本发明涉及的是生物制药的技术领域，尤其涉及的是一种NK细胞原液在制备治疗皮肤病药物中的应用。
背景技术：
在医学上，皮肤病是有关皮肤的疾病，是严重影响人民健康的常见病、多发病之一，如麻风、疥疮、真菌病、皮肤细菌感染等。皮肤病是皮肤(包括毛发和甲)受到内外因素的影响后，其形态、结构和功能均发生变化，产生病理过程，并相应的产生各种临床先后表现。皮肤病的发病率很高，多比较轻，常不影响健康，但少数较重甚至可以危及生命。
皮肤病的种类很多，包括真菌、细菌及病毒感染性皮肤病、自生免疫性皮肤病和物理性皮肤病等，大多患者都伴有红肿热痛、皮肤瘙痒等症状，不仅给患者带来不适，而且严重影响美观，若处理不当，极易发生感染、溃烂而难以治愈，留下难看的疤痕。
目前，皮肤病的治疗药物种类繁多，疗效参差不齐，主要包括内用药物和外用药物，内用药物包括抗细菌类药物、抗麻风药物、抗组织胺药、激素类药物等，外用药物包括抗菌药、止痒类药物、外用糖皮质激素、遮光剂、脱色剂等。这些药物大多存在治疗效果单一、疗程较长、对皮肤有刺激等缺点，尤其对顽固性皮肤病，由于治疗疗程长，长久使用存在很大的毒副作用，对患者健康造成不利影响。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种NK细胞原液在制备治疗皮肤病药物中的应用，以解决现有皮肤病药物种类繁多、治疗效果单一、疗程长、毒副作用大等技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种NK细胞原液在制备治疗皮肤病药物中的应用；NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞原液的主要成分是NK细胞分泌的蛋白质和细胞因子，包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、单核细胞趋化蛋白、白介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素以及穿孔素等，这些蛋白质和细胞因子能够被皮肤吸收，并能够直接作用于靶细胞，可杀灭或抑制细菌、真菌、病毒，改善皮肤的免疫系统，修复受损的皮肤，达到综合治疗各种皮肤类疾病的目的；使用后，皮肤表面形成保护膜，有利于受损皮肤的快速修复，防止病情反复加重。
进一步地，利用NK细胞原液制备获得的用于治疗皮肤病药物为一种外用生物制剂，具体制备方法包括：将NK细胞原液与外用药用辅料混合，制备获得外用液体制剂或外用膏状制剂，使用时，将外用药物制剂和/或外用膏状制剂涂抹于患处，即可达到治疗皮肤病的目的，其中，本发明中，将所述外用液体制剂命名为SNK液，将所述外用膏状制剂命名为SNK膏。
进一步地，使用时，先使用SNK液喷洒于患处，再使用SNK膏涂抹于患处，进行混合治疗，可保持药效能够更好地让皮肤吸收，达到最佳治疗效果，混合使用数天后，症状即可减轻或消失。
进一步地，所述NK细胞原液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：取新鲜血液，提取血液中的外周血单核细胞(以下简称PBMC)；
步骤二：在RPMI-1640基础培养基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的庆大霉素和10％重量百分比的胎牛血清，获得NK细胞培养液；
步骤三：取3.0×107-4.0×107个PBMC于一细胞培养瓶中，加入20-30ml的NK细胞培养液和2ml的浓度为1.0×107个/ml的NK扩增试剂，获得起始培养液；
步骤四：将NK细胞接种于起始培养液中培养1-2天，培养期间根据细胞生长状态添加NK细胞培养液；当培养至第3天时，将培养液离心，获得的细胞沉淀中加入NK细胞培养液继续培养；
步骤五：当NK细胞数量达1.5×108个/瓶以上时，加入2支NK扩增试剂和NK细胞培养液进行扩大培养，培养过程中根据细胞生长状态增加NK细胞培养液并进行分袋培养，使细胞浓度在1.0×106个/ml，当培养至第12天时，控制加液量，使细胞浓度为2.0×106个/ml；
步骤六：继续培养至第14天后，收集细胞培养液，获得NK细胞原液。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种NK细胞原液在制备皮肤病药物中的应用，所述NK细胞原液为NK细胞分泌的各种蛋白质和细胞因子的集合，利用这些蛋白质和细胞因子的抗菌、抗病毒等活性，当其被皮肤吸收后，可直接作用于靶细胞，从而消除病灶。通过大量临床试验发现，NK细胞原液具有广谱治疗皮肤病的效果，包括物理性皮肤病、蚊虫叮咬类皮肤病、自身免疫性皮肤病、细菌或真菌感染性皮肤病、皮肤附属器皮肤病等。由于其具备广谱治疗特性，在治疗某一类皮肤病的同时，可以同时杀伤或抑制真菌和细菌及病毒、改善皮肤的免疫系统，使用后，可形成皮肤保护膜，利于损伤修复，达到综合治疗皮肤病的目的，疗效显著，并能够有效防止病情的反复发作。药理学表明，NK细胞原液安全无毒副作用，长期使用无毒副作用，对于婴儿、孕妇、皮肤敏感者等特殊人群也同样适用；另外，由于NK细胞原液属于细胞因子制剂，无抗药性，长期使用效果不减。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1制备NK细胞原液
步骤一：PBMC提取：
将新鲜血液于740g离心10分钟，获得上层淡黄色血浆和下层血细胞，将下层血细胞与生理盐水按照体积比1：1混合，取50ml离心管，将稀释的血细胞悬液铺在15ml淋巴细胞分离液上，400g离心30分钟。收集中间白色膜状细胞层，加入生理盐水洗涤，400g离心10分钟，弃上清液，重复洗涤一次。最后用适量培养液重悬细胞沉淀，即获得PBMC。
步骤二：NK细胞培养液的制备：
在Gibco RPMI Medium 1640basic培养液(购买于美国GIBCO公司)中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的庆大霉素和10％重量百分比的Gibco FBS(购买于美国GIBCO公司)，获得NK细胞培养液。
步骤三：NK细胞起始培养液的制备：
取3.0×107-4.0×107个PBMC于一T75培养瓶中，加入20-30ml的NK细胞培养液和1支NK扩增试剂，其中，所述NK扩增试剂为一种CD8α-白介素21-CD137复合物(参见中国专利文献CN102154207A)，可直接通过市场购买的方式获得，本发明使用的NK 扩增试剂的产品规格为2ml/支，浓度为1×107个/ml。
步骤四：NK细胞起始培养：
将NK细胞接种于上述T75培养瓶中培养，其中：
第1、2天注意观察细胞状态。如果细胞状态良好可不处理。观察细胞密度明显加大，可加NK细胞培养液10ml。
第3天将培养液离心，获得的细胞沉淀转移至新的T75培养瓶中，并加入30ml的NK细胞培养液继续培养。
第4天观察细胞，若细胞状态良好，细胞密度较小，可不做处理；如果细胞密度过大，可酌情加NK细胞培养液。
第5天，若第4天未处理，且细胞状态良好，细胞密度大，则加入NK细胞培养液20ml。
第6天观察细胞，根据细胞密度加液，加NK细胞培养液30-50ml。
步骤五：NK细胞扩大培养：
第7天计数，若细胞数量大于1.5×108个/瓶，则加入2支NK扩增试剂，若细胞数量在30-60百万，则长至第8天再添加NK扩增试剂。然后添加NK细胞培养液，使总细胞浓度在1.0×106个/ml。随培养体积逐步增大，可转入T175培养方瓶扩大体积培养，培养液体积大于120ml或细胞数量大于2.0×108个/瓶时，则可以转移至培养袋培养。
第8-11天每天观察，按细胞生长速度加液，使得细胞浓度在1.0×106个/ml左右。第12-14天每天观察，当细胞数量大于3.0×109个/袋，并且体积大于1200ml时，将细胞分为2袋。
步骤六：收集NK细胞原液：
当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，14或15天收集细胞，此时细胞可到3×109个以上，NK细胞(CD3-CD56+)纯度可达到80％以上。
2.2制备SNK液：
按重量计，取NK细胞原液85.0％、甘油5.0％、硼砂0.08％、透明质酸0.1％、羟苯乙酯0.03％，溶剂为无菌水，混匀后灭菌分装，获得所述SNK液。
2.3制备SNK膏：
按重量计，取NK细胞原液80.0％、卡波姆941为1.5％、甘油为2.0％、三乙醇胺3.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.5％和无菌水，混匀后灭菌分装，获得所述SNK膏。
3、临床验证
将临床实验分成3组进行，具体为：
实验组1：用SNK液进行喷液治疗，每天使用2-3次，统计临床治疗结果。
实验组2：用SNK膏进行涂抹治疗，每天使用2-3次，统计临床治疗结果。
实验组3：用SNK液和SNK膏进行混合治疗(先用SNK液，再用SNK膏)，每天使用2-3次，统计临床治疗结果。
其中，对于浅部真菌性皮肤病，均进行刮取鳞屑及甲屑进行真菌直接镜检，并作出明确诊断后，作为实验病例。
表1：临床实验结果
上述临床实验可看出，本发明的SNK液和SNK膏对浅部真菌感染性皮肤病的治疗效果非常显著，对物理性皮肤病也有显著的治疗效果，对其他类型的皮肤病也具有一定治疗效果，具有广谱的治疗作用。治疗过程中，患者均未出现任何副作用，也说明了NK细胞原液安全无毒副作用。
SNK液和SNK膏的配方中，除NK细胞原液外，其余均为常规药用辅料，由于辅料本身不具备治疗效果，因此，可以得出是NK细胞原液在发挥治疗作用。理论上，药物中的NK细胞原液的含量越高，活性因子含量越高，效果越好，但考虑到使用方便性和增加皮肤渗透性和保护性的情况下，需要在NK细胞原液基础上添加了一些辅助成分，将其制备成不同药物制剂。
本实施例中，由于SNK液和SNK膏中NK细胞原液的含量不同，疗效稍微有差别，具体表现在实验组1相比较实验组2的临床治疗天数短，治疗效果较好。当SNK液和SNK膏一起使用时(实验组3，先涂SNK液，再涂SNK膏)，既可保证SNK液中的活性因子高效和持久被皮肤所吸收，又可提高疗效，两者联合使用疗效最佳。
实施例2
本实施例提供了一种广谱治疗皮肤病的外用药物制剂，所述药物制剂为一种SNK液，由NK细胞原液50％、单、双硬脂酸甘油酯10.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、二甲亚砜5.0％、山梨酸1.0-10.0％和适量无菌水组成。
利用上述SNK液治疗手足癣、婴儿湿疹、痱子和蚊虫叮咬，3天后症状减轻，7天可痊愈。
实施例3
本实施例提供的一种广谱治疗皮肤病的外用药物制剂，所述药物制剂为一种SNK膏，由NK细胞原液40％，白凡士林10.0％、单、双硬脂酸甘油酯10.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、二甲亚砜5.0％、山梨酸10.0％，余量为水。
实施例4
本实施例提供的一种广谱治疗皮肤病的外用药物制剂，所述药物制剂为一种SNK液，由100％的NK细胞原液组成。
实施例5
本实施例提供的一种广谱治疗皮肤病的外用药物制剂，所述药物制剂为一种SNK液，由NK细胞原液90.0％、卡波姆941为0.1％、甘油1.0％、三乙醇胺1.0％、羟苯乙酯0.01％、透明质酸0.05％和适量水组成。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。