抗Aβ诱导的神经细胞凋亡及细胞骨架损伤的组合物的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体为一种抗Aβ诱导的神经细胞凋亡及细胞骨架损伤的组合物。

背景技术：

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease, AD)是老年痴呆的一种，主要表现为进行性的认知障碍和人格改变，特征性病理学改变为细胞内神经元缠结、细胞外大量由β-淀粉样蛋白肽（β-amyloid peptide，Aβ）构成的老年斑以及神经元缺失。目前，人们对AD的发病机制还不是十分清楚，有研究认为，过氧化损伤和自由基的生成与AD的发病密切相关。Aβ可以导致神经细胞的过氧化损伤，且许多抗氧化剂都有保护原代神经细胞及克隆的细胞系免受Aβ的毒性作用。

大豆，是豆类中营养价值最高的品种，在百种天然的食品中，它名列榜首，含有大量的不饱和脂肪酸，多种微量元素、维生素及优质蛋白质。大豆肽是指大豆蛋白质经蛋白酶作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物，它由大豆蛋白水解后的许多种肽分子混合物所组成，产品中还含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。大豆肽含有人体必需的8种氨基酸，除蛋氨酸为限制氨基酸外，其它氨其酸，均超过或接近WHO推荐标准，因此大豆肽具有较高的营养价值。中国是大豆生产大国，但有关大豆肽功能活性研究及机制探讨远远落后于西方发达国家。开发大豆肽相关产品及深入研究大豆肽功能活性机制任重道远。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服人们对AD的发病机制还不是十分清楚，无法克服Aβ毒性的缺陷，提供抗Aβ诱导的神经细胞凋亡及细胞骨架损伤的组合物。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种抗Aβ诱导的神经细胞凋亡及细胞骨架损伤的组合物，包含由2～10个氨基酸组成的大豆肽。

所述的大豆肽由大豆蛋白经复合酶水解所得。进一步的，所述的复合酶由凝乳酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和米黑毛酶组成。优先的，所述经复合酶由质量比为1:3:6:2～4:5的凝乳酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和米黑毛酶组成。

本发明的大豆肽具有较强的抗氧化作用，其内含有多种抗氧化物质，可通过消除自由基及螯合金属离子等方式发挥抗氧化作用。Aβ_25-35为Aβ位于第25-35个氨基酸位点的基因片段，是引起神经毒性的主要活性部位。Aβ毒性可引起小鼠原代神经细胞凋亡及神经细胞骨架的改变，而本发明的大豆肽对Aβ诱导的神经细胞凋亡及细胞骨架损伤具有明显的修复和保护作用。由于大豆是我国重要的粮食作物之一，大豆蛋白含量丰富，大豆肽来源非常广泛。而作为小分子蛋白质，大豆肽又非常容易被人体吸收。大豆肽对Aβ诱导神经细胞损伤所起的保护作用提示大豆肽可能对一些神经退行性疾病的预防和恢复有一定疗效，在天然药物及保健食品的开发方面有重要的研究和应用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是利用MTT法检测各组神经细胞活力图

图2是DAPI染色显示各组神经细胞的凋亡情况的柱状图；

图3是DAPI染色显示各组神经细胞的凋亡的形态变化图；

图4是western blot检测各组神经细胞凋亡蛋白的表达图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

一种抗Aβ诱导的神经细胞凋亡及细胞骨架损伤的组合物，包含由2～10个氨基酸组成的大豆肽。

所述的大豆肽由大豆蛋白经复合酶水解所得，所述的复合酶由质量比为1:3:6:2～4:5的凝乳酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和米黑毛酶组成。

以下应用Aβ_25-35作用于原代培养的小鼠海马神经元，建立体外AD神经元模型，研究大豆肽对Aβ 损伤的海马神经元是否具有保护作用。

实验动物：C57BL/6小鼠，购于南京大学模式动物研究所。

原代神经元培养：取孕18.5天母鼠拉颈处死，取出胎鼠，剥离胎鼠海马，0.25%胰酶消化15分钟（min），加入神经元预培养液（MEM，10%FBS，1 mM丙酮酸钠，100U 青/链霉素双抗，1x GlutaMAX）终止酶反应，并反复吹打10-20次，将海马组织吹散成单细胞；计数后按照1x105个/ml分别接种至24孔板、96孔板以及6 cm 培养皿中。随后放入37℃ CO2培养箱3-5小时（h）后，换成神经元培养液（Neurobasal medium，1x B27，1x GlutaMAX，100U 青/链霉素双抗）。每隔3天半量换液。

造模与组别设置：小鼠原代神经元培养7天后使用Aβ25-35造模。方法如下：首先使用0.01M PBS将Aβ25-35（Sigma, A4559）稀释成1μg/μl 溶液，在37℃培养箱中孵育7天，使Aβ25-35聚集以增加其毒性。随后分装4℃保存，备用。取一支已处理好的Aβ25-35加入原代神经元培养基内，使其终浓度为10μM。继续孵育24小时后，即为造模完成。分为5组，分别为：正常对照组，模型对照组，不同剂量SBP（0.1%，0.5%，1%）处理组。

法检测SBP对海马神经细胞活力的影响：神经元经造模及SBP处理48 h后，利用MTT法检测各组神经细胞的活力。方法如下：在神经元培养基中加入 5mg/ml 的MTT ，使其终浓度为0.5mg/ml；4 h后终止培养，小心吸弃培养基，每孔加入DMSO 150μl，37℃振荡10 min混匀，采用酶联免疫检测仪在490 nm处检测其光吸收值，实验重复3次。细胞活力/% = (实验组-空白组)/(对照组-空白组)×100%。

检测神经细胞凋亡形态变化：Aβ毒性会增加细胞的死亡，为了研究SBP对抗Aβ毒性的作用，利用DAPI（Invitrogen, D1306）检测各组凋亡的神经细胞。首先使用dd H2O将DAPI配制成2.5mg/ml 储存液，再用0.01 mol/L的PBS将其按照1:2000稀释成工作液。在神经元经造模及SBP处理48 h后，吸弃神经元培养基，加入4% 多聚甲醛4℃固定 15 min，0.01 mol/L的PBS洗2次。24孔板每孔加200μl DAPI工作液，室温避光孵育5 min。吸弃废液，0.01 mol/L的PBS洗2次。抗荧光淬灭封片剂封片，随后在荧光显微镜下观察拍照。

检测神经细胞凋亡蛋白的表达变化：取3只孕18.5天母鼠按1.2所述方法提取原代神经元后，接种至10个6 cm 培养皿中，培养7天后进行造模及SBP处理。48 h后，搜集各组细胞，利用RIPA裂解液提取蛋白。采用Lowry’s法（抗干扰Lowry法蛋白定量试剂盒，购自珠海健康元生物技术公司）测定各组总蛋白，定量后加入5X SDS缓冲液，煮沸10 min变性，于12% SDS聚丙稀酰胺凝胶中电泳。随后采用湿转法转移蛋白至NC膜；5％脱脂奶粉封闭，4℃孵育过夜，次日分别加入一抗，分别是：小鼠抗caspase 3(1:1500, Santa Cruz, sc136219)；小鼠抗caspase 9 (1:1000, Santa Cruz, sc56076)。随后室温孵育3 h；TBST缓冲液漂洗后分别加入HRP标记的二抗：羊抗小鼠IgG（1:10000，北京中杉金桥生物公司, ZB2305）；室温孵育1 h，TBST缓冲液漂洗3次，每次5 min；ECL化学发光法显示结果，压片曝光。以兔抗β-Actin多克隆抗体(1:1000, Santa Cruz，sc-130656)为内参照，ImageJ 软件分析条带灰度值，结果以对照组的百分率表示。

免疫荧光检测原代神经元细胞骨架的形态变化：神经元经造模及SBP处理48 h后，吸去培养基，经0.01 mol/L的PBS漂洗后，4% 多聚甲醛4℃固定 15 min。0.01 mol/L的PBS漂洗3次后，加入一抗（一抗稀释液为： 10% 正常山羊血清，0.3% TritonX-100，1％ BSA，0.01 mol/L的PBS配制），所用一抗分别是：兔抗β-III-tublin多克隆抗体（1:2000, abcam, ab18207），小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:500, abcam, ab11267)。一抗4℃孵育过夜。切片经0.01 mol/L的PBS漂洗后入二抗，二抗分别是：Alexa 568羊抗小鼠IgG（1:600，Moleular probes, A11004）；Alexa 488羊抗兔IgG（1:300, Moleular probes, A11008）；室温下避光孵育3 h，之后0.01 mol/L的PBS漂洗，荧光封片介质封片。在罗达明和FTC激发光下，用Olympus 荧光显微镜（BX61，日本产）进行观察，拍片。

统计分析：使用Image J软件对以上指标进行测量和统计，全部数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，所有实验至少重复3次，组间差异显著性检验釆用SPSS21.0统计软件中的ANOVA法进行差异显著性分析，P<0.05 即有统计学差异，P<0.01为显著性统计学差异。

结果

2.1 SBP对Aβ25-35所致神经损伤模型中细胞活力的影响

利用MTT法检测各组神经细胞活力的结果显示，神经元经Aβ25-35造模处理后，相对于对照组细胞存活率显著降低（P< 0.01），仅为55.8%；经0.1%浓度的SBP 处理后相对于对照组细胞存活率仍然是明显降低（P< 0.05），为65.3%；经0.5%浓度的SBP 处理后，能提高细胞存活率至89.7%；1%浓度的SBP亦能提高细胞存活率至80%以上，但相较0.5%浓度的SBP，量效并无明显提升（结果如图1所示）。2.2 SBP对Aβ25-35所致神经损伤模型中细胞凋亡状态的影响

DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。DAPI染色可用于细胞凋亡的检测，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化，细胞凋亡时，染色质凝集，胞核碎裂，荧光强度显著增强。原代神经元DAPI染色结果表明，在正常培养组及DMSO处理组，神经元细胞核圆润无皱缩，仅有少量细胞的核则呈现碎裂和固缩的特征；Aβ25-35作用24小时后，细胞凋亡现象明显增加，出现大量明亮固缩的胞核碎片（结果如图2所示）；不同浓度SBP处理48小时后，凋亡现象有所改善，且呈一定的剂量依赖关系，0.5%与1.0%的SBP处理组，细胞凋亡率与模型组相比明显降低，但两组之间没有明显差别，结果如图3所示。

DAPI核染提示可能存在细胞凋亡现象，进一步采用western blot检测各组神经细胞凋亡蛋白的表达结果显示，Aβ25-35作用24小时后，模型组Caspase-3 、Caspase-9蛋白表达量显著高于对照组；0.1% 浓度的SBP作用模型组48小时后，Caspase-3 、Caspase-9蛋白表达量与单纯模型组相比，有所降低，但变化不明显； 0.5% SBP与1.0% SBP 作用模型组48小时后，Caspase-3 、Caspase-9蛋白表达量与单纯模型组相比，均明显降低，提示0.5%与1.0% 的SBP对Aβ25-35引起的细胞凋亡均具有保护作用；0.5% SBP与1.0% SBP 模型组之间，凋亡细胞及凋亡蛋白表达量没有明显差别，提示 0.5% 浓度的SBP已经可以达到抗凋亡的最佳效果（结果如图4所示）。

对Aβ25-35所致神经损伤模型中细胞骨架的影响

微管相关蛋白MAP2是一种神经元特异性的细胞骨架蛋白，通常表达在成熟神经元的树突，能够很好的显示神经元树突的生长状态。β-III-Tublin是一种参与神经元细胞类型特异性分化的III型β-微管蛋白，可以很好的展现神经元轴突和轴突末端的细节。为了显示SBP对Aβ所致神经细胞损伤的影响作用，利用免疫荧光技术检测各组细胞形态及骨架蛋白特异性标志物的表达变化。结果表明，正常体外培养10天的原代神经元，MAP2阳性的树突分支较多，突起较长。10μM Aβ25-35造模处理，培养至第10天时，一部分神经元凋亡或死亡，幸存的神经元与同日DMSO处理的神经元相比，树突分枝少，突起也比较短。SBP对Aβ所致神经元损伤具有改善作用，0.5%与1.0%浓度的SBP可以明显提高神经元树突突起的长度。高倍镜下观察β-III-Tublin(Tuj1)免疫荧光染色结果可见，DMSO处理的原代神经元在培养至10天时，神经元各突起分支多且较长，胞体及突起荧光信号较强；而Aβ25-35处理后培养至第10天时，神经元突起分支少，且在胞体及突起周围散布很多点状碎片；经0.5%浓度的SBP处理培养至第10天时，神经元突起明显变长，点状碎片减少。

结论：

β-淀粉样蛋白肽（β-amyloid peptide，Aβ）是由淀粉样前体蛋白( amyloid precursor protein，APP) 经β-和γ-分泌酶水解产生。神经系统所有细胞均表达APP和产生Aβ，但在正常时Aβ的产生和降解保持平衡，且体内有一些因素保持Aβ的可溶性。家族性阿尔茨海默病患者APP基因突变可以导致Aβ的过量产生与沉积，从而显示Aβ的神经毒性作用，且这种作用在阿尔茨海默病的病程进展中发挥着主要作用。Aβ25-35为Aβ位于第25-35个氨基酸位点的基因片段，是引起神经毒性的主要活性部位。本研究采用Aβ_25-35作用于小鼠原代神经元，24小时后即可引起神经细胞的过多凋亡；随后，本研究采用大豆肽（Soybean Peptide, SBP）来对抗Aβ所致神经元损伤，结果发现，SBP对神经细胞的存活增殖具有明显的生理效应。SBP可以降低神经细胞的凋亡率，Caspase-3、Caspase-9等凋亡蛋白的表达水平与DAPI核染色表现出的凋亡现象基本一致。

本研究结果表明，Aβ_25-35作用于小鼠原代神经元，除引起神经细胞凋亡外，细胞骨架也出现了解体及破碎现象。神经元的细胞骨架是由蛋白多聚体组成的一个三维空间网架结构，主要有三种成分：微管、微丝和神经丝。在神经细胞中，细胞骨架系统的基本功能是维持神经元的特殊形态，参与形成神经元的特定功能区如胞体、树突、轴突及突触，并为神经元的物质转运提供保障。MAP-2是一个神经元特异性的细胞骨架蛋白，能够作为神经细胞表型的标记物，MAP-2蛋白被认为参与微管组装，通过与中间丝和其他微管的交联作用稳定微管生长。β-III-Tublin是一种参与神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白，是细胞骨架的组成成分，在细胞结构的维护，有丝分裂，减数分裂，细胞内的运输等等方面发挥作用。目前的研究表明，突触功能障碍是引起阿尔茨海默病患者临床症状加重的主要原因，而细胞骨架蛋白不正常的解离、聚合及异常的修饰是引起突触结构和功能改变的重要原因。目前有关SBP对抗Aβ毒性的研究还未有研究报道，本研究结果显示，SBP作用后，Aβ所致神经元损伤后神经元树突突起的长度明显提高，神经元微管蛋白的降解也得到了改善，β-III-Tublin、MAP2等微管蛋白及微管相关蛋白表达水平也有所增高。

SBP作为一种大豆蛋白水解后产生的小分子肽链，不但具有良好的免疫调节和生物防御作用，还能促进细胞的增殖。研究表明，可以通过促进2型糖尿病（T2DM）大鼠模型中胰岛β细胞的增殖，来调节血清胰岛素的分泌水平；SBP还可以刺激免疫细胞分泌免疫活性因子，增强机体免疫效应；饮用用大豆制品，能促进机体去甲肾上腺素、多巴胺等单胺类神经递质的释放，机体免疫活动效应增强。此外，给予心肌梗死大鼠模型9周大豆蛋白饮食饲养，发现大鼠心肌功能障碍可以得到明显改善，心肌氧化应激损伤显著降低。Kumrungsee等的研究表明，SBP可以维持细胞内Ca²⁺的稳态，降低线粒体内钙离子含量，而Aβ可在细胞膜双层脂质中形成允许Ca²⁺进出的通道，导致细胞内钙平衡失调，细胞内钙离子增加将导致氧化应激的进一步增强。因此，SBP维持Ca2+稳态的作用与钙离子阻滞剂类似，可以此减轻细胞内Aβ的毒性。

综上所述，Aβ毒性可引起小鼠原代神经细胞凋亡及神经细胞骨架的改变，而本发明的大豆肽对Aβ诱导的神经细胞凋亡及细胞骨架损伤具有明显的修复和保护作用。由于大豆是我国重要的粮食作物之一，大豆蛋白含量丰富， 因此SBP来源非常广泛。而作为小分子蛋白质，SBP又非常容易被人体吸收。SBP对Aβ诱导神经细胞损伤所起的保护作用提示SBP可能对一些神经退行性疾病的预防和恢复有一定疗效，在天然药物及保健食品的开发方面有重要的研究和应用价值。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。