于干细胞培养基(补充有20ng/mLEGF、10ng/mLbFGF、5mg/mL胰岛素、0.4％BSA以及1％敲除血清替代品的SCM：DMEM/F12)中达到30,000个细胞/mL。为了形成原代球体，将1mL细胞铺放到24孔超低附着板中并且使用10pMR347-4T、T-DM1或BS2-4T处理，并且在37℃/5％CO2下孵育4天。在处理结束时，收获原代球体，使用0.05％胰蛋白酶解离并且以30,000个细胞/mL的密度重新悬浮于含有与原代球体培养相同的抗体处理的SCM中。然后一式三份将细胞铺放到96孔超低附着板中并且孵育4天。根据制造商说明书，使用细胞滴度Glo来确定球体细胞活力。数据呈现为相对于未处理的对照的CSC球体形成倍数。图29(左图)示出Bs2-4T使CSC球体形成抑制84％并且T-DM1对抑制CSC球体形成没有活性。在其他癌症细胞系(包括BT-474、JIMT-1以及T47D)中观察到类似结果(数据未示出)。在使用Bs2-4T处理的异种移植瘤中评价癌症干细胞：切除来自评估Bs2-4T体内活性的MDA-BM-361异种移植物研究的肿瘤，切成4mm小片并且使用Cryostor进行冻存。在37℃下融化冷冻的肿瘤小片，用汉克斯平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次并且使用无菌手术刀刀片进一步切碎。为了获得单细胞悬浮液，然后将肿瘤小片与200单位的超纯胶原酶III/mLDMEM/F12培养基混合。在37℃下孵育肿瘤悬浮液持续大约1小时，其中每30分钟进行机械破坏。在孵育结束时，通过70-μm尼龙筛过滤细胞并且使用HBSS洗涤两次。在最后一次洗涤之后，使细胞放入穿过40-μm细胞滤器并且使用Vi-CellXR细胞活力分析仪进行计数。使用干细胞技术公司(StemcellTechnologies)Aldefluor试剂盒并且根据制造商说明书测定细胞的醛脱氢酶活性作为CSC量度。在LSRII流式细胞仪上运行细胞并且使用FlowJo进行分析。图29(右图)示出在MDA-MB-361乳癌异种移植物模型中，使用Bs2-4T的处理引起CSC降低54％。实例44.1.无岩藻糖基化的双特异性抗体产生和表征使用POTELLEGENTTM技术(新泽西州普林斯顿Biowa公司)表达双特异性抗体以便产生具有增强的ADCC活性的无岩藻糖基化的抗体。表8示出如通过BIAcore所测量的Bs2Ab-39SH和Bs4Ab-39SH双特异性抗体以及结合至Fcγ受体(FcγR)和C1q的具有岩藻糖基化(Fuc)和不具有岩藻糖基化(_aFuc)的曲妥珠单抗的KD(nM)，从而证实了无岩藻糖基化的抗体具有增强的与FcγRI以及FcγRIIIa的这两个等位基因的结合。表8：由BIAcore测量的KD(nM)平衡结合常数的测量：人Fcγ受体：在ProteOnXPR36仪器上测量对于抗HER2双特异性抗体与人FcγR结合的结合常数(KD)。简单地说，使用如仪器制造商所述的标准氨基偶联化学性质，在高密度下将双特异性抗体固定在GLC传感器芯片上。IgG的最终表面密度测量为大约3000RU。还使用除去蛋白质的相同固定方案而在此传感器芯片上制备了参考流细胞。在仪器缓冲液(含有50mM磷酸盐，pH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA以及0.005％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水[PBS]/吐温/乙二胺四乙酸[EDTA]缓冲液)中制备4000nM、16,000nM或32,000nM的每种FcγR的储备溶液，并且然后在相同缓冲液中连续稀释(1∶3)以便获得每种受体的希望的浓度系列：1.82nM-4,000nM(FcγRI)、197.5nM-16,000nM(FcγRIIA)、395.1nM-16,000nM(FcγRIIb)、21.9nM-16,000nM(hFcgRIIIA-158V)以及395-32,000mM(FcγRIIIA-158F)。在双特异性抗体和参考细胞两者表面上以25μL/min的流速注射每种浓度的FcγR，持续8min，在此过程中收集结合数据。在注射之间，使用60秒脉冲5mMHCl来再生表面(即，去除结合的FcγR)。还贯穿注射系列，散布若干缓冲液注射。后来，这些缓冲液注射中的一种连同参考细胞数据一起被用来通过普遍称为“双重参考”(Myszka，1999)的技术校正任何注射伪像(例如，非特异性结合)的结合数据。在收集所有结合数据之后，对各个浓度(C)下的结合(在平衡状态[Req]下的反应)的个别数据集合取平均值，并且然后将其拟合至1∶1结合等温(在平衡状态下的反应对比浓度)图。由此，使用供应商的评估软件3.1.0.6版本来衍生平衡结合常数KD。平衡结合常数的测量：人FcRn蛋白：在ProteOnXPR36仪器上测量对于双特异性抗体与人FcRn蛋白(huFcRn)结合的亲和力(KD)。简单地说，使用如上所述的标准氨基偶联化学性质，在高密度下将双特异性抗体固定在GLC传感器芯片上。在仪器缓冲液(含有150mMNaCl以及0.05％吐温-20的50mM磷酸钠缓冲液，pH6)中制备3000nM的huFcRn蛋白的储备溶液，并且然后在相同缓冲液中连续稀释(3∶1)至1.37nM。在串联连接的双特异性抗体和参考细胞表面上，以25μL/min的流速依次注射每种浓度的huFcRn持续16min。收集结合数据，接着在注射每种受体或缓冲液空白之间60秒注射含有150mMNaCl和0.05％吐温20的50mM磷酸钠缓冲液，pH7.4以便再生IgG表面(即，去除结合的huFcRn蛋白)。还贯穿注射系列，散布若干缓冲液注射。后来，使用这些缓冲液注射中的一种连同参考细胞数据来通过“双重参考”(Myszka，1999)校正注射伪像(例如，非特异性结合)的原数据集合。在收集所有结合数据之后，对各个浓度(C)下的结合(Req)的个别数据集合取平均值，并且然后将其拟合至1∶1结合等温(在平衡状态下的反应对比浓度)图。由此，使用供应商的BIA评估软件4.1版本来衍生平衡结合常数KD。结果显示双特异性抗体具有与常规IgG1可比较的类似KD值。4.2.无岩藻糖基化的双特异性抗体的体外活性使用在实例1中描述的方法来确定无岩藻糖基化的双特异性抗体在抑制配体驱动的细胞增殖方面的活性。结果显示无岩藻糖基化的Bs2Ab-39SH、无岩藻糖基化的Bs3Ab-39SH以及无岩藻糖基化的Bs4Ab-39SH在MDA-MB-361细胞(图30A)和MCF-7细胞(图30B)中具有类似的抗增殖功效，这还与亲本抗体组合(39S加上曲妥珠单抗)的活性可比较。在其他细胞系(包括NCI-N87和RT-112)中观察到类似结果(数据未示出)。4.3.无岩藻糖基化的双特异性抗体的增强的ADCC活性使用KC1333(表达FcγRIIIa的人自然杀伤(NK)细胞系)作为效应子细胞并且使用MDA-MB-361细胞系作为ADCC测定中的靶细胞以便评估抗HER2抗体的ADCC活性。收获这两种细胞系，洗涤并且重新悬浮于测定培养基中。以1×106个细胞/mL的密度重新悬浮KC1333并且以4×105个细胞/mL的密度重新悬浮MDA-MB-361。将50微升每种细胞系添加至96孔U形底板中的孔中，以便达到1∶2.5的靶标：效应子。通过将测试物品稀释在测定培养基中制备每种剂量抗体的3X浓缩物。一式三份将50微升每种测试物品添加至细胞中，这样使得最终剂量曲线在以逐步1∶4系列稀释从10μg/mL降至0.15ng/mL范围内。对板进行离心以使每个孔中的细胞沉淀并且然后在37℃/5％CO2下孵育过夜。第二天，根据制造商说明书使用普洛麦格公司的CytoTox非放射性细胞毒性测定来定量每个孔的上清液中的LDH。使用GraphPadPrism软件分析数据，并且作为相对于未处理的对照的细胞毒性百分比呈现。图31A至31C示出无岩藻糖基化的双特异性抗体相对于曲妥珠单抗和无岩藻糖基化的曲妥珠单抗在MDA-MB-361细胞中的ADCC活性。数据表明无岩藻糖基化的抗体的ADCC活性高于其岩藻糖基化的形式，并且无岩藻糖基化的双特异性抗体之间的ADCC功效的范围是Bs2Ab-39SH_aFuc＞Bs4Ab-39SH_aFuc＞Bs3Ab-39SH_aFuc。在其他细胞系包括BT-474、NCI-N87、MDA-MB-453、T47D以及JIMT-1中观察到类似结果(数据未示出)。实例55.1.微管溶素1508有效负载合成除非另外说明，否则用于轭合的如在图32中所示的微管溶素1508细胞毒素有效负载的合成在以下说明性实例中详细说明，其中：(i)以摄氏度(℃)给出温度；当在室温或环境温度下进行操作时，即，在18℃-25℃的范围内，除非另外说明；(ii)经过无水硫酸钠或硫酸镁干燥溶液；在减压(4.5-30mmHg)下使用旋转蒸发器进行有机溶剂的蒸发，其中浴温高达至30℃；(iii)色谱法意指硅胶上的快速色谱法；在硅胶板上进行薄层色谱法(TLC)；(iv)通常，反应期之后是TLC或液相色谱法/质谱法(LC/MS)，并且仅出于说明给出反应时间；(v)最终产物具有满意的质子核磁共振(NMR)谱和/或质谱数据；(vi)仅出于说明给出产率并且不必是可通过酌情工艺开发所获得的那些；如果要求更多材料，重复制备；(vii)当给定的核磁共振(NMR)数据是以主要诊断质子的δ(delta)(δ)值形式时，给出在300或400MHz下在d6-DMSO中确定的相对于作为内标物的四甲基硅烷(TMS)的一百万分之一(ppm)，除非另外说明；(viii)化学符号具有它们通常的意义；(ix)以体积：体积(v/v)方式给出溶剂比；并且(x)使用以下方法中的一种或多种进行化合物的纯化：a)在常规硅胶上进行的快速色谱法；b)使用Isco分离系统：RediSep正相快速柱，流速30-40ml/min(ISCOMPLC)，在硅胶上进行的快速色谱法；请添加ISCO反相柱c)GilsonsemiprepHPLC分离系统：YMCpackODS-AQ柱子，100×20mm，S5μm12nm，水(0.1％三氟乙酸)和乙腈(0.1％三氟乙酸)作为溶剂，运行20min；化合物T1向(2R，4R)-4-甲基哌啶-2-甲酸(2g，13.97mmol)在MeOH(40mL)和水(40.0mL)中的溶液中添加多聚甲醛(2.52g，27.94mmol)和Pd/C(10％)(0.8g，7.52mmol)。在室温下，在氢气气氛下搅拌反应混合物过夜。通过TLC，反应未完成。添加另一个当量的多聚甲醛(2.52g，27.94mmol)并且将反应混合物再搅拌24小时。TLC指示反应完成并且过滤反应混合物，使用MeOH(2×30mL)洗涤催化剂。在真空中浓缩滤液以得到呈白色固体的粗产物，使用乙醚(3×30mL)洗涤该粗产物，在高真空中干燥过夜以得到呈白色固体的(2R，4R)-1，4-二甲基哌啶-2-甲酸(T1)(1.870g，85％)。LC-MS：158(M+1)；1HNMR(400MHz，重水)δppm0.97(d，J＝5.52Hz，3H)，1.54(br.s，1H)，1.71-1.87(m，3H)，1.91-2.07(m，1H)，2.84(s，3H)，3.13(td，J＝8.41，3.76Hz，1H)，3.35(m，1H)，3.65(m，1H)。化合物T2将二碳酸二叔丁酯(243.0g，1.1mol)逐滴添加至(R)-3-氨基-4-甲基戊酸(商业上可获得)(133.0g，1.0mol)和Na2CO3(212g，2.0mol)在丙酮(1L)和水(1L)中的悬浮液中，同时在室温下搅拌。搅拌反应混合物过夜并且在减压下去除有机溶剂。使用水(1L)稀释残余物并且使用EtOAc(500mL×3)洗涤。使用2NHCl溶液对水相进行酸化达到pH＝3，并且使用EtOAc(800mL×3)萃取所得混合物。使用盐水(800mL×1)洗涤合并的萃取物，干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以便得到呈油状物的化合物(T2)(224.0g，97％产率)，该化合物无需进一步纯化而用于下一步中。化合物T3将三乙胺(67g，0.61mol)添加至化合物(T2)(140.0g，0.61mol)和N，O-二甲基羟胺盐酸盐(74.1g，0.76mol)在CH2Cl2(1.4L)中的悬浮液中，同时在0℃下搅拌。搅拌悬浮液0.5小时并且在0℃下按份添加EDCI(74g，0.61mol)。在0℃下搅拌反应混合物2小时并且添加水(800mL)。分离有机相，使用5％KHSO4溶液(800mL×3)、饱和NaHCO3溶液(800mL×3)以及盐水(800mL×1)洗涤，干燥(无水Na2SO4)并且浓缩至干燥。通过快速柱色谱法在硅胶(EtOAc/己烷＝1∶5)上纯化残余物，得到呈油状物的化合物(T3)(141.0g，84％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ5.26(m，1H)，3.75(m，1H)，3.70(s，3H)，3.15(s，3H)，2.60～2.80(m，2H)，1.85(m，1H)，1.41(s，9H)，0.90(d，J＝6.6Hz，3H)，0.88(d，J＝6.6Hz，3H)。化合物T4将碘乙烷(250.0g，1.6mol)添加至化合物(T3)(55.0g，0.2mol)在DMF(1.1L)中的溶液中，同时在0℃下搅拌。然后在0℃下按份添加NaH(60％悬浮液，24.0g，0.60mol)，并且允许反应混合物加温至室温且搅拌12小时。使用水(2L)小心地猝灭反应并且添加EtOAc(2L)。分离有机相，使用5％KHSO4溶液(800mL×3)、饱和NaHCO3溶液(800mL×3)以及盐水(800mL×1)洗涤，干燥(无水Na2SO4)并且浓缩至干燥。通过快速柱色谱法在硅胶(EtOAc/己烷＝1∶10)上纯化残余物，得到呈油状物的化合物(T4)(35.1g，58％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ3.70(s，3H)，3.65(m，1H)，3.10-3.30(m，5H)，2.50-2.95(m，2H)，1.90-2.20(m，1H)，1.40～-.55(m，9H)，1.10(t，J＝7.2Hz，3H)，0.90(d，J＝6.6Hz，3H)，0.88(d，J＝6.6Hz，3H)。化合物T5在-78℃下，在N2下将正丁基锂(106ml，2.5N己烷溶液，0.17mol)逐滴添加至2-溴-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)噻唑(74g，0.24mol)(如在微泊夫P(Wipf，P)等人，有机通讯(Org.Lett.)2007，9(8)，第1605页中所述的制备)在干燥THF(500mL)中的溶液中，同时经过1小时搅拌。进一步搅拌悬浮液30min并且然后在-78℃下经过30min逐滴添加化合物(T4)(51.0g，0.17mol)在干燥THF(300mL)中的溶液。在-78℃下搅拌反应混合物1小时并且然后允许加温至室温且搅拌12小时。使用20％水性氯化铵溶液(1L)猝灭反应，并且在减压下去除有机溶剂。用EtOAc(800mL×3)萃取所得混合物。使用5％KHSO4溶液(800mL×3)、饱和NaHCO3溶液(800mL×3)以及盐水(800mL×1)洗涤合并的有机相，干燥(Na2SO4)并且浓缩至干燥。通过快速柱色谱法在硅胶(EtOAc/己烷＝1∶10)上纯化粗材料，得到呈油状物的化合物(T54)(58.1g，73％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.53(m，1H)，4.90(s，2H)，4.04(m，1H)，3.35(m，2H)，3.15(m，2H)，2.00(m，1H)，1.40(s，9H)，0.80-1.20(m，18H)，0.14(s，6H)。化合物T6在室温下，经过0.5小时周期将LiBH4(4.8g，0.22mol)按份添加至化合物(T5)(47.1g，0.1mol)在甲醇(500mL)中的溶液中，同时进行搅拌。搅拌悬浮液2小时并且在减压下去除溶剂。将残余物溶解于EtOAc(800mL)中，并且使用饱和NaHCO3溶液(500mL×3)和盐水(500mL×1)洗涤所得溶液，干燥(Na2SO4)并且浓缩至干燥。通过快速柱色谱法(EtOAc/己烷＝1∶6)来纯化粗材料，得到化合物(T6)(13.5g，28％产率)和它的异构体(T6’)(21.0g，45％产率)。1HNMR(300MHz，氯仿-d)δppm-0.06-0.05(m，6H)0.76-0.89(m，15H)1.12(t，J＝6.97Hz，3H)1.39(s，9H)1.55-2.05(m，3H)2.86-3.21(m，2H)3.76-3.96(m，1H)4.73(d，J＝1.13Hz，4H)7.01(s，1H)。化合物T7在0℃下，将乙酰氯(45.2g，0.58mol)逐滴添加至化合物(T6)(34.0g，72mmol)在吡啶(500mL)中的溶液中，同时经过10min搅拌。允许反应物加温至室温并且搅拌12小时。使用水(200mL)猝灭反应并且在减压下去除溶剂。使用CH2Cl2(800mL)处理残余物，并且使用5％KHSO4溶液(800mL×3)、饱和NaHCO3溶液(800mL×3)以及盐水(800mL×1)洗涤所得混合物，干燥(Na2SO4)并且浓缩至干燥。通过快速柱色谱法在硅胶(EtOAc/己烷＝1∶10)上纯化粗材料，得到呈油状物的化合物(T7)(25.7g，69％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.15(m，1H)，5.95(m，1H)，4.84(s，2H)，4.04(m，1H)，3.10(m，2H)，2.35(m，1H)，2.15(s，3H)，2.00(m，1H)，1.70(m，1H)，1.45(s，9H)，1.25(t，J＝7.2Hz，3H)，0.80～1.10(m，15H)，0.08(s，6H)。化合物T8在0℃下，将四丁基氟化铵(65.3g，0.25mol)在THF(200mL)中的溶液逐滴添加至化合物(7)(25.7g，50mmol)在THF(300mL)中的溶液中，同时搅拌。允许反应物加温至室温并且搅拌4小时。添加水(800mL)并且在减压下去除有机溶剂。使用CH2Cl2(800mL)处理残余物，并且使用5％KHSO4溶液(800mL×3)、饱和NaHCO3溶液(800mL×3)以及盐水(800mL×1)洗涤所得混合物，干燥(Na2SO4)并且浓缩至干燥。通过快速柱色谱法在硅胶(EtOAc/己烷＝1∶4)上纯化粗材料，得到呈油状物的化合物(T8)(19.5g，98％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.26(m，1H)，5.95(m，1H)，4.83(m，2H)，4.10(m，1H)，3.17(m，2H)，2.40(m，1H)，2.20(s，3H)，2.18(m，1H)，1.75(m，1H)，1.56(s，9H)，1.10-1.30(m，3H)，0.80-1.05(m，6H)。化合物T9将戴斯-马丁试剂(32.7g，75mmol)添加至化合物(T8)(20.0g，50mmol)在二氯甲烷(300mL)中的溶液中并且在室温下搅拌反应混合物12小时。分别使用氢氧化钠溶液(1N，300mL×3)、硫代硫酸钠溶液(1N，300mL×3)、饱和NaHCO3(300mL×3)溶液以及盐水(300mL×1)洗涤混合物。干燥(Na2SO4)有机层并且浓缩至干燥以得到相应的醛。将此粗醛溶解于叔丁醇(500mL)中，并且在室温下经过1小时逐滴添加亚氯酸钠(80％，36.4g，320mmol)和磷酸二氢钠一水合物(105g，0.77mol)在水(300mL)中的溶液。搅拌反应混合物3小时并且使用盐酸溶液(0.1N，500mL)稀释。用EtOAc(500mL×1)萃取所得混合物，并且使用5％KHSO4溶液(500mL×3)和盐水(500mL×1)洗涤合并的有机层，经过Na2SO4干燥并且浓缩至干燥。通过快速柱色谱法在硅胶(CH2Cl2/MeOH＝100∶5)上纯化残余物，得到化合物(T9)(15.4g，58％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ9.90(brs，1H)，8.27(s，1H)，5.96(m，1H)，4.07(m，1H)，3.15(m，1H)，2.35(m，1H)，2.20(s，3H)，2.18(m，1H)，1.75(m，1H)，1.45(s，9H)，1.20(t，J＝7.2Hz，3H)，0.98(d，J＝6.6Hz，3H)，0.88(d，J＝6.6Hz，3H)。化合物T10在0℃下，向2-((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-((叔丁氧基羰基)(乙基)氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(T9)(6.5g，15.68mmol)在DCM(60mL)中的溶液中添加TFA(30mL)。在0℃下搅拌混合物1小时。真空蒸发溶剂以得到粗产物(T10)。该粗产物无需进一步纯化而用于下一步反应中(7.2克)。LC-MS：315(M+1)。化合物T11向2-((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-(乙基氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸4、三氟乙酸盐(T10)(5g，11.67mmol)和碳酸氢钠(9.80g，116.71mmol)在丙酮(300mL)和水(150mL)的混合物中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(3.94g，11.67mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。LCMS指示反应完成。使用盐酸对混合物进行酸化达到(pH2)并且在真空中蒸发丙酮。用DCM(3×300mL)萃取产物。使用0.1％HCl溶液(200mL)、盐水(200mL)洗涤合并的有机萃取物，经过Na2SO4干燥，并且在真空中蒸发。通过快速色谱法(硅胶，MeOH/DCM，从0％至5％的MeOH)纯化残余物，得到呈白色固体的2-((1R，3R)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)氨基)-1-乙酰氧基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(T11)(3.53g，54.6％)。LC-MS：537.2(M+1)；1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm0.84(d，J＝6.78Hz，3H)，0.92-1.05(m，5H)，1.14(d，J＝3.01Hz，1H)，1.73(dt，J＝10.23，6.43Hz，1H)，1.92-2.05(m，1H)，2.12-2.27(m，4H)，2.28-2.44(m，1H)，2.90-3.33(m，2H)，3.98(t，J＝9.29Hz，1H)，4.12-4.32(m，1H)，4.47-4.82(m，2H)，5.95(dd，J＝10.92，2.89Hz，1H)，7.29-7.45(m，4H)，7.55-7.69(m，2H)，7.72-7.81(m，2H)，8.22-8.29(m，1H)。化合物T12将DMAP(106g，0.86mol)添加至Boc-L-4-硝基-苯基丙氨酸(1800g，0.58mol)和麦氏酸(92g，0.64mol)在二氯甲烷(1.5L)中的溶液中。在-5℃下，在N2气氛下冷却所得溶液，接着经过1h添加二氯甲烷(1L)中的DCC(240g，1.16mol)。在0℃-5℃下搅拌混合物过夜。然后通过过滤去除沉淀的N，N’-二氯己基脲，并且使用5％水性HCl(1L×3)和盐水(1L×1)洗涤滤液，并且经过MgSO4干燥。在通过过滤去除MgSO4之后，浓缩有机相至干燥。使用EtOAc/己烷(1∶1，500mL)研磨残余物，并且干燥以得到呈黄色固体的化合物(T12)(130.0g，51％产率)。化合物T13在-5℃下，在N2下将AcOH(400mL)添加至化合物(T12)(130.0g，0.298mol)在二氯甲烷(1.5L)中的溶液中。经过2小时按小份添加固体NaBH4(22.7g，0.597mol)(气体逸出和放热)。在-5℃下再搅拌3h之后，TLC指示反应完全。使用盐水(1L)猝灭混合物。分离有机层，并且使用水(1L×2)、水性饱和NaHCO3(1L×3)以及盐水(1L×3)依次洗涤，并且经过MgSO4干燥。浓缩滤液至干燥并且得到呈黄色固体的化合物(T13)(70.3g，55％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.18(d，J＝8.7Hz，2H)，7.41(d，J＝8.7Hz，2H)，4.58(m，1H)，4.29(m，1H)，3.85(m，1H)，2.97(d，J＝6.6Hz，2H)，2.27(m，2H)，1.80(s，3H)，1.76(s，3H)，1.35(s，9H)。化合物T14将K2CO3(35g，0.25mol)和MeI(36g，0.25mol)添加至化合物(T13)(70.3g，0.167mol)在丙酮(400mL)和DMF(400mL)中的溶液中。在室温下搅拌混合物过夜。TLC显示起始材料被消耗。添加水(2L)并且再搅拌混合物1小时。通过过滤收集沉淀的固体，使用水洗涤，干燥，得到呈浅黄色固体的化合物(T14)(34.5g，47％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.17(d，J＝8.7Hz，2H)，7.34(d，J＝8.7Hz，2H)，4.22(m，1H)，3.85(m，1H)，2.85(m，2H)，2.22(m，2H)，1.73(s，3H)，1.73(s，3H)，1.52(s，3H)，1.31(s，9H)。化合物T15将化合物(T14)(34.5g，79.1mmol)溶解于甲苯(500mL)中。在回流下加热溶液40小时。TLC指示反应完成。去除溶剂以得到化合物(T15)(30g)，该化合物无需进一步纯化而用于下一步中。化合物T16将K2CO3(22g，0.16mol)添加至化合物(T15)(30g，79mmol)在MeOH(300mL)中的溶液中。在室温下搅拌混合物3小时。TLC显示完全转化。去除溶剂，将残余物溶解于二氯甲烷(500mL)中，使用盐水(500mL×3)洗涤，经过MgSO4干燥。在通过过滤去除MgSO4之后，浓缩有机相至干燥。通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷＝1∶10)来进一步纯化残余物并且得到呈1∶1非对映异构混合物的化合物(T16)(23.5g，对于两步的产率为81％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.13(d，J＝8.7Hz，2H)，7.34(d，J＝8.7Hz，2H)，4.43(m，1H)，3.85(m，1H)，3.65(s，3H)，2.85(m，2H)，2.65(m，1H)，1.85(m，1H)，1.50(m，1H)，1.30(s，9H)，1.15(t，J＝6.6Hz，3H)。化合物T17使用SFC(超临界流体色谱法)，在ChiralpakID21×250mm，5μ柱上，使用流动相A90％二氧化碳和流动相B异丙醇10％，在60ml/min流速下使50g的化合物(T16)受到手性色谱法。在40℃下进行分离并且在270nM下检测。达到基线分离并且分离两种级分。峰B是希望的化合物(T17)并且呈固体获得27.4g(55％)。在ChiralpakIA柱4.6×250mm，5μ，10％1∶1甲醇∶异丙醇的己烷溶液，具有0.1％二乙胺改性剂上的非对应异构体过量＞99∶1。LC/MS(2分钟，酸_CV10.olp方法367(M+1)，1.16分钟。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm8.16(d，J＝8.53Hz，2H)7.46(d，J＝8.53Hz，2H)3.79-3.93(m，1H)3.68(s，3H)2.90-2.99(m，1H)2.71-2.81(m，1H)2.47-2.59(m，1H)1.81-1.95(m，1H)1.55-1.66(m，1H)1.32(s，9H)1.21-1.25(m，2H)1.16(d，J＝7.03Hz，3H)。化合物T18在130℃下，在微波中加热(2S，4R)-甲基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸酯(T17)(3.5g，9.55mmol)在6NHCl水溶液(8.0mL，263.30mmol)中的溶液，持续30min。冻干反应混合物，得到呈固体的(2S，4R)-4-氨基-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸(T18)。产物无需进一步纯化而用于下一步反应中。(3.2g)。LC-MS：253(M+1)；1HNMR(400MHz，重水)δppm1.12(d，J＝7.28Hz，3H)，1.62-1.76(m，1H)，1.90-2.02(m，1H)，2.56-2.68(m，1H)，3.02-3.11(m，2H)，3.58-3.69(m，1H)，7.47(d，J＝8.53Hz，2H)，8.18(d，J＝8.78Hz，2H)。化合物T19向化合物(T18)(0.43g，1.49mmol)和碳酸氢钠(1.251g，14.89mmol)在丙酮(30mL)和水(15mL)的混合物中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基2，5-二氧代吡咯烷-1-基碳酸酯(0.502g，1.49mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。LCMS指示反应完成。使用盐酸对混合物进行酸化达到pH2并且在真空中蒸发丙酮。用DCM(3×60mL)萃取产物。使用1NHCl溶液(40mL)、盐水(40mL)洗涤合并的有机萃取物，经过Na2SO4干燥，并且在真空中蒸发。通过硅胶快速色谱法(从0％至100％EtOAc的DCM溶液)纯化残余物，得到呈白色固体的(2S，4R)-4-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸(0.630g，，89％)(T19)。LC-MS：475.5(M+H)；1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm0.81-1.06(m，1H)，1.08-1.28(m，2H)，1.33-1.75(m，1H)，1.77-2.11(m，1H)，2.36-2.69(m，2H)，2.76-3.18(m，1H)，3.43-4.08(m，1H)，4.09-4.19(m，1H)，4.21-4.53(m，2H)，4.54-4.80(m，1H)，7.18-7.58(m，8H)，7.66-7.82(m，2H)，7.95-8.17(m，2H)，8.67(br.s.，1H)。化合物T20将DIEA(0.419mL，2.40mmol)添加至(2S，4R)-4-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸(0.380g，0.80mmol)(T19)在DCM(4.5mL)中的溶液中，并且在室温下搅拌混合物5min，然后将2-氯三苯甲基氯树脂(0.5g，0.80mmol)添加至混合物中。在室温下摇晃混合物过夜，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)以及DCM(3×6mL)洗涤所得树脂，然后在室温下用DIEA(0.419mL，2.40mmol)和MeOH/DCM(1∶1，5mL)处理30min。过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)以及DCM(3×6mL)洗涤，在高真空中干燥过夜。从树脂上裂解少量化合物，并且通过LCMS来分析。所得树脂(T20)用于下一步反应。LC-MS：475(M+1)化合物T21向树脂(T20)(0.5g，0.80mmol)中添加DMF(5mL)中的20％哌啶。在室温下摇晃混合物6min，过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗涤，在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T21)用于下一步反应。LC-MS：253(M+H)。化合物T22在室温下，向树脂(T21)(0.5g，1.88mmol)中添加2-((1R，3R)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)氨基)-1-乙酰氧基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(3)(1.108g，2.07mmol)、HATU(1.428g，3.76mmol)、2，4，6-三甲基吡啶(0.500mL，3.76mmol)以及DIEA(0.656mL，3.76mmol))在DMF(5mL)中的溶液。在室温下摇晃混合物两小时，并且过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)以及DCM(3×6mL)洗涤，在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T22)用于下一步骤。LC-MS：771(M+H)。化合物T23向树脂(T22)(0.5g，0.80mmol)中添加DMF(5mL)中的20％哌啶。在室温下摇晃混合物6min，过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗涤，在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T23)用于下一步反应。LC-MS：549(M+1)。化合物T24向(2S，3S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基戊酸(Fmoc-异亮氨酸)(7g，19.81mmol)和吡啶(1.602mL，19.81mmol)在DCM(120mL)中的溶液中通过插管经过10min添加DAST(3.11mL，23.77mmol)在DCM(20mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物1小时，使用DCM(80mL)稀释，使用冰冷水(2×200mL)洗涤，经过MgSO4干燥有机层，过滤并且在真空中蒸发，得到呈白色固体的(9H-芴-9-基)甲基(2S，3S)-1-氟代-3-甲基-1-氧代戊-2-基氨基甲酸酯(6.65g，94％)。进行酯化测试以确保通过将Fmoc-Ile-F(5mg)溶解于无水MeOH(0.3mL)和DIEA(0.030mL)中并且允许在室温下反应15min来进行定量酰氟形成。然后在真空中蒸发混合物并且通过LCMS来分析，示出存在小于1％的Fmoc-Ile-OH。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm0.83-1.12(m，6H)1.18-1.37(m，1H)1.42-1.59(m，1H)2.01(br.s.，1H)4.26(t，J＝6.78Hz，1H)4.44-4.63(m，3H)5.20(d，J＝8.53Hz，1H)7.31-7.39(m，2H)7.40-7.47(m，2H)7.61(d，J＝7.28Hz，2H)7.80(d，J＝7.53Hz，2H)。化合物T25在室温下，向树脂(T23)(0.5g，0.80mmol)中添加(9H-芴-9-基)甲基(2S，3S)-1-氟代-3-甲基-1-氧代戊-2-基氨基甲酸酯(T24)(0.569g，1.60mmol)、DMAP(4.89mg，0.04mmol)以及DIEA(0.419mL，2.40mmol)在DCM(5mL)中的溶液。在室温下摇晃混合物过夜，过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗涤，在高真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，并且通过LC/MS来分析，LCMS指示反应完成。所得树脂(T25)用于下一反应步骤中。LC-MS：884(M+H)。化合物T26向树脂(T25)(0.5g，0.80mmol)中添加DMF(5mL)中的20％哌啶。在室温下摇晃混合物6min，过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗涤，在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T26)用于下一反应步骤中。LC-MS：662(M+1)。化合物T27向树脂(T26)(0.5g，0.80mmol)中添加(2R，4R)-1，4-二甲基哌啶-2-甲酸(1)(0.252g，1.60mmol)、HATU(0.608g，1.60mmol)、2，4，6-三甲基吡啶(0.320mL，2.40mmol)以及DIEA(0.419mL，2.40mmol)在DMF(5mL)中的溶液。在室温下摇晃混合物2小时，过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)以及DCM(3×6mL)洗涤，在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T27)用于下一反应步骤中。LC-MS：801(M+1)。化合物T28向树脂(T27)中添加二氯化锡(II)二水(1.805g，8.00mmol)和乙酸钠(0.197g，2.40mmol)在DMF(5mL)中的溶液。在室温下摇晃混合物4小时，过滤所得树脂，使用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)以及DCM(3×6mL)洗涤，并且在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T28)用于下一步骤。LC-MS：771(M+H)。化合物T29向树脂(T28)(0.2g，0.32mmol)中添加(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸(商业上可获得)(0.300g，0.64mmol)、HATU(0.243g，0.64mmol)、2，4，6-三甲基吡啶(0.128mL，0.96mmol)以及DIEA(0.168mL，0.96mmol)在DMF(4mL)中的溶液。在室温下摇晃混合物2小时，过滤所得树脂，使用DMF(3×2mL)、MeOH(3×2mL)以及DCM(3×2mL)洗涤，并且在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T29)用于下一步反应。LC-MS：1221(M+1)。化合物T30向树脂(T29)(0.2g，0.32mmol)中添加DMF(2mL)中的20％哌啶。在室温下摇晃混合物6min，过滤所得树脂，使用DMF(3×3mL)、MeOH(3×3mL)、DCM(3×3mL)洗涤，在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T30)用于下一步反应。LC/MS：999(M+H)。化合物T31在室温下，向树脂(T30)(0.2g，0.32mmol)中添加2，5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(0.148g，0.48mmol)在DMF(2mL)中的溶液，接着添加N-甲基吗啉(0.106mL，0.96mmol)。在室温下摇晃混合物2小时，过滤所得树脂，使用DMF(3×3mL)、DCM(3×3mL)洗涤，在真空中干燥。从树脂上裂解少量化合物，通过LCMS来分析，该LCMS指示反应完成。所得树脂(T31)用于下一步骤。LC-MS：1192(M+1)。化合物T32(微管溶素1508)在室温下，向树脂(T31)(0.2g，0.32mmol)中添加DCM(1mL)和TFA(1mL)。在室温下摇晃混合物20min，然后过滤。使用DCM/TFA(1∶1，3×2mL)洗涤树脂，在真空中蒸发滤液。通过反相HPLC(ACN/H2O(含有0.1％TFA)，在14min中ACN从5％至75％)。冻干纯级分，得到呈白色固体的(2S，4R)-4-(2-((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-((2S，3S)-2-((2R，4R)-1，4-二甲基哌啶-2-甲酰氨基)-N-乙基-3-甲基戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰氨基)-5-(4-((S)-6-氨基-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)己酰氨基)苯基)-2-甲基戊酸(T32)(0.095g，22.48％)。LC-MS：1092[M+1]；1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm7.99(s，1H)，7.34(d，J＝8.53Hz，2H)，7.10(d，J＝8.53Hz，2H)，6.66(s，2H)，5.64(d，J＝10.79Hz，1H)，4.50-4.61(m，1H)，4.21-4.35(m，2H)，3.92(d，J＝9.29Hz，1H)，3.69(br.s.，1H)，3.37(t，J＝7.15Hz，2H)，3.15-3.35(m，4H)，3.04(dt，J＝3.58，1.85Hz，1H)，2.84(t，J＝7.65Hz，2H)，2.76(d，J＝7.03Hz，2H)，2.62(br.s.，2H)，2.38-2.52(m，2H)，2.25(t，J＝11.54Hz，1H)，2.16(t，J＝7.40Hz，2H)，2.04-2.11(m，4H)，1.70-2.00(m，7H)1.42-1.69(m，11H)，1.34-1.40(m，1H)，1.27(t，J＝6.78Hz，3H)，1.16-1.24(m，2H)，1.01-1.14(m，7H)，0.90(d，J＝6.78Hz，3H)，0.94(d，J＝6.53Hz，3H)，0.84(t，J＝7.40Hz，3H)，0.79(d，J＝6.53Hz，3H)。5.2.微管溶素1508的轭合化合物T32(微管溶素1508)包含接头和容易轭合至抗体的巯基残基上从而形成巯基-马来酰亚胺连接的马来酰亚胺基团。包含马来酰亚胺基团的细胞毒素(例如，微管溶素1508)可被轭合至特定半胱氨酸残基上，被工程化成本发明的在此提供的抗HER2抗体(例如Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH或Bs4Ab-39SH)。可替代地或任选地，人们可以使用经典轭合方法来将细胞毒性剂附接至所描述的抗体上。用于轭合至天然赖氨酸和半胱氨酸残基上的方法是本领域中熟知的。以下提供了用于位点特异性(在工程化的半胱氨酸残基处)和经典的轭合(在天然半胱氨酸残基处)的代表性方法。代表性位点特异性抗体药物轭合方法在图33中所述，并且包括以下步骤：(a)打开可衍生氨基酸(例如，半胱氨酸)的侧链，(b)氧化，(c)轭合有效负载(例如，细胞毒性剂诸如微管溶素1508)并且(d)通过去除轭合试剂和未反应的有效负载来抛光。例如，轭合至工程化的半胱氨酸上可以通过在具有1mM乙二胺四乙酸的1XPBS中配制抗体来进行。通过添加每个抗体40当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐，在37℃下孵育3小时，使用温和还原来产生游离巯基。使用在具有1mM乙二胺四乙酸的1XPBS中的三次连续透析来去除三(2-羧乙基)膦盐酸盐(可替代地可以使用脱盐柱)。通过添加大约20当量的脱氢枞酸(dhAA)并且在室温下孵育大约4小时来允许抗体链间二硫键重新形成。在准备轭合中，将二甲亚砜添加至抗体中达到10％v/v，并且分别对于2T和4T药物负载，添加8或12当量的二甲亚砜中的微管溶素1508有效负载并且在室温下孵育大约1小时(可替代地在4℃下孵育大约16小时)。通过添加每个有效负载大约4摩尔当量的N-乙酰基半胱氨酸(NAC)来猝灭反应。根据制造商建议通过陶瓷羟基磷灰石来从轭合的抗体中去除游离的有效负载。如果需要，可以使最终产物受到缓冲液交换。可以通过非还原性和还原性SDS-PAGE来分析轭合的抗体，以便确认纯度和与重链的轭合。具有随机轭合至天然半胱氨酸残基上的药物的抗体-药物轭合物通过部分还原抗体接着与希望的接头-药物反应来制备。通过在pH8.0下添加大约3摩尔当量的DTT，接着在大约37℃下孵育大约2h来部分还原5mg/mL浓度的抗体。然后在冰中冷却还原反应并且例如通过渗滤来去除过量DTT。然后添加接头-药物至大约1∶10摩尔比的接头-药物/巯基。在大约10％v/v的DMSO存在下进行轭合反应。在轭合之后，添加过量游离的半胱氨酸(接头-药物的大约2倍摩尔比)来猝灭未反应的接头-药物，以便产生半胱氨酸-接头-药物加合物。纯化反应混合物(例如，通过疏水相互作用色谱法)并且使其受到缓冲交换进入PBS中。使用标准方法诸如疏水相互作用色谱法和还原性反相色谱法来确定药物负载分布。5.3.化学缩写Ac乙酰基ACN乙腈Boc二碳酸二叔丁酯t-Bu叔丁基Bzl苄基，其中Bzl-OMe是甲氧基苄基并且Bzl-Me是甲苯Cbz或Z苄基氧基-羰基，其中Z-Cl和Z-Br分别是氯代-苄基氧基羰基和溴代苄基氧基羰基DAST三氟化二乙基氨基硫DCM二氯甲烷DIAD偶氮二甲酸二异丙酯DICN，N′-二异丙基碳二亚胺DIEA二乙基异丙胺DMFN，N-二甲基甲酰胺DTT二硫苏糖醇EtOAc乙酸乙酯Et2O二乙醚Fmoc9H-芴-9-基甲氧基羰基HATU1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶3-氧化六氟磷酸盐HCl盐酸LC-MS液相色谱法-质谱MeOH甲醇Na2CO3碳酸钠NaHCO3碳酸氢钠PAB对氨基苯甲基氧羰基RT室温TEA三乙胺TFA三氟乙酸THF四氢呋喃TLC薄层色谱法通过引用结合出于所有目的，在此引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的参考文献(如同它们还未曾引用过的程度)通过引用以其全文结合在此。等效物前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践这些实施例。前述说明和实例详述了某些实施例，并且描述了诸位发明人所期望的最佳模式。然而，将了解到，无论前述内容以文本形式表现的如何详细，这些实施例仍可以许多方式实践，并且权利要求书包括其任何等效物。当前第1页1 2 3