本发明涉及医药技术领域，特别涉及三萜皂苷类化合物的应用。
背景技术：
支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的呼吸道疾病。临床上主要表现为反复发作性的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状，少数患者还可出现胸痛等，严重者可发生呼吸困难、猝死。哮喘是全球范围内最常见的慢性疾病之一，且近年来患病率有逐年增加的趋势。哮喘的发病机制复杂，目前尚无完全根治的方法，而现有的药物治疗效果有限，因此开发新的治疗哮喘的药物意义重大。
以往认为哮喘是因平滑肌痉挛而引起气道阻塞性疾病，而目前观点认为哮喘是一种气道的慢性炎症性疾病，是由炎性细胞参与形成的非特异性炎症。这些参与形成非特异性炎症的炎性细胞有：嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞等。哮喘发作时它们能释放许多炎性介质如白三烯、前列腺素、组胺、血小板活化因子(PAF)、缓激肽、白细胞介素-5等。炎症的形成致使气道呈高反应性，刺激阈降低，从而导致支气管收缩变窄，出现哮喘症状。
哮喘的一个重要特征就是气道的高反应性(AHR)。已发现有多种炎性细胞和炎性介质参与AHR的形成。这其中嗜酸性粒细胞(Eos)在哮喘的发病过程中起着非常重要的作用，Eos除了能合成释放炎性介质白三烯、前列腺素、组胺等外，还能合成和释放能直接损伤气道上皮的毒性蛋白，这些毒性蛋白包括碱性蛋白(MBP)、嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸细胞神经毒性蛋白(ENP)和嗜酸细胞过氧化物(EPO)，它们能导致上皮剥脱和气道高反应性。而PAF使一种非常强的Eos趋化剂和激活因子，它能趋化Eos的游动和释放碱性蛋白，通过激活特殊表面的受体而起作用，PAF与Eos的相互作用在气道高反应性的发病机理中可能起决定作用。PAF拮抗剂是一类能拮抗PAF生物活性的药物。其主要药理作用有抗炎、抗过敏、保护移植器官工嗯呢该、抑制消化性溃疡等。
近年来，中药抗哮喘的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。
旱莲苷A(Ecliptasaponin A)、旱莲苷B(Ecliptasaponin B)、旱莲苷C(Ecliptasaponin C)和旱莲苷D(Ecliptasaponin D)是从墨旱莲(Herba Ecliptae)中提取的三萜皂苷类成分，药理研究表明墨旱莲及其提取物具有止血、保肝、免疫调节和抗炎、抗诱变、抗蛇毒、抗缺氧以及对心血管系统作用等多种药理活性。本发明涉及的抗哮喘方面的药效和用途，尚未见相关报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供三萜皂苷类化合物的应用。本发明的目的在于提供具有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备治疗哮喘的药物中的应用，本发明研究表明式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物对血小板活化因子受体(PTAFR)有明显的抑制作用；同时可以抑制哮喘豚鼠BALF中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌和显著降低豚鼠血清血小板活化因子
(PAF)水平。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了具有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备血小板活化因子受体(PTAFR)的抑制剂中的应用；
其中，R1＝OH(S构型)、OH(R构型)；R2＝H、Glc；R3＝H、Glc。
本发明提供了具有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备降低血液中嗜酸细胞过氧化物(Eos)含量的制剂中的应用；
其中，R1＝OH(S构型)、OH(R构型)；R2＝H、Glc；R3＝H、Glc。
本发明提供了具有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌和/或降低血清中血小板活化因子(PAF)水平的制剂中的应用；
其中，R1＝OH(S构型)、OH(R构型)；R2＝H、Glc；R3＝H、Glc。
本发明提供了具有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备治疗和/或预防哮喘药物中的应用；
其中，R1＝OH(S构型)、OH(R构型)；R2＝H、Glc；R3＝H、Glc。
在本发明的一些具体实施方案中，R1＝OH(R构型)；和R2＝H；和R3＝H或
R1＝OH(R构型)；和R2＝Glc；和R3＝Glc；或
R1＝OH(R构型)；和R2＝H；和R3＝Glc；或
R1＝OH(S构型)；和R2＝H；和R3＝H。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的活性剂量为25～100mg/kg小鼠体重/d，所述式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的活性剂量为2.7～11mg/kg人体体重/d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物和药学上可接受的载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述口服给药剂型的抗哮喘病药物中，式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的质量分数为15～90％。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。
本发明提供了具有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备治疗哮喘的药物中的应用，通过实验证明了式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物对血小板活化因子受体(PTAFR)有明显的抑制作用，缓解哮喘引起的呼吸急促、频率加快并能显著降低大鼠血液中Eos的量，减轻Eos对气道浸润；同时可以抑制哮喘豚鼠BALF中GM-CSF分泌和显著降低豚鼠血清PAF水平，阻止炎性细胞的激活和炎性递质的释放,从而减轻气道炎症，松弛支气管平滑肌，降低气道高反应性而治疗哮喘，从而具有治疗哮喘的作用与应用价值。
具体实施方式
本发明公开了三萜皂苷类化合物的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述具式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物具有如下结构：
根据本发明一个优选的实施方式，R1＝OH(R构型)，R2＝H，R3＝H，式Ⅰ化合物为旱莲苷A。
根据本发明另一个优选的实施方式，R1＝OH(R构型)，R2＝Glc，R3＝Glc，式Ⅰ化合物为旱莲苷B
根据本发明另一个优选的实施方式，R1＝OH(R构型)，R2＝H，R3＝Glc，式Ⅰ化合物为旱莲苷C
根据本发明又一个优选的实施方式，R1＝OH(S构型)，R2＝H，R3＝H，式Ⅰ化合物为旱莲苷D。
药理研究表明，式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物具有止血、保肝、免疫调节和抗炎、抗诱变、抗蛇毒、抗缺氧以及对心血管系统作用等多种药理活性。本发明提供具有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备治疗哮喘的药物中的应用。
本发明所述式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物优选为单体和/或提取物，所述式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物提取物中，式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物含量优选在90％以上，本发明可按照常规方法从含有式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的中药材或者中药饮片中提取得到，如墨旱莲；也可购买式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的市售商品。具体的，在本发明的实施例中，可采用中国药品生物制品检定所提供的式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物。
优选的，所述式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的活性剂量为25～100mg/kg小鼠体重/d，优选为2.7～11mg/kg小鼠体重/d。
优选的，所述式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的活性剂量为2.0～10.0mg/kg人体体重/d，优选为3.0～8.5mg/kg人体体重/d。
优选的，所述抗哮喘药物包括式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物和药学上可接受的载体。
在本发明中，所述抗哮喘药物包括式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物和
药学
上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体优选包括淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油中的一种或几种；所述抗哮喘药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。优选的，所述抗哮喘药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。
优选的，所述抗哮喘药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
优选的，所述口服给药剂型的抗哮喘病药物中，式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的质量分数为15～90％，更优选为20～80％，最优选为25～75％。
优选的，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。
本发明提供式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物在制备治疗哮喘药物中的应用，本发明实验结果表明，式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物对血小板活化因子受体(PTAFR)有明显的抑制作用，缓解哮喘引起的呼吸急促、频率加快并能显著降低大鼠血液中Eos的量，减轻Eos对气道浸润；同时可以抑制哮喘豚鼠BALF中GM-CSF分泌和显著降低豚鼠血清PAF水平，阻止炎性细胞的激活和炎性递质的释放，从而减轻气道炎症，松弛支气管平滑肌，降低气道高反应性而治疗哮喘。本发明对所述式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物的抗哮喘药物的制备方法没有特殊的限制，按照本领域技术人员常用的制药方法即可。
本发明的有益效果是：
1、式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物对血小板活化因子受体有一定的抑制活性，且存在剂量依赖关系。
2、式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物可以缓解哮喘引起的呼吸急促、频率加快并能显著降低大鼠血液中Eos的量，减轻Eos对气道浸润，降低气道反应性。
3、式Ⅰ所示结构的三萜皂苷类化合物可以抑制GM-CSF分泌和显著降低豚鼠血清PAF水平，阻止炎性细胞的激活和炎性递质的释放,从而减轻气道炎症。
本发明提供的三萜皂苷类化合物的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1旱莲苷A、B、C和D对血小板活化因子受体(PTAFR)的抑制活性
1、实验材料：
1.1细胞株：稳定转染PTAFR的细胞株CHO-K1，由江苏康缘药业股份有限公司构建。
1.2主要试剂：F12培养基、胎牛血清均购自Hyclone公司；Zeocin、HBSS购自invitrogen公司；钙流检测试剂盒购自Molecular Device公司；PAF(C16)、WEB2086购自tocris；HEPES购自南京生兴生物技术有限公司；DMSO购自sigma公司；
1.3仪器：FLIPR tetra型酶标仪，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；超净工作台，购自上海洁佳空气净化技术有限公司；CDX-K1倒置显微镜，购自奥林巴斯；countess细胞自动计数仪，购自invitrogen公司；3111型细胞培养箱，购自Thermo Scientific公司。
2、实验方法：
2.1细胞培养
细胞传代接种于10cm培养皿中，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，当培养皿中的细胞基本长满后(细胞在对数生长期)，弃去培养液，加入5ml PBS溶液轻轻荡洗，弃去，然后加入0.25％胰蛋白酶溶液0.5ml消化1分钟(室温)，加入5ml完全培养基终止胰酶的消化作用，将细胞转入玻璃离心管中，800rpm，离心4min，弃去上清，加入完全培养基，小心吹打成单细胞。细胞自动计数仪计数，然后用完全培养基稀释到细胞浓度约为3×105个/mL,按照每孔100μL接种于96孔黑壁底透的细胞培养中，第1列加100μL培养基，继续于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
2.2配药
配制1M的HEPES缓冲液，配制HBSS+20mM Hepes溶液。用含hepes的HBSS缓冲液稀释化合物旱莲苷A、B、C和D(分别配制成浓度为(6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)和激动剂PAF(C16)。
2.3检测
1.取对数生长期的细胞，消化为单细胞悬液，计数。
2.将细胞稀释至3×105个细胞/mL，在96孔板每孔接种100μL。37℃5％CO2培养过夜。
3.用排枪从细胞培养板中吸弃50μL细胞培养液，加入50μL预热的钙染料。将培养板放入培养箱中培养30min。
4.用HBSS缓冲液稀释化合物，将稀释后的化合物旱莲苷A、B、C和D(分别配制成浓度为(6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)和阳性药(WEB2086)加入细胞培养板中，每孔加入25μL化合物。将培养板放入培养箱中继续培养30min。
5.用HBSS缓冲液稀释激动剂(PAF(C16))，每孔80μL加入到96孔化合物板中，设置不加激动剂的HBSS空白对照。
6.用FLIPR tetra检测每孔的钙流变化(先扫描2分钟，加入25μL激动剂后再继续扫描3min)。
7.数据导出ΔRFU(即0-300s中RFU max-RFUmin)
3实验结果：
抑制率计算公式：抑制率％＝1-[(样品组-HBSS空白对照组)/(激动剂组-HBSS空白对照组)]×100％
表1旱莲苷A、B、C和D对PTAFR的抑制活性
表1结果显示：旱莲苷A、B、C和D对血小板活化因子受体有一定的抑制活性，且存在剂量依赖关系。
实施例2旱莲苷A、B、C和D对支气管哮喘大鼠模型的影响
1、实验材料：
1.1动物：清洁级SD大鼠，均为雄性，体质量260±20g，青龙山动物繁殖场。
1.2主要试剂：卵清白蛋白(OVA)均购自sigma公司；地塞米松磷酸钠注射液(5mg/m1)购自广州白云山明兴制药有限公司。
1.3仪器：Powerlab/8sp’生理信号采集系统，购自埃德仪器国际贸易(上海)有限公司；LDZ5-2型离心机，购自北京京立离心机有限公司；M2e酶标仪，购自Molecular Devices公司；医用超声雾化吸入器，上海医疗器械厂。
2、实验方法：
2.1哮喘模型的制备：以10％的OVA 1ml、氢氧化铝干粉100mg、灭活百日咳杆菌疫苗(5×109/个,2ml)腹腔注射致敏大鼠,2周后以1％的OVA雾化吸入激发哮喘,以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为激发成功。
2.2实验分组：120只大鼠分成15组(正常对照组、哮喘模型组、旱莲苷A高、中、低剂量组，旱莲苷B高、中、低剂量组，旱莲苷C高、中、低剂量组，旱莲苷D高、中、低剂量组，阳性对照组)，每组8只。正常对照组以生理盐水代替OVA腹腔注射(2ml)及雾化吸入(30ml)。哮喘模型组以10％的OVA1ml、氢氧化铝干粉100mg、灭活百日咳杆菌疫苗(5×109/个,2ml)腹腔注射致敏，2周后将大鼠置于透明密闭容器中给予1％的OVA溶液30ml雾化吸入激发，中等雾量，每次20min左右，连续3d后隔天再激发1次，激发前腹腔注射生理盐水2ml，共4周。给药组每次激发前30min予以腹腔注射旱莲苷A、B、C、D各高剂量组为100mg/kg，中剂量组为50mg/kg，低剂量组为25mg/kg)阳性对照腹腔注射地塞米松注射液(0.5mg/kg)。以上各组动物均于最后1次激发后24h内处死。
2.3呼吸曲线 最后一次雾化后1h，将大鼠清醒状态下仰位固定，胸部去毛，在胸骨柄中部皮肤穿一细缝合线，另一端连接拉力换能器，线松紧适度，再与桥式放大器、八导生理记录仪及电脑连接。描记大鼠呼吸曲线，记录呼吸频率(次/min)。
2.4Eos计数腹主动脉取血20μL加入1.5mL EP管内，取乙醇-伊红稀释液0.38mL加入有20μL血液的1.5mL EP管内，充分混匀后，充入计数池内，静置2-5min。低倍镜下计数10个大方格内Eos数，再根据公式:10个大方格内Eos数×20，求出每微升Eos数。
2.5统计方法结果以均数±标准差表示，采用组间t检验。
3、实验结果：
表2旱莲苷A、B、C和D对大鼠呼吸频率及血液中Eos计数的影响
注：与哮喘模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表2结果表明建立哮喘模型大鼠的呼吸频率明显加快，Eos数量明显增加，模型组与对照组比较有显著性差异P＜0.01；旱莲苷A的高、中、低剂量组及旱莲苷B、C和D的高剂量组能明显抑制大鼠加快的呼吸频率，旱莲苷A的高、中、低剂量组，旱莲苷B和C的高、中剂量组，旱莲苷D的高剂量组能显著降低大鼠血液中的Eos量，与模型组比较P＜0.05，P＜0.01；表明旱莲苷A、B、C和D可以缓解哮喘引起的呼吸急促、频率加快并能显著降低大鼠血液中Eos的量，减轻Eos对气道浸润，降低气道反应性，从而达到舒张支气管和减轻炎症反应的作用。
实施例3旱莲苷A、B、C和D对哮喘豚鼠GM-CSF和PAF的治疗作用影响
1、实验材料：
1.1动物：健康雄性杂色豚鼠120只，体质量350-450g，青龙山动物繁殖场。1.2主要试剂：卵清白蛋白(OVA)购自sigma公司；GM-CSF检测试剂盒，购自上海可兴生物科技公司；PAF ELISA检测试剂盒，购自上海美旋生物科技有限公司；阳性对照药氨茶碱片，规格:0.1g/片，山西云鹏制药有限公司产品。
1.3仪器：LDZ5-2型离心机，购自北京京立离心机有限公司；M2e酶标仪，购自Molecular Devices公司；医用超声雾化吸入器，上海医疗器械厂。
2、实验方法：
2.1模型复制及给药将120只豚鼠随机分成15组：正常对照组(等量生理盐水灌服)，哮喘模型组(等量生理盐水灌服)，旱莲苷A、B、C、D高(每日100mg/kg)、中(每日5 0mg/kg)、低(每日2mg/kg)剂量组，氨茶碱组(每日0.025mg/kg),每组8只。采用豚鼠腹腔注射100g/L卵蛋白1ml致敏,自注射第14天起,每天上午、下午各一次将豚鼠置于雾缸内(空白对照组除外),用10g/L卵蛋白溶液超声雾化,任动物自行吸入10-20min,激发至哮喘发作,出现呼吸急促、点头、身体颤抖、伏地现象,提示模型复制成功,连续7d。豚鼠灌胃给药与诱喘同步进行,每组于当天两次激发间隔时间内给药,每组灌胃容积相同。22d后用30g/L戊巴比妥钠1ml腹腔注射麻醉豚鼠,固定于手术台上。
2.2检测指标
2.2.1支气管肺泡灌洗液(BALF)和血样采集①BALF采集:在豚鼠下颌下沿气管方向做一纵向切口2-3cm,切开皮肤,分离组织,充分暴露气管,在气管上方做一“T”形切口，插入18号灌胃针头,用手术丝线扎紧，用10ml注射器抽取NS进行灌洗，每次抽取约3ml,经反复灌洗3-5次后,抽出灌洗液,再重复共计3-5次，加入标号的试管中摇匀,豚鼠支气管肺泡灌洗液回收率达80％～90％,豚鼠支气管肺泡灌洗结束后处死。将试管中的支气管肺泡灌洗液轻轻摇匀,静置30min后,20℃,3000r/min离心10min,取上清液测定。参照试剂盒说明书进行。②血清制备:将豚鼠用250g/L乌拉坦按照1.2g/kg腹腔注射麻醉后,固定于手术台,打开腹腔,快速抽取腹主动脉血液约5ml,注入无菌试管,置于室温约1h后,以1500r/min离心30min,无菌吸取上层血清装于无菌瓶内,储存-20℃冰箱备用。
2.2.2GM-CSF和PAF检测:按试剂盒说明书操作。
2.3统计方法结果以均数±标准差表示，采用组间t检验。
3、实验结果：
表3各组豚鼠BALF中GM-CSF和血清PAF含量比较
注：与哮喘模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表3结果表明建立哮喘模型豚鼠的BALF中GM-CSF和血清PAF含量显著上升(P<0.01)；旱莲苷A的高、中、低剂量组及旱莲苷B、C和D的高、中剂量组BALF中GM-CSF含量显著降低，与模型组比较P＜0.05或P＜0.01；旱莲苷A、B和C的高、中、低剂量组以及旱莲苷D的高、中剂量组血清PAF含量，与模型组比较P＜0.05或P＜0.01；表明旱莲苷A、B、C和D可以抑制GM-CSF分泌和显著降低豚鼠血清PAF水平，阻止炎性细胞的激活和炎性递质的释放，从而减轻气道炎症，松弛支气管平滑肌，降低气道高反应性而治疗哮喘。
实施例4旱莲苷A在制备胶囊剂药物中的应用
将350g的旱莲苷A和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到旱莲苷A的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。
实施例5旱莲苷B在制备颗粒剂药物中的应用
将350g的旱莲苷B和1000g蔗糖及500g糊精混合混合，按照常规方法制成1000包旱莲苷B颗粒剂。每日3次，每次1粒。
实施例6旱莲苷C在制备片剂药物中的应用
将350g g的旱莲苷C和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆混合，按照常规方法制成旱莲苷C片剂1000片。每日3次，每次1片。
实施例7旱莲苷D在制备丸剂药物中的应用
将350g的旱莲苷D和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成旱莲苷D丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。
实施例8旱莲苷A在制备注射剂药物中的应用
将200g的旱莲苷A和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成旱莲苷A注射剂1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL 5％葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。