一种纳米金抗菌剂的工业化生产方法与流程

本发明涉及一种纳米金抗菌剂的制备方法，具体涉及一种纳米金抗菌剂的工业化生产方法，以及通过该方法制备的纳米金抗菌剂。
背景技术：
：纳米银(AgNPs)由于优异的抗菌性能被广泛应用，但是由于纳米银的不稳定性以及对人体细胞的毒性较大，在医用等某些方面限制了其使用。近年来，稳定性更好、对人体细胞毒性更小的纳米金作为抗菌剂的研究逐渐被报道。纳米金(AuNPs)作为新型的抗菌剂，大部分的研究制备纳米金抗菌剂的规模处于实验室的小规模阶段，制备过程较复杂，难以工业化，有的研究报道的纳米金抗菌剂的抗菌效果不是太好。专利CN102188383A报道的巯基嘧啶修饰的纳米金抗菌剂对革兰氏阳性菌，比如金黄色葡萄球菌的抗菌效果较差。Hong-ZhengLai(LaiHZ,ChenWY,WuCY,etal.Potentantibacterialnanoparticlesforpathogenicbacteria[J].ACSappliedmaterials&interfaces,2015,7(3):2046-2054.)报道万古霉素修饰的纳米金抗菌剂相比于单纯的万古霉素，抗菌性有了较大的提高，但是纳米金上存在的抗生素万古霉素，由于细菌耐药性的问题，其使用依然对人类和自然存在隐患。Zhaoyuyun等(ZhaoY,JiangX.Multiplestrategiestoactivategoldnanoparticlesasantibiotics[J].Nanoscale,2013,5(18):8340-8350.和ZhaoY,YeC,LiuW,etal.TuningthecompositionofAuPtbimetallicnanoparticlesforantibacterialapplication[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2014,53(31):8127-8131.)报道的氨基嘧啶/含氨基小分子的双组份药物修饰的纳米金抗菌剂和纳米金铂双金属抗菌剂有很强的广谱抗菌性，其对人体细胞的毒性远远低于纳米银，并且不会产生细菌耐药性，是一类非常有前途的抗菌剂，但是其在制备过程中还原剂NaBH4是以滴加的方式加入到反应溶液中，大规模生产时这将非常耗时，不容易实现，其次，纳米金反应完后，需要用透析袋透析，工业生产时依然很难实现。因此，将已研发的具有优异的广谱抗菌性、无细菌耐药性，对人体细胞毒性小的纳米金在实现工业化生产的进程中依然存在问题需要解决。技术实现要素：因此，本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供一种工艺简单、效率更高、成本低廉的纳米金抗菌剂的工业化生产方法，以及通过该方法制备的纳米金抗菌剂。为实现上述目的，本发明提供了一种纳米金抗菌剂的工业化生产方法，该方法包括以下步骤：(1)将氯金酸溶液与含氨基嘧啶类小分子和氨基类小分子的溶液或氯铂酸钾溶液混合，得到混合溶液。(2)在搅拌下向所述混合溶液中快速加入还原剂的溶液，充分反应后即得到所述纳米金抗菌剂。其中，所述纳米金抗菌剂的体积可以为5L以上，可以优选为5～100L，例如可以为50～100L。并且还原剂的加入时间可以不超过5分钟，可以优选不超过1分钟，可以更优选10s～60s。还原剂的加入时间可依不同的反应体积而变化，但可以选自本发明记载的时间范围，例如可以为10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s等。本领域技术人员容易理解，用于制备氯金酸溶液的氯金酸原料可以是四水合氯金酸。根据本发明的方法，其中，所述纳米金抗菌剂中的含金纳米颗粒的平均粒径为1～20nm，优选为1～10nm，例如2～10nm。更优选地，所述含金纳米颗粒在纳米金抗菌剂中的浓度为10～2000ppm，优选为400～2000ppm，进一步优选为800～2000ppm，例如400～1000ppm，或800～1000ppm。其中，1ppm通常可换算为1mg/L。根据本发明的方法，其中，相对于所述纳米金抗菌剂的总体积，所述氯金酸的浓度可以约为10～2000ppm，优选为400～2000ppm，进一步优选为800～2000ppm。根据本发明的方法，其中，所述还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸钠或柠檬酸钠。优选地，所述还原剂与氯金酸的摩尔比或者所述还原剂与氯金酸和氯铂酸钾(的总摩尔数)的摩尔比为1:1～10:1，优选为2:1～3:1。进一步优选地，步骤(2)中的反应时间为0.5～3小时，反应温度为室温以下，例如可以在25℃以下，如20～25℃。根据本发明的方法，其中，当氯金酸溶液与含氨基嘧啶类小分子和氨基类小分子的溶液混合时，在所得纳米金抗菌剂的含金纳米颗粒中，氨基嘧啶类小分子与金元素的摩尔含量比为0.5:1～2:1，例如1:1，氨基类小分子与金元素的摩尔含量比为0.5:1～2:1，例如1:1。所述金元素的摩尔量可以对应于氯金酸的摩尔量。优选地，所述氨基嘧啶类小分子选自2-巯基-4,6-二氨基嘧啶、2-巯基-4-氨基嘧啶和2,4-二氨基-6-巯基嘧啶中的一种或多种。更优选地，所述氨基类小分子选自胍、二甲双胍、盐酸二甲双胍、1-(3-氯酚)双胍、氯喹、盐酸乙酰胆碱和三聚氰胺中的一种或多种。更进一步优选地，当氯金酸溶液与氯铂酸钾溶液混合时，在所得纳米金抗菌剂的含金纳米颗粒中，铂的原子百分比为10～65％。根据本发明的方法，其中，所述含氨基嘧啶类小分子和氨基类小分子的溶液中还包含有机酸或无机酸，优选为乙酸、丙酸或盐酸。更优选地，所述有机酸或无机酸在所述纳米金抗菌剂中的质量百分比为0.05％～10％。例如可以为0.1～0.2％。根据本发明的方法，其中，所述含氨基嘧啶类小分子和氨基类小分子的溶液中还包含非离子表面活性剂，优选为吐温或聚乙二醇。更优选地，非离子表面活性剂在所述纳米金抗菌剂中的质量百分比为0.01％～10％。例如可以为0.01～0.1％。根据本发明的方法，其中，所述氯金酸溶液、含氨基嘧啶类小分子和氨基类小分子的溶液、氯铂酸钾溶液或还原剂的溶液的溶剂各自独立地为水，例如可以为去离子水。根据本发明的方法，其中，所述方法不包含纯化所述纳米金抗菌剂的步骤。优选地，纯化所述纳米金抗菌剂的步骤包括用透析袋透析处理或离心过滤处理。换言之，本发明生产方法不需要用透析袋透析处理或离心过滤处理等方式来纯化含金纳米颗粒。作为更进一步的限定，本发明的生产方法也可以表述为由步骤(1)和步骤(2)组成。本发明还提供了一种纳米金抗菌剂，该纳米金抗菌剂由本发明的上述方法制得。本发明还提供了本发明的上述纳米金抗菌剂的工业化生产方法或上述纳米金抗菌剂在制备抗菌产品或药物中的应用。优选地，所述抗菌产品或药物可以为抑菌和/或杀菌的产品或药物。更优选地，所述抗菌药物可以为用于治疗烧伤、烫伤、褥疮感染、皮肤炎症、妇科疾病或肛肠疾病的药物。与现有技术相比，本发明提供的纳米金抗菌剂的工业化生产方法具有但不限于以下有益效果：1、本发明适用于反应溶液体积在5L以上，优选10L以上，甚至100L以上的生产规模，该生产方法工艺简单、成本较低，所生产的纳米金抗菌剂具有优异抗菌效果且对人体细胞低毒。2.采用本发明方法所生产的纳米金抗菌剂中的含金纳米颗粒比小规模生产的粒径更小，尺寸更均一，并且在抗菌效果方面无明显差异，且抗菌效果与纳米银相近。3、文献报道为得到颗粒小且尺寸均一的纳米颗粒，采用了滴加还原剂(如硼氢化钠或柠檬酸钠)溶液的方式。例如，相对于25mL的混合溶液，5mL的还原剂溶液需要在2分钟滴完。如果在大规模生产也采用该方式，例如体积为100L规模时，那么滴加还原剂溶液的时间则需要数天，这会极大降低生产效率，不适合工业化生产。相比之下，在本发明的生产方法中，还原剂的溶液是一次性快速加入(即100L时加入时间最多不超过5分钟)到反应液(本发明的混合溶液)中，因此更节约时间，有助于提升生产效率。4.采用一次性快速加入还原剂溶液和滴加还原剂溶液相比，所制得的纳米金抗菌剂中的含金纳米颗粒在粒径、尺寸均一度方面均无明显差异，并且在抗菌效果方面也无明显差异。5、文献报道中的含金纳米颗粒在反应后需要用透析袋透析24至48小时，并且工业化生产中的透析工艺非常复杂，透析设备非常昂贵。本发明生产方法不需要用透析袋透析处理或离心过滤处理等方式来纯化含金纳米颗粒，因此工艺更为简单，降低了生产成本，进一步提升了生产效率。6.本发明不采用透析等纯化步骤所制备的纳米金抗菌剂与透析处理的纳米金抗菌剂相比，抗菌效果十分优异，而且对人体细胞的毒性同样很低，且远远低于市售纳米银抗菌剂和硝酸银。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1示出了本发明的实施例1～2与对比例1～2的纳米金抗菌剂中的含金纳米颗粒的TEM图；图2示出了本发明的实施例3与对比例3～5的纳米金抗菌剂中的含金纳米颗粒的TEM图(以纳米银AgNPs作为对照)；图3示出了本发明的实施例4、对比例6的纳米金抗菌剂的细胞毒性图(以纳米银和硝酸银作为对照)。具体实施方式下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。以下实施例中使用的试剂和仪器如下：试剂：仪器：电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)，型号iCAP6300，美国ThermoScientific公司。透射电子显微镜(TEM)，型号TecnaiG220S-TWIN，美国FEI公司。实施例1本实施例用于说明本发明的纳米金抗菌剂的工业化生产方法及通过该方法制得的纳米金抗菌剂。本实施例采用的制备方法为：(1)将80g的四水合氯金酸溶于20L的去离子水中，得到氯金酸溶液。将一定量的2-巯基-4,6-二氨基嘧啶和盐酸二甲双胍溶于20L的去离子水中，还加入一定量的吐温80和乙酸，以有助于促进氨基嘧啶类小分子与氨基类小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶类小分子和氨基类小分子的溶液。将两溶液混合，得到混合溶液。(2)将一定量的硼氢化钠溶于10L的去离子水中，在搅拌下将上述硼氢化钠溶液快速加入(用时1分钟)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌1小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约50L的浓度为约800ppm的(按照投料比算出的)纳米金抗菌剂。根据投料比，2-巯基-4,6-二氨基嘧啶与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1，盐酸二甲双胍与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1，还原剂硼氢化钠与氯金酸的摩尔含量比为3:1，乙酸占纳米金抗菌剂的质量百分比为0.1％，表面活性剂吐温80占纳米金抗菌剂的质量百分比为0.01％。由ICP-OES测得，该纳米金抗菌剂含有浓度约为800ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4,6-二氨基嘧啶和盐酸二甲双胍双组份修饰的纳米金颗粒)。由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为2～6nm，具体见图1。实施例2本实施例用于说明本发明的纳米金抗菌剂的工业化生产方法及通过该方法制得的纳米金抗菌剂。实施例2的纳米金抗菌剂的制备方法基本与实施例1相同，区别在于，各试剂(包括原料和溶剂等)的用量均按比例缩小，以使所得纳米金抗菌剂的体积为5L。其中，由ICP-OES测得实施例2的纳米金抗菌剂(5L)含有浓度约为800ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4,6-二氨基嘧啶和盐酸二甲双胍双组份修饰的纳米金颗粒)，由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为3～7nm，具体见图1。根据投料比，2-巯基-4,6-二氨基嘧啶与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1，盐酸二甲双胍与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1，还原剂硼氢化钠与金元素的摩尔含量比为3:1。对比例1～2按照与实施例1相同的制备方法分别制得对比例1、2的纳米金抗菌剂，其区别在于，各试剂(包括原料和溶剂等)的用量均按比例缩小，以使所得纳米金抗菌剂的体积分别为250mL、25mL。由ICP-OES测得对比例1的纳米金抗菌剂(250mL)含有浓度约为800ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4,6-二氨基嘧啶和盐酸二甲双胍双组份修饰的纳米金颗粒)，由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为5～10nm，具体见图1。根据投料比，2-巯基-4,6-二氨基嘧啶与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1，盐酸二甲双胍与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1。由ICP-OES测得对比例2的纳米金抗菌剂(25mL)含有浓度约为800ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4,6-二氨基嘧啶和盐酸二甲双胍双组份修饰的纳米金颗粒)，由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为5～10nm，具体见图1。根据投料比测定，2-巯基-4,6-二氨基嘧啶与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1，盐酸二甲双胍与金元素(或氯金酸)的摩尔含量比为1:1。试验例1按照微孔稀释方法(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.，Methodsfordeterminingbactericidalactivityofantimicrobialagents,M26-A,1999.)测定最小抑菌浓度(MIC)：将100μL不同浓度的纳米金抗菌剂或纳米银加入到96微孔板中，10μL相同浓度(104CFU/mL)的细菌培养液加入每个微孔中，37℃培养24小时后观察，没有可看见的细菌生长的微孔中最低的纳米金抗菌剂或纳米银的浓度即为最小抑菌浓度(MIC)，MIC越小证明该样品抗菌性能越好。以上述方法测定实施例1～2和对比例1～2的纳米金抗菌剂(以纳米金颗粒AuNPs的浓度计)的MIC，并且以市售纳米银(AgNPs)(购自张家港耐尔纳米公司)的MIC作比较。细菌培养液分别为E.coli(大肠杆菌)、S.aureus(金黄色葡萄球菌)和P.aeruginosa(绿脓杆菌)，测定三组，结果见表1。表1实施例1～2及对比例1～2的纳米金抗菌剂的抗菌性能比较(以市售纳米银作对照)从表1可知，采用体积大于5L的规模(如5L、50L)生产的纳米金抗菌剂与小规模(25mL、250mL)生产的纳米金抗菌剂在抗菌性能方面无明显改变，其中还出现了某些效果提升。例如，实施例1(50L)对金黄色葡萄球菌的抗菌能力强于对比例1和2，实施例2(5L)对绿脓杆菌的抗菌能力强于对比例1(250mL)。实施例3本实施例用于说明本发明的纳米金抗菌剂的工业化生产方法及通过该方法制得的纳米金抗菌剂。本实施例采用的制备方法为：(1)将20g的四水合氯金酸溶于2L的去离子水中，得到氯金酸溶液。将一定量的2-巯基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)双胍溶于2L的水中，还加入一定量的聚乙二醇和乙酸，以有助于促进氨基嘧啶类小分子与氨基类小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶类小分子和氨基类小分子的溶液。将两溶液混合，得到混合溶液。(2)将一定量的柠檬酸钠溶于1L的去离子水中，在搅拌下将上述柠檬酸钠溶液快速加入(用时10秒)到上述混合溶液中，在室温(如25℃)以下搅拌0.5小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约5L的纳米金抗菌剂。由ICP-OES测得，该纳米金抗菌剂含有浓度约为2000ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)双胍双组份修饰的纳米金颗粒)。由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为3～7nm，具体见图2。根据投料比，2-巯基-4-氨基嘧啶与金元素的摩尔含量比为1:1，1-(3-氯酚)双胍与金元素的摩尔含量比为1:1，还原剂柠檬酸钠与氯金酸的摩尔含量比为3:1，乙酸占纳米金抗菌剂的质量百分比为0.2％，表面活性剂聚乙二醇占纳米金抗菌剂的质量百分比为0.1％。对比例3～5对比例3～5的纳米金抗菌剂的制备方法基本与实施例3相同，区别在于，柠檬酸钠溶液的加入(可采用滴加方式)时间分别为2分钟、20分钟和200分钟。其中，由ICP-OES测得对比例3的纳米金抗菌剂(2分钟)含有浓度约为2000ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)双胍双组份修饰的纳米金颗粒)，由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为5～8nm，具体见图2。根据投料比，2-巯基-4-氨基嘧啶与金元素的摩尔含量比为1:1，1-(3-氯酚)双胍与金元素的摩尔含量比为1:1。由ICP-OES测得对比例4的纳米金抗菌剂(20分钟)含有浓度约为2000ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)双胍双组份修饰的纳米金颗粒)，由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为6～9nm，具体见图2。根据投料比，2-巯基-4-氨基嘧啶与金元素的摩尔含量比为1:1，1-(3-氯酚)双胍与金元素的摩尔含量比为1:1。由ICP-OES测得对比例5的纳米金抗菌剂(200分钟)含有浓度约为2000ppm的含金纳米颗粒(即2-巯基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)双胍双组份修饰的纳米金颗粒)，由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为7～10nm，具体见图2。根据投料比，2-巯基-4-氨基嘧啶与金元素的摩尔含量比为1:1，1-(3-氯酚)双胍与金元素的摩尔含量比为1:1。试验例2按照试验例1中描述的相同方法测定实施例3和对比例3～5的纳米金抗菌剂(以纳米金颗粒AuNPs的浓度计)的MIC，并且以市售纳米银(AgNPs)(购自张家港耐尔纳米科技有限公司)的MIC作比较。细菌培养液分别为E.coli(大肠杆菌)、S.aureus(金黄色葡萄球菌)和P.aeruginosa(绿脓杆菌)，测定三组，结果见表2。表2实施例3和对比例3～5的纳米金抗菌剂的抗菌性能比较(以市售纳米银作对照)样品E.coliS.aureusP.aeruginosa实施例3(10s)1.4392.8782.878对比例3(2min)1.4165.6662.838对比例4(20min)2.8425.6845.684对比例5(200min)2.7805.5595.559AgNPs1.8343.6673.667从表2可知，一次性快速加入还原剂(如实施例1采用10s)而生产的纳米金抗菌剂与更长加入时间(如2min、20min、200min或更长)生产的纳米金抗菌剂相比，虽然用时大幅缩短，但抗菌性能无显著差异，其中在某些方面还呈现效果提升。例如，实施例3(10s)对大肠杆菌、绿脓杆菌的抗菌能力强于对比例4(20min)和对比例5(200min)，对金黄色葡萄球菌的抗菌能力则最佳。实施例4本实施例用于说明本发明的纳米金抗菌剂的工业化生产方法及通过该方法制得的纳米金抗菌剂。本实施例采用的制备方法为：(1)将25g的四水合氯金酸和55g氯铂酸钾溶于60L的去离子水中，得到混合溶液。(2)将一定量的硼氢化钠溶于40L的去离子水中，在搅拌下将上述硼氢化钠溶液快速加入(用时60秒)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌3小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约100L的纳米金抗菌剂。根据投料比，还原剂硼氢化钠与氯金酸和氯铂酸钾的摩尔含量比为2:1，铂的原子百分比为65％，因此该金-铂纳米颗粒可表示为Au35Pt65纳米颗粒。由ICP-OES测得，该纳米金抗菌剂含有浓度为400ppm的含金-铂纳米颗粒(即金-铂双金属组分纳米颗粒)。由TEM测得纳米金颗粒的粒径约为7～10nm。对比例6及试验例3试验例3用于比较采用和不采用透析纯化处理所制得的纳米金抗菌剂的抗菌效果。按照实施例4的方法制备对比例6，其区别仅在于，将反应后的溶液用截止分子量为3KDa的透析袋在纯水中透析48小时，每6小时换一次水，得到含金-铂纳米颗粒的纳米金抗菌剂溶液，作为对比例6。按照试验例1中描述的相同方法测定实施例4和对比例6的纳米金抗菌剂(以含金纳米颗粒的浓度计)的MIC。细菌培养液分别为E.coli(大肠杆菌)、S.aureus(金黄色葡萄球菌)和P.aeruginosa(绿脓杆菌)，测定三组，结果见表3。表3实施例4和对比例6的纳米金抗菌剂的抗菌性能比较试验例4本试验例用于比较采用和不采用透析纯化处理所制得的纳米金抗菌剂的细胞毒性(同时以市售纳米银和硝酸银溶液作对照)。细胞毒性试验操作过程：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养。在96微孔板的每个孔中加入104个HUVEC细胞，每个孔中加入不同浓度的实施例4的纳米金抗菌剂、对比例6的纳米金抗菌剂、商品化纳米银、硝酸银溶液到200微升。微孔介质中在37℃下培养48小时，没有加入抗菌剂的HUVEC细胞作为对照。培养完后，微孔中的溶液用磷酸缓冲溶液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介质中，在37℃下培养2小时。在酶联免疫检测仪450nm处测量各样品孔以及对照孔的吸光值。计算各个样品孔细胞相对活力。各样品孔细胞相对活力定义为：各个孔吸光值/对照孔的吸光值×100％。试验结果见图3。从图3所示的试验结果可知，本发明的不采用透析处理的纳米金抗菌剂在不同浓度下的细胞毒性均明显低于纳米银和硝酸银溶液。尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。当前第1页1 2 3