治病化合物、组合物、方法、及化合物制备方法与流程
政府权利
本发明受政府资助而完成，为国立卫生院1U01HL127518-01。政府对本发明有特定权利。
背景技术：
某些Ras蛋白突变可以引起癌症。90％以上的胰腺癌看来与一些Ras蛋白突变有关联。在一些例子中，当Ras蛋白被GTP结合，Ras鸟嘌呤核苷酸置换因子(RasGEFs)似乎通过促进Ras-样(Ral)蛋白与GTP结合而激活Ral蛋白。活化的Ral蛋白有时能增进癌症的发展，包括致瘤和转移。RalGEF家族有4个成员：Ral鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)，RGL1，RGL2，以及RGL3。
已知有数种化合物能治疗癌症，但这远远不够。例如，多项研发临床有效Ras抑制剂的尝试都已失败。迄今好像尚没有关于RalGEFs抑制剂的报道。
本发明的一些实施方案解决了上述一或多种缺陷。例如，在本发明的一些实施方案中，披露了像式(I)这样的创新化合物。在一些实施方案中，披露了RalGEF抑制剂。另一些实施方案包括含有创新化合物的组合物(例如，药物组合物)。本发明的其他实施方案包括用创新化合物进行治疗的组合物(例如，药物组合物)，如治疗某些疾病的治疗组合物。一些实施方案包括用创新化合物(例如，以组合物形式或以药物组合物形式)进行给药和治疗(例如，治疗癌症这样的疾病)的方法。还有一些实施方案包括制备这些创新化合物的方法。本发明的其他实施方案也都在本文讨论。
发明概述
本发明的一些实施方案包括化合物，其选自式(I)化合物、其盐、光学异构体、几何异构体、异构体的盐、及其衍生物：
在一些实施方案中，R1是H，C1-C3烷基，C2-C3链烯基(alkenyl)，或C2-C3炔基(炔基)，其中C1-C3烷基，C2-C3链烯基，或C2-C3炔基可选被下列一或多个基团取代：卤素基团(halogen)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，乙炔基(-CCH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基；R2是H，卤素基团，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，C1-C3烷基，C2-C3链烯基，C2-C3炔基(alkynyl)，或C1-C2烷氧基，其中C1-C3烷基，C2-C3链烯基，C2-C3炔基，或C1-C2烷氧基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，乙炔基(-CCH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基；R3是H，卤素基团，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，C1-C3烷基，C2-C3链烯基，C2-C3炔基，或C1-C2烷氧基，其中C1-C3烷基，C2-C3链烯基，C2-C3炔基，或C1-C2烷氧基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，乙炔基(-CCH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基；R4是H，卤素基团，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C2-C7链烯基，C2-C7炔基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C2-C7链烯基，C2-C7炔基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，氧代基(oxo)(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，苯基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基(perfluoronated alkyl)，或C1-C3烷氧基；R5是H，卤素基团，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C2-C7链烯基，C2-C7炔基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C2-C7链烯基，C2-C7炔基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基；X是二价C1-C7烷基，其中该C1-C7烷基的1,2,或3个碳原子任选地被杂原子取代，且在有不止一个碳原子被取代时这些碳原子可以相同或不同，且其中C1-C7烷基或所述任一种杂原子取代基，只要是化学性质合适，任选被一个或多个一下基团取代：卤素基团，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基；和，环A是包含1,2,3,4或5个双键和4,5,6,7,8,9或10个碳原子的单环或双环，其中1,2,3,4或5个非融合碳原子(non-fusion carbon atoms)可以任选被杂原子取代(如，N，O，S)，且在有不止一个碳原子被取代时这些碳原子可以相同或不同，其中环A碳原子或所述任一种杂原子取代基，只要是化学性质合适，可任选地被一个或多个以下基团取代：卤素基团，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C6烷基，C1-C6全氟烷基(如，三氟甲基或全氟乙基)，或C1-C5烷氧基，且所述融合碳原子彼此单键合或双键合。在一些实施方案中，R1是H或C1-C3烷基，其中C1-C3烷基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在另一些实施方案中，R1是H，甲基，乙基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在一些实施方案中，R2是H，卤素基团，羟基(-OH)，C1-C3烷基，或C1-C2烷氧基，其中C1-C3烷基或C1-C2烷氧基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在另一些实施方案中，R2是H，卤素基团，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，乙基，甲氧基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在一些实施方案中，R3是H，卤素基团，羟基(-OH)，C1-C3烷基，或C1-C2烷氧基，其中C1-C3烷基或C1-C2烷氧基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在另一些实施方案中，R3是H，卤素基团，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，乙基，甲氧基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在一些实施方案中，R4是H，卤素基团，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，苯基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在又一些实施方案中，R4是Cl，羟基(-OH)，甲基，乙基，C1-5烷基，C3烷基，-CN，乙炔基，-CONH2，-CON(CH3)2，2-(吗啉基)乙氧基，-CO-吗啉-4-基，乙氧基，甲氧基，5-羟基吡啶基，5-羟基吡啶-3-基，吲哚基，1-吲哚基，1,2,3,4-四氢异喹啉基，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基，1,2-亚甲基二氧基苯基(methylenedioxyphenyl)，2,3-亚甲基二氧基苯基，呋喃基(furyl)，2-呋喃基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，2-三氟甲氧基苯基，3-三氟甲氧基苯基，4-三氟甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，苯基，苄基，吡啶基，3-吡啶基，亚甲基二氧基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在另一些实施方案中，R4是甲基，乙基，C3烷基，正丙基，异丙基，乙氧基，甲氧基，5-羟基吡啶基，5-羟基吡啶-3-基，吲哚基，1-吲哚基，1,2,3,4-四氢异喹啉基，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基，呋喃基，2-呋喃基)，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，2-三氟甲氧基苯基，3-三氟甲氧基苯基，4-三氟甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，苯基，苄基，吡啶基，3-吡啶基，亚甲基二氧基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在一些实施方案中，R5是H，卤素基团，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基任选被一个或多个以下基团取代：卤素基团，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在另一些实施方案中，R5是苯基，5-羟基吡啶基，5-羟基吡啶-3-基，6-羟基吡啶基，6-羟基吡啶-3-基，4-羟基吡啶基，4-羟基吡啶-3-基，吲哚基，1-吲哚基，1,2,3,4-四氢异喹啉基，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，-CO-吗啉-4-基，-CON(CH3)2，Cl，羟基(-OH)，甲基，C1-5烷基，C3烷基，正丙基，异丙基，-CN，乙炔基，-CONH2，-CON(CH3)2，2-(吗啉基)乙氧基，乙氧基，甲氧基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在还有一些实施方案中，R5是苯基，5-羟基吡啶基，5-羟基吡啶-3-基，吲哚基，1-吲哚基，1,2,3,4-四氢异喹啉基，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，甲基，C3烷基，正丙基，异丙基，乙氧基，甲氧基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在又一些实施方案中，R5是苯基，5-羟基吡啶基，5-羟基吡啶-3-基，吲哚基，1-吲哚基，1,2,3,4-四氢异喹啉基，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，或3,5-双-三氟甲基苯基。在一些实施方案中，X是
在另一些实施方案中，X是
在一些实施方案中，环A是
在一些实施方案中，环A是在一些实施方案中，式(I)是I-1，I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7，I-8，I-9，I-10，I-11，I-12，I-13，I-14，I-15，I-16，I-17，I-18，I-19，I-20，I-21，I-22，I-23，I-24，I-25，I-26，I-27，I-28，I-29，I-30，I-31，I-32，I-33，I-34，I-35，I-36，I-37，I-38，I-39，I-40，I-41，I-42，I-43，I-44，I-45，I-46，I-47，I-48，I-49，I-50，I-51，I-52，I-53，或I-54。在另一些实施方案中，R1并非H，R2并非H，R3并非H，R4并非3-甲氧基苯基，R5并非3-甲氧基苯基，X并非或环A并非在一些实施方案中，化合物I-1从式(I)排除。
本发明的一些实施方案包括含有本文公开的化合物(例如式(I))的组合物。在某些实施方案中，化合物的量为约0.0001％(按组合物总重量计)至约99％。在其他实施方案中，组合物还包含配方成分(formulary ingredient)，佐剂(adjuvant)或载体(carrier)。
本发明的一些实施方案包括含有本文公开的化合物(例如式(I))的药物组合物。在一些实施方案中，化合物的量为约0.0001％(按组合物总重量计)至约50％。在其他实施方案中，药物组合物还包含配方成分，佐剂或载体。
本发明的一些实施方案包括为动物提供化合物的方法，包括一或多次给药包含本文公开的化合物(例如式(I))的一或多种组合物，如果存在多次给药，所述组合物可以是相同或者不同。在其他实施方案中，一种或多种组合物中的至少一种还包含配方成分。在某些实施方案中，一种或多种组合物中的至少一种包含本文公开的组合物或本文公开的药物组合物。在其他实施方案中，一或多次给药中的至少一次包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药(topical administration)，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药或肌内给药。在其他实施方案中，如果存在多于一次给药，则用于至少一次给药的至少一种组合物与至少一次其他给药的组合物不同。在某些实施方案中，所述一种或多种组合物中至少一种的化合物以约0.01mg/kg动物体重至约15mg/kg动物体重的量给药于动物。在其他实施方案中，所述动物是人类，啮齿动物或灵长类动物。
本发明的一些实施方案包括治疗动物疾病的方法，其包括一次或多次给药一种或多种包含本文公开的化合物(例如式(I))的组合物，其中如果有多次给药，组合物可以是相同或不同。在一些实施方案中，一种或多种组合物中的至少一种还包含配方成分。在其他实施方案中，一种或多种组合物中的至少一种包含本文公开的组合物或本文公开的药物组合物。在其他实施方案中，一次或多次给药中的至少一种包括胃肠外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药或肌内给药。在其他实施方案中，如果存在多于一次给药，则用于至少一次给药的至少一种组合物与至少一次其他给药的组合物不同。在其他实施方案中，将一种或多种组合物中的至少一种组合物的化合物以约0.005mg/kg动物体重至约50mg/kg动物体重的量给药给动物。在一些实施方案中，所述动物是人类，啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述动物需要所述治疗。在另一些实施方案中，所述方法是用于治疗癌症。在又一些实施方案中，所述方法用于治疗胰腺癌，胰腺导管腺癌，肺癌，肝癌，结肠直肠癌，结肠癌，直肠癌，黑素瘤，皮肤恶性黑素瘤，黑素瘤肿瘤发生，膀胱癌，前列腺癌，恶性神经鞘瘤，多发性骨髓瘤，乳腺癌，鳞状细胞癌，头颈部鳞状细胞癌，淋巴瘤，白血病，骨髓癌，非霍奇金淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，多形性成胶质细胞瘤，子宫内膜癌，肾癌，基底细胞癌，甲状腺癌，神经母细胞瘤，卵巢癌，肾细胞癌，肝细胞癌，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性淋巴细胞白血病，横纹肌肉瘤，脑膜瘤，胃癌，胶质瘤，口腔癌，鼻咽癌，胃癌，子宫癌，髓母细胞瘤，可导致转移的癌症，由转移导致的癌症或其癌性肿瘤。在又一些实施方案中，所述方法用于治疗胰腺癌，胰腺导管腺癌，肺癌，肝癌，结肠直肠癌，结肠癌，直肠癌，黑素瘤，皮肤恶性黑素瘤，黑素瘤肿瘤发生，膀胱癌，恶性神经鞘瘤，多发性骨髓瘤，乳腺癌，鳞状细胞癌，头颈部鳞状细胞癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，可导致转移的癌症，由转移导致的癌症或其癌性肿瘤。在一些实施方案中，所述方法用于治疗胰腺癌，胰腺导管腺癌，肺癌，肝癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，可导致转移的癌症，由胰腺癌转移导致的癌症，由转移导致的肺癌，或其癌性肿瘤。
本发明的一些实施方案包括用于制备本文公开的化合物(例如式(I))的方法，其包括，
(a)使式(II)化合物与式(III)化合物反应得到包含式(IV)化合物的混合物；
(b)使式(IV)化合物与将氧代基转化成卤素基团的合适化合物反应以得到包含式(V)化合物的混合物；
(c)使式(V)化合物与式(VI)化合物反应；和
(d)回收式(I)，
其中式(II)是且R11是卤素基团或-CH2-卤素基团；
式(III)是R5-X-H(III)；
式(IV)是
式(V)是
式(VI)是在一些实施方案中，R11是-CH2-卤素基团，-CH2Br，或-CH2Cl。在另一些实施方案中，将氧代基转换成卤素基团的合适化合物是POCl3或POBr3。
本发明的其他实施方案也在本文中论及。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，并结合在此给出的具体实施例的描述，可以更好地理解本发明。
图1:一些式(Ⅰ)化合物对胰腺癌细胞系2D中软琼脂生长和正常生长的影响。图1A和1B:将含突变型Ras的胰腺肿瘤细胞系Panc-1(图1A)和MiaPaCa-2(图1B)铺在有10μM或0.9μM化合物I-1的软琼脂中，对集落形成进行评分。图1C和1D:测试化合物I-1在塑料上的正常2D生长条件下在相同细胞系(Panc-1(图1C)和MiaPaCa-2(图1D))上抑制细胞生长的能力。0＝载体。将细胞以相同的密度接种并在培养一周后进行评分。
图2:抑制多重RalGEFs可以对胰腺癌细胞的琼脂生长有协同抑制作用。图2A：使用免疫印迹(IB)，我们鉴定了对RalGDS有效的shRNA，并制备了稳定的匹配配对的MiaPaCa-2细胞系。然后，我们用经过验证的RGL2siRNA(Invitrogen)对所述匹配配对进行瞬时转染。图2B：然后测量4组细胞系统(加扰/加扰(scrambled)；shRalGDS/加扰；加扰/SiRGL2；和shRalGDS/SiRGL2)的软琼脂生长抑制。未观察到对2D培养物中正常细胞生长的影响(数据未显示)。
图3:有些式(I)化合物可以是泛-RalGEF抑制剂。在一些化合物存在下，HEK-293细胞用HA活化的K-Ras和GFP-RalGDS(图3A)或RGL2(图3B)共转染。将这些细胞裂解。将待测化合物加入到裂解物中至终浓度为10μM，然后将其与抗GFP-珠一起温育过夜。用免疫印迹(IB)分析免疫沉淀(IP)中Ras的存在。图3A：一例用HA激活的K-Ras和GFP-RalGDS共转染的HEK-293细胞的粗制IP和IB数据。图3B：该图显示了化合物I-1和I-2对RGL2数据的定量。
图4:一些式(I)化合物对Ral活化的特异性遏制。在有或无式(I)化合物(10μM)的情况下，用Cell Biolabs(SanDiego CA)试剂盒测定具有内源超活化Ras的细胞的内源Ral活化。待测化合物溶于DMSO中。DMSO作为载体阴性对照。IP是免疫沉淀。IB是免疫印迹。然后使用磷酸ERK抗体测定细胞裂解物的MAPK途径活化作用的水平；DMSO对照的活性与经化合物处理的细胞相同(数据未显示)。肌动蛋白用作上样对照。
图5:一些式(I)化合物在体内(in vivo)遏制Ral GTP水平。NRG小鼠皮下给予Mia-PaCa2细胞异种移植物。对于经载体处理的异种移植小鼠和经化合物I-1处理的异种移植小鼠，用下拉测定试剂盒(pull down assay kit)，测定肺组织中经过活化的RalA的水平。化合物I-1看来是遏制活性RalA的水平。
图6:一些式(I)化合物遏制胰腺癌细胞转移。NRG小鼠皮下接种PBS(“无肿瘤细胞”)或5x106Ras驱动型Mia-PaCa-2细胞。使小鼠恢复1周，然后每隔一天注射(ip)PBS/DMSO载体或10mg/kg化合物I-1，共2周。一周后，对小鼠进行原发肿瘤生长和肺转移评分。图6A显示转移受到抑制。图6B显示了图6A的未处理和处理的小鼠(分别为中肺和右肺)的定量。
发明详述
涵盖总体发明构思的实施方案可以采取多样化的形式，本文将描述各种实施方案，但应理解，本公开仅被认为是示例性的，并且本发明的总体构思不打算局限于所公开的这些实施方案。
本发明的一些实施方案包括本发明的化合物(如式(I)化合物)。其他实施方案包括含有本发明化合物的组合物(如药物组合物)。本发明的其他实施方案包括用于使用本发明化合物治疗例如某些疾病的组合物。一些实施方案包括使用本发明化合物(例如，在组合物或药物组合物中)用于给药和治疗的方法。另外的实施方案包括制备本发明化合物的方法。
如本文所用(除非另有说明)，术语“烷基”是指单价的直链或支链烃链。例如，术语“C1-C7烷基”或“C1-C4烷基”分别是指具有1至7(如1,2,3,4,5,6,或7)个或1至4(如1,2,3或4)个碳原子的直链或支链饱和烃基。C1-C7烷基的实例包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，仲戊基，正己基和正庚基。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基和叔丁基。
如本文所用(除非另有说明)，术语“链烯基”是指包含一个或多(如1,2,3或4)个双键的单价直链或支链烃链。链烯基的实例包括但不限于乙烯基，烯丙基，1-丙烯基，2-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基和5-己烯基。
如本文所用(除非另有说明)，术语“烷氧基”是指通过氧原子(烷基-O-)与分子的其余部分连接的任何上述烷基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基(有时显示为MeO-)，乙氧基，异丙氧基，丙氧基和丁氧基。
如本文所用(除非另有说明)，术语“炔基”是指包含一个或多个(如1,2,3或4个)三键、并且还可任选地在链中包含一个或多个(例如1,2,3或4个)双键的单价直链或支链烃链。炔基的实例包括但不限于乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-戊炔基，4-戊炔基，1-己炔基，2-己炔基，3-己炔基，4-己炔基和5-己炔基。
如本文所用(除非另有说明)，术语“芳基”是指单价的，单环或双环的5,6,7,8,9,10,11或12元芳族烃基，未被取代的形式。芳基基团的实例包括但不限于苯基，萘基，甲苯基和二甲苯基。对于被指定为取代的双环芳基，一个或两个环可以被取代。
如本文所用(除非另外指明)，术语“环烷基”是指单价的单环或双环的3,4,5,6,7,8,9,10,11或12元烃基。环可以是饱和的或部分不饱和的。环烷基的实例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基，以及双环烷基(如双环辛烷如[2.2.2]二环辛烷或[3.3.0]双环辛烷，双环壬烷如[4.3.0]双环壬烷，和双环癸烷如[4.4.0]双环癸烷(十氢化萘)，或螺环化合物)。对于单环环烷基，该环不是芳族的。对于双环环烷基，如果一个环是芳族的，则另一个不是芳族的。对于被指定为取代的双环环烷基，一个或两个环可以被取代。
如本文所用(除非另有说明)，术语“卤素基团”是指单价的Cl，F，Br或I。
如本文所用(除非另有说明)，术语“杂芳基”是指单价的单环或双环5,6,7,8,9,10,11或12元烃基，其中1,2,3,4,5或6个碳原子被独立地选自硝基，氧或硫原子的杂原子取代，且该单环或双环系统是芳香族的。杂芳基基团的例子包括但不限于噻吩基(或硫代苯基)，呋喃基，吲哚基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，恶唑基，噻唑基，喹啉基，嘧啶基，咪唑基，三唑基，四唑基，1H-吡唑-4-基，1-Me-吡唑-4-基，吡啶-3-基，吡啶-4-基，3,5-二甲基异恶唑基，1H-吡咯-3-基，3,5-二-Me-吡唑基，和1H-吡唑-4-基。对于双环杂芳基，如果一个环是芳基，那么另一个是杂芳基。对于双环杂芳基，一个或两个环可以具有一个或多个杂原子。对于被指定为取代的双环杂芳基，一个或两个环可以被取代。
如本文所用(除非另有说明)，术语“杂环基”是指单价的单环或双环5,6,7,8,9,10,11或12元烃，其中1,2,3,4,5或6个碳原子被独立选自硝基原子，氧原子或硫原子的杂原子替代，并且该单环或双环体系不是芳族的。杂环基基团的实例包括但不限于四氢吡喃，吡咯烷基(如吡咯烷-1-基，吡咯烷-2-基，吡咯烷-3-基，或吡咯烷-4-基)，哌嗪基(如，哌嗪-1-基，哌嗪-2-基，哌嗪-3-基，或哌嗪-4-基)，哌啶基(如哌啶-1-基，哌啶-2-基，哌啶-3-基，或哌啶-4-基)，以及吗啉基(如，吗啉-1-基，吗啉-2-基，吗啉-3-基，或吗啉-4-基)。对于双环杂环基，如果一个环是芳基(如单环芳基或杂芳基)，那么另一个环不是芳族的。对于双环杂环基，一个或两个环可以具有一个或多个杂原子。对于被指定为取代的双环杂环基，一个或两个环可以被取代。
如本文所用(除非另有说明)，术语“杂原子”是指选自硝基原子，氧原子或硫原子的原子。
如本文所用(除非另有说明)，术语“羟基”表示存在单价-OH基团。
如本文所用(除非另有说明)，术语“取代的”(如在取代的烷基中)是指(具有一个或多个氢原子的)化学基团的一个或多个氢原子可以被一个或更多选自指定选项的非氢取代基替换。替换可能发生在一个或多个位置。术语“任选取代的”是指(具有一个或多个氢原子的)化学基团的一个或多个氢原子可以是被取代、但不是必须被取代。
本发明的一些化合物可以具有一个或多个手性中心，所述一个或多个手性中心的任何一个可以以旋光(optically active)形式和外消旋形式存在，以及可以被分离成旋光和外消旋形式。一些化合物可以表现出多晶型。本发明化合物(例如式I)包括任何旋光体，外消旋体，立体异构体形式，多晶型，或它们的混合物。如果未指明手性中心在化学结构中的构型(即R或S)，则应该认为它代表R，S或外消旋物。
化合物和组合物包括药物组合物
本发明的一些实施方案包括式(I)的化合物：
在其他实施方案中，R1可以是单价H，C1-C3烷基(如，C1，C2，或C3烷基)，C2-C3链烯基(如，C2或C3链烯基)，或C2-C3炔基(如，C2或C3炔基)，其中C1-C3烷基，C2-C3链烯基，或C2-C3炔基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，乙炔基(-CCH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在另一些实施方案中，R1可以是H或C1-C3烷基(如，C1，C2，或C3烷基)，其中C1-C3烷基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在一些实施方案中，R1可以是H，甲基，乙基，全氟化甲基，或全氟化乙基。
在其他实施方案中，R2可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，C1-C3烷基(如，C1，C2，或C3烷基)，C2-C3链烯基(如，C2或C3链烯基)，C2-C3炔基(如，C2或C3炔基)，或C1-C2烷氧基(如，C1或C2烷氧基)，其中C1-C3烷基，C2-C3链烯基，C2-C3炔基，或C1-C2烷氧基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，乙炔基(-CCH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在另一些实施方案中，R2可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，C1-C3烷基(如，C1，C2，或C3烷基)，或C1-C2烷氧基(如，C1或C2烷氧基)，其中C1-C3烷基或C1-C2烷氧基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在一些实施方案中，R2可以是H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，乙基，甲氧基，全氟化甲基，或全氟化乙基。
在其他实施方案中，R3可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，C1-C3烷基(如，C1，C2，或C3烷基)，C2-C3链烯基(如，C2或C3链烯基)，C2-C3炔基(如，C2或C3炔基)，或C1-C2烷氧基(如，C1或C2烷氧基)，其中C1-C3烷基，C2-C3链烯基，C2-C3炔基，或C1-C2烷氧基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，乙炔基(-CCH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在另一些实施方案中，R3可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，C1-C3烷基(如，C1，C2，或C3烷基)，或C1-C2烷氧基(如，C1或C2烷氧基)，其中C1-C3烷基或C1-C2烷氧基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，磺基(-SO3H)，甲基，或乙基。在一些实施方案中，R3可以是H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，羟基(-OH)，氰基(-CN)，磺基(-SO3H)，甲基，乙基，甲氧基，全氟化甲基，或全氟化乙基。
在一些实施方案中，R4可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基(如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，或C7烷基)，C2-C7链烯基(如，C2，C3，C4，C5，C6，或C7链烯基)，C2-C7炔基(如，C2，C3，C4，C5，C6，或C7炔基)，C1-C6烷氧基(如，C1，C2，C3，C4，C5，或C6烷氧基)，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C2-C7链烯基，C2-C7炔基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，苯基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在另一些实施方案中，R4可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基(如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，或C7烷基)，C1-C6烷氧基(如，C1，C2，C3，C4，C5，或C6烷氧基)，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，苯基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在一些实施方案中，R4可以是Cl，羟基(-OH)，甲基，乙基，C1-5烷基，C3烷基(如，正丙基或异丙基)，-CN，乙炔基，-CONH2，-CON(CH3)2，2-(吗啉基)乙氧基，-CO-吗啉-4-基，乙氧基，甲氧基，5-羟基吡啶基(如，5-羟基吡啶-3-基)，吲哚基(如，1-吲哚基)，1,2,3,4-四氢异喹啉基(如，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基)，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，呋喃基(如，2-呋喃基)，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，2-三氟甲氧基苯基，3-三氟甲氧基苯基，4-三氟甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，苯基，苄基，吡啶基，3-吡啶基，亚甲基二氧基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在一些实施方案中，R4可以是甲基，乙基，C3烷基，正丙基，异丙基，乙氧基，甲氧基,5-羟基吡啶基(如，5-羟基吡啶-3-基)，吲哚基(如，1-吲哚基)，1,2,3,4-四氢异喹啉基(如，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基)，呋喃基(如，2-呋喃基)，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，2-三氟甲氧基苯基，3-三氟甲氧基苯基，4-三氟甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，苯基，苄基，吡啶基，3-吡啶基，亚甲基二氧基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。
在一些实施方案中，R5可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基(如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，或C7烷基)，C2-C7链烯基(如，C2，C3，C4，C5，C6，或C7链烯基)，C2-C7炔基(如，C2，C3，C4，C5，C6，或C7炔基)，C1-C6烷氧基(如，C1，C2，C3，C4，C5，或C6烷氧基)，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C2-C7链烯基，C2-C7炔基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在另一些实施方案中，R5可以是单价H，卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，-CN，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基(如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，或C7烷基)，C1-C6烷氧基(如，C1，C2，C3，C4，C5，或C6烷氧基)，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基，其中甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，C1-C7烷基，C1-C6烷氧基，环烷基，杂环基，芳基，或杂芳基可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在一些实施方案中，R5可以是苯基，5-羟基吡啶基(如，5-羟基吡啶-3-基)，6-羟基吡啶基(如，6-羟基吡啶-3-基)，4-羟基吡啶基(如，4-羟基吡啶-3-基)，吲哚基(如，1-吲哚基)，1,2,3,4-四氢异喹啉基(如，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基)，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，-CO-吗啉-4-基，-CON(CH3)2，Cl，羟基(-OH)，甲基，乙基，C1-5烷基，C3烷基(如，正丙基或异丙基)，-CN，乙炔基，-CONH2，-CON(CH3)2，2-(吗啉基)乙氧基，乙氧基，甲氧基，呋喃基(如，2-呋喃基)，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，2-三氟甲氧基苯基，3-三氟甲氧基苯基，4-三氟甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在一些实施方案中，R5可以是苯基，5-羟基吡啶基(如，5-羟基吡啶-3-基)，吲哚基(如，1-吲哚基)，1,2,3,4-四氢异喹啉基(如，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基)，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，甲基，C3烷基(如，正丙基或异丙基)，乙氧基，甲氧基，呋喃基(如，2-呋喃基)，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，2-三氟甲氧基苯基，3-三氟甲氧基苯基，4-三氟甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，3,5-双-三氟甲基苯基，全氟化甲基，或全氟化乙基。在一些实施方案中，R5可以是苯基，5-羟基吡啶基(如，5-羟基吡啶-3-基)，吲哚基(如，1-吲哚基)，1,2,3,4-四氢异喹啉基(如，2-1,2,3,4-四氢异喹啉基)，呋喃基(如，2-呋喃基)，1,2-亚甲基二氧基苯基，2,3-亚甲基二氧基苯基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，4-氟苯基，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙氧基苯基，3-乙氧基苯基，4-乙氧基苯基，2-三氟甲基苯基，3-三氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，2-三氟甲氧基苯基，3-三氟甲氧基苯基，4-三氟甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,5-二乙氧基苯基，3,5-二甲基苯基，3,5-二乙基苯基，3,5-二羟基苯基，3,5-二氟苯基，3,5-二氯苯基，或3,5-双-三氟甲基苯基。
在一些实施方案中，X可以是双价C1-C7烷基(如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，或C7烷基)其中1,2,或3个C1-C7烷基碳原子可以任选用杂原子(如，N，O，或S)取代，且若有不止一个碳原子被取代时这些碳原子可以相同或不同，其中C1-C7烷基(如，包括任一种杂原子取代，只要化学性质合适)可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在另一些实施方案中，X可以是双价C1-C4烷基(如，C1，C2，C3，或C4烷基)其中1,2,或3个C1-C4烷基碳原子可以任选用一或多种杂原子(如，N，O，或S)取代，和其中C1-C4烷基(如，包括任一种杂原子取代，只要化学性质合适)可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C3烷基，C1-C3全氟烷基，或C1-C3烷氧基。在一些实施方案中，X可以是
在一些实施方案中，X可以是
在一些实施方案中，X可以是上述任一X部分(moieties)可以插入所示结构中，或者可以沿垂直轴旋转180度再插入所示结构中(如，可以沿垂直轴旋转180度成为再插入该结构中)。
在一些实施方案中，环A是包含4,5,6,7,8,9或10个碳原子(如4,5,6,7或8个碳原子)的单环或双环，其中1,2,3,4,或5个(如1,2或3个)非融合碳原子可以任选地被杂原子(如，N，O，S)取代，并且，在有一个以上的碳原子被取代时杂原子可以相同或不同，其中环A碳原子或任一种杂原子取代物(只要化学性质合适)可以任选用一或多种(如，0，1，2，3，4，5，或6种)以下基团取代：卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)，氧代基(＝O)，羟基(-OH)，甲酰基(-COH)，羧基(-CO2H)，硝基(-NO2)，-NH2，-N(CH3)2，氰基(-CN)，乙炔基(-CCH)，丙炔基，磺基(-SO3H)，吗啉基，-CO-吗啉-4-基，-CONH2，-CON(CH3)2，C1-C6烷基，C1-C6全氟烷基(如，三氟甲基或全氟乙基)，或C1-C5烷氧基。两个“融合碳原子(fusion carbon atoms)”被定义为使环A与嘧啶样部分融合的两个环A碳原子；“非融合碳原子”被定义为环A中的其他碳原子，它们不是上述两个融合碳原子。环A可以是单环或双环，以分别产生(即与嘧啶样部分一起产生)双环或三环结构。环A可以在一些实施方案中包含1,2,3,4或5个双键，如果环A是双环，则所述双键可以位于一个或两个环中。在另一些实施方案中，环A本身可以是芳族，可以产生双环-或三环(即，与嘧啶-样部分融合的环A)，或是两者。在一些实施方案中，融合碳原子可以是单键或互为双键。在一些实施方案中，环A可以是
在一些实施方案中，环A可以是如本文所用，*是指环A两个融合碳原子中每一个的融合点。上述各部分(moieties)中的任何一个都可以插入所示结构中，或者可以沿水平轴旋转180度再插入所述结构中(如，可以沿水平轴旋转180度成为再插入该结构中)。
在一些实施方案中，式(I)化合物可选自表1所示的那些。
表1
在一些实施方案中，化合物I-1，I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7，I-8，I-9，I-10，I-11，I-12，I-13，I-14，I-15，I-16，I-17，I-18，I-19，I-20，I-21，I-22，I-23，I-24，I-25，I-26，I-27，I-28，I-29，I-30，I-31，I-32，I-33，I-34，I-35，I-36，I-37，I-38，I-39，I-40，I-41，I-42，I-43，I-44，I-45，I-46，I-47，I-48，I-49，I-50，I-51，I-52，I-53，或I-54中的一个或多个从本发明的化合物(如，式(I))排除。在一些实施方案中，化合物I-1从本发明的化合物(如，式(I))排除。
在一些实施方案中，本发明的化合物包括下列一或多个：I-1，I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7，I-8，I-9，I-10，I-11，I-12，I-13，I-14，I-15，I-16，I-17，I-18，I-19，I-20，I-21，I-22，I-23，I-24，I-25，I-26，I-27，I-28，I-29，I-30，I-31，I-32，I-33，I-34，I-35，I-36，I-37，I-38，I-39，I-40，I-41，I-42，I-43，I-44，I-45，I-46，I-47，I-48，I-49，I-50，I-51，I-52，I-53，或I-54。在一些实施方案中，本发明的化合物包括下列一或多个：I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7，I-8，I-9，I-10，I-11，I-12，I-13，I-14，I-15，I-16，I-17，I-18，I-19，I-20，I-21，I-22，I-23，I-24，I-25，I-26，I-27，I-28，I-29，I-30，I-31，I-32，I-33，I-34，I-35，I-36，I-37，I-38，I-39，I-40，I-41，I-42，I-43，I-44，I-45，I-46，I-47，I-48，I-49，I-50，I-51，I-52，I-53，或I-54。在一些实施方案中，本发明的化合物包括I-1，I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7，I-8，I-9，I-10，I-11，I-12，I-13，I-14，I-15，I-16，I-17，I-18，I-19，I-20，I-21，I-22，I-23，I-24，I-25，I-26，I-27，I-28，I-29，I-30，I-31，I-32，I-33，I-34，I-35，I-36，I-37，I-38，I-39，I-40，I-41，I-42，I-43，I-44，I-45，I-46，I-47，I-48，I-49，I-50，I-51，I-52，I-53，和I-54。在一些实施方案中，本发明的化合物包括I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7，I-8，I-9，I-10，I-11，I-12，I-13，I-14，I-15，I-16，I-17，I-18，I-19，I-20，I-21，I-22，I-23，I-24，I-25，I-26，I-27，I-28，I-29，I-30，I-31，I-32，I-33，I-34，I-35，I-36，I-37，I-38，I-39，I-40，I-41，I-42，I-43，I-44，I-45，I-46，I-47，I-48，I-49，I-50，I-51，I-52，I-53，和I-54。
在一些实施方案中，R1并非H，R2并非H，R3并非H，R4并非3-甲氧基苯基，R5并非3-甲氧基苯基，X并非或环A并非在另一些实施方案中，一或多个(如,1,2,3,或4个)以下条件适用于式(I):R1并非H，R2并非H，R3并非H，R4并非3-甲氧基苯基，R5并非3-甲氧基苯基，X并非或环A并非在一些实施方案中，R5并非3-甲氧基苯基。在另一些实施方案中，X并非
在一些实施方案中，式(I)化合物可以是盐、光学和几何异构体、以及异构体的盐的形式。在另一些实施方案中，化合物可以以各种形式存在，例如不带电荷的分子，分子络合物的组分，或非刺激性的药理学可接受的盐，包括但不限于盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，磷酸盐，硝酸盐，硼酸盐，乙酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，和水杨酸盐。在一些情况下，对于酸性化合物，盐可以包括金属，胺，或有机阳离子(例如季铵)。在另一些实施方案中，可以使用所述化合物的具有所需滞留和释放特征、但易被机体pH、酶或其他合适手段水解的简单衍生物(如醚，酯或酰胺)。
在一些实施方案中，具有手性中心的本发明化合物可存在于旋光和外消旋形式中并以其分离。在另一些实施方案中，化合物可呈现多晶型。本发明的一些实施方案涵盖本文所述化合物的任何外消旋，旋光，多晶型，或立体异构形式，或其混合物。旋光形式的制备可以通过任何合适的方法完成，包括但不限于通过重结晶技术拆分外消旋形式，由旋光原料合成，手性合成，或使用手性固定相进行层析分离。
在一些实施方案中，本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)可以抑制RalGEF家族成员(如，RalGDS，RGL1，RGL2，RGL3)或其组合的活性。在一些实施方案中，本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)可以抑制RalGDS和RGL2的活性。在另一些实施方案中，本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)可以是泛-RalGEF抑制剂。在另一些实施方案中，本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)可以抑制K-Ras与RalGDS的相互作用并且可以抑制K-Ras与RGL2的相互作用。在还有一些实施方案中，本发明的化合物(如，式(I)，I-1，或I-2)可促进细胞周期阻滞/衰老，促进细胞凋亡，抑制Ral诱导的分泌，在Ras驱动的胰腺癌细胞中遏制NFkB途径的活化，阻断癌症干细胞的生长和发育，遏制线粒体裂变成分，或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种本发明化合物(如，式(I))可以是组合物的一部分并且可以是(按组合物总重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，或不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
在一些实施方案中，一种或多种本发明化合物(如，式(I))可以以如下量纯化或分离(按组合物总重量计)：至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
本发明的一些实施方案包括包含一种或多种本发明化合物(如，式(I))的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物，例如适合给予动物(如哺乳动物，灵长类动物，猴子，人类，犬科动物，猫科动物，猪，小鼠，兔子或大鼠)的组合物。在某些情况下，药物组合物是无毒的，不引起副作用，或两者兼而有之。在一些实施方案中，可能存在固有的副作用(如，它可能伤害患者，或可能在一些患者中一定程度上有毒或有害)。
“治疗有效量”是指有效实现期望和/或有益效果的量。有效量可以在一或多次给药中给予。为了本发明的一些目的，治疗有效量是适于治疗适应症的量。治疗适应症意味着实现任何期望的效果，例如减轻，改善，稳定，逆转，缓慢或延迟疾病进展，提高生活质量，或延长寿命中的一项或多项。这种成就可以通过任何合适的方法来衡量，如肿瘤大小的测量。
在一些实施方案中，一种或多种本发明化合物(如，式(I))可以是药物组合物的一部分，并且含量可以是至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，不超过约99.99％，从约0.001％至约99％，从约0.001％至约50％，从约0.1％至约99％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。在一些实施方案中，药物组合物可以以适合表面局部(topical)，皮下，鞘内，腹腔，口腔，胃肠外，直肠，皮内，鼻腔，阴道或眼部给药途径的形式存在。在另一些实施方案中，药物组合物可以以适合肠胃外给药，粘膜给药，静脉给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药或肌内给药的剂型呈现。药物组合物可以是例如片剂，胶囊剂，丸剂，粉粒剂(powders granulates)，悬剂，乳剂，溶液，凝胶剂(包括水凝胶剂)，糊剂，软膏剂，乳膏剂，硬膏剂(plasters)，淋溶剂(drenches)，递送装置，栓剂，灌肠剂(enemas)，注射剂，植入物，喷雾剂，气雾剂或其他合适的形式。
在一些实施方案中，药物组合物可以包含一种或多种配方成分。“配方成分(formulary ingredient)”可以是任何合适的成分(如，适用于该药物，药物剂量，药物释放时间，疾病，疾病状态，或给药途径)，包括但不限于，水(例如，开水，蒸馏水，过滤水，无热原水或含氯仿的水)，糖(如蔗糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，或由其制成的糖浆)，乙醇，甘油，二醇(如丙二醇)，丙酮，醚，DMSO，表面活性剂(如阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂，或非离子表面活性剂(如polysorbates))，油(如，动物油，植物油(如椰子油或花生油)或矿物油)，油衍生物(如乙基油酸酯，甘油单硬脂酸酯或氢化甘油酯)，赋形剂，防腐剂(如半胱氨酸，蛋氨酸，抗氧化剂(如维生素(如，A，E或C)，硒，视黄醇棕榈酸酯，柠檬酸钠，柠檬酸，氯仿，或对羟基苯甲酸酯，(如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯))，它们或组合。
在一些实施方案中，药物组合物可以被配制成基本上在给药后立即释放，或者在任何基本上预定的时间或在给药后时间释放活性成分(如一种或多种本发明化合物如式(I))。这种配制剂可以包括例如控释制剂，如各种控释组合物和包衣。
其他配制剂(如药物组合物的配制剂)可以在一些实施方案中包括将药物(或控制释放配制剂)掺入食品(food)，食材(food stuffs)，饲料(feed)或饮料中的那些。
本发明的其他实施方案可以包括对生物体给药或治疗生物体的方法，其中可涉及用有效治疗量的至少一种本发明化合物(如，式(I))治疗该生物体患有、或疑似患有、或易患的疾病(disease)、状况(condition)、或失调(disorder)，或带来所需生理效应。在一些实施方案中，组合物或药物组合物包含至少一种本发明化合物(如，式(I))，其可以按以下量给予动物(如，哺乳动物，灵长类，猴或人)：约0.005至约50mg/kg体重，约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10mg/kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.005mg/kg，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约0.5mg/kg，约1mg/kg，约3mg/kg，约5mg/kg，约5.5mg/kg，约6mg/kg，约6.5mg/kg，约7mg/kg，约7.5mg/kg，约8mg/kg，约10mg/kg，约12mg/kg，或约15mg/kg。就某些条件而言，所述剂量可以是约0.5mg/kg人的体重或约6.5mg/kg人的体重。在一些情况下，一些动物(如，哺乳动物，小鼠，兔，猫，猪，或犬)可以按以下剂量给药：约0.005至约50mg/kg体重，约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10mg/kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.005mg/kg，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约1mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约20mg/kg，约30mg/kg，约40mg/kg，约50mg/kg，约80mg/kg，约100mg/kg，或约150mg/kg。当然，本领域技术人员将认识到，可以在本发明的方法中采用多种浓度，并且部分地使用本文提供的指导，将能够调整和测试任何浓度值，以便找到在指定情形中实现所需结果的值。在另一些实施方案中，本发明化合物(如，式(I))可以与一种或多种用于指定疾病、状况、或失调的其它治疗剂联合用药。
在一些实施方案中，组合物可包含单位剂量的一种或多种本发明化合物(如，式(I))与药学上可接受的载体组合，并且另外可包含其它药用剂(medicinal agents)，制药剂(pharmaceutical agents)，载体(carriers)，佐剂(adjuvants)，稀释剂和赋形剂。在一些实施方案中，载体，媒介物或赋形剂可促进组合物的给药，递送和/或改善组合物的保存。在另一些实施方案中，一种或多种载体包括但不限于，盐溶液如生理盐水，林格氏溶液，PBS(磷酸盐缓冲盐水)，以及各种盐(包括钾盐和磷酸盐)的混合物(含或不含糖添加剂(例如葡萄糖))。载体可以包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，杀菌抗生素，以及使该配制剂与预期接受者的体液等渗的溶质；以及，水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。在另一些实施方案中，一种或多种赋形剂可以包括但不限于水，盐水，葡聚糖，甘油，乙醇，等等，以及它们的组合。无毒辅助物质，如润湿剂，缓冲剂或乳化剂也可加入所述组合物中。口服制剂可以包括通常使用的赋形剂，例如制药级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁。
给药途径和疾病治疗
本发明的化合物(如，式(I)，I-1或I-2)可以通过许多合适的给药途径或制剂给予动物。本发明的化合物(如，式(I)，I-1或I-2)也可用于治疗动物各种疾病。动物包括但不限于哺乳动物，灵长类动物，猴子(如，猕猴(macaque)，恒河猴(rhesus macaque)或猪尾猕猴(pig tail macaque))，人类，犬科动物，猫科动物，牛科动物，猪科动物，禽类(如鸡)，小鼠，兔子和大鼠。如本文所用，术语“受试者”是指人类和动物受试者。
本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)的给药途径可以是任何合适的途径。给药途径可以是但不限于口服途径，肠胃外途径，皮肤途径，鼻腔途径，直肠途径，阴道途径，和眼部途径。在另一些实施方案中，给药途径可以是胃肠外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。给药途径的选择可以取决于化合物的特性(如化合物的物理和化学性质)以及动物的年龄和体重，具体的疾病(如癌症)，和疾病的严重程度(如癌症的阶段或严重程度)。当然，根据需要可以给药多种给药途径的组合。
本发明的一些实施方案包括向受试者提供含本文所述一种或多种本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)的组合物(如药物组合物)方法，其包括一次或多次给药一种或多种这样的组合物；如果存在多于一次的给药，组合物可以是相同的或不同的。
在动物(例如，哺乳动物，猪，犬，禽(如，鸡)，牛，猫科动物，灵长类动物，啮齿动物，猴，兔，小鼠，大鼠和人)中，可用本发明化合物(如，式(I)，I-1，或I-2)治疗的疾病包括但不限于癌症。
在一些实施方案中，能用本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)在动物(如哺乳动物，猪，犬，禽(如，鸡)，牛，猫科动物，灵长类动物，啮齿动物，猴，兔，小鼠，大鼠和人类)中治疗的癌症包括但不限于与RAS突变相关的癌症。在一些实施方案中，可以被治疗的癌症包括但不限于胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑色素瘤，黑素瘤致瘤)，膀胱癌，前列腺癌，恶性神经鞘瘤，多发性骨髓瘤，乳腺癌，鳞状细胞癌(如头颈部鳞状细胞癌)，淋巴瘤，白血病，骨髓癌，非霍奇金淋巴瘤(如弥漫性大B细胞淋巴瘤)，多形性成胶质细胞瘤，子宫内膜癌，肾癌，基底细胞癌，甲状腺癌，神经母细胞瘤，卵巢癌，肾细胞癌，肝细胞癌，结肠癌，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性淋巴细胞白血病，横纹肌肉瘤，脑膜瘤，胃癌，胶质瘤，口腔癌，鼻咽癌，直肠癌，胃癌，子宫癌，髓母细胞瘤，可导致转移的癌症，由转移导致的癌症，或它们的癌性肿瘤。在一些实施方案中，可以被治疗的癌症包括但不限于胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如皮肤恶性黑素瘤，黑素瘤生成)，膀胱癌，恶性神经鞘瘤，多发性骨髓瘤，乳腺癌癌症，鳞状细胞癌(如头颈部鳞状细胞癌)，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，可导致癌症(例如胰腺癌)，由转移导致的癌症(如肺癌)或癌性肿瘤。在一些实施方案中，可以被治疗的癌症包括但不限于胰腺癌(如胰腺癌导管腺癌)，肺癌，肝癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，或它们的癌性肿瘤。在一些实施方案中，可以被治疗的癌症包括但不限于胰腺癌(如胰腺导管腺癌)或其癌性肿瘤。可以被治疗的动物包括但不限于哺乳动物，啮齿动物，灵长类动物，猴子(如，猕猴，恒河猴，猪尾猕猴)，人类，犬科动物，猫科动物，猪科动物，禽类(如，鸡)，牛，小鼠，兔子，以及大鼠。如本文所用，术语“受试者”是指人类和动物受试者。在一些情况下，所述动物(例如，通过显示疾病或癌症的迹象，或通过患有癌性肿瘤)需要所述治疗。
在一些实施方案中，能用本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)在动物(如哺乳动物，猪，犬，禽(如，鸡)，牛，猫科动物，灵长类动物，啮齿动物，猴，兔，小鼠，大鼠和人类)中治疗的癌症包括但不限于，可通过对RalGEF家族成员(例如RalGDS或RGL2)进行抑制(如降低其活性或表达)，通过抑制RalGDS，通过抑制RGL2，或它们的组合来治疗的癌症。在一些实施方案中，可以在动物中治疗的癌症包括可以通过抑制RalGDS和RGL2两者来进行治疗的癌症。
如本文所用，术语“治疗(treating,treatment)”采用最宽泛的含义。具体而言，术语“治疗”并不一定意味着动物被治疗直到完全康复。因此，“治疗”包括改善症状，减轻症状或与病症相关的影响，减轻病症的严重程度，或预防、预防性改善症状，或者以其他方式降低发生指定病症的风险。如本文所用，“治疗”动物包括但不限于预防性治疗和治疗性治疗(therapeutic treatment)。本文所述的任何组合物(如药物组合物)可以用于治疗动物。
关于治疗癌症(如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如皮肤恶性黑素瘤，黑素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，或其癌性肿瘤)，治疗可以包括但不限于预防性治疗和治疗性治疗。因此，治疗可包括但不限于：预防癌症(如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑素瘤，黑色素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，或其癌性肿瘤)；减小患癌风险，所述癌例如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑色素瘤，黑色素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，或其癌性肿瘤)；改善或缓解癌的症状，所述癌如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如皮肤恶性黑色素瘤，黑色素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤或其癌性肿瘤；激发机体抵抗癌症如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如皮肤恶性黑色素瘤，黑色素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤或其癌性肿瘤；抑制癌症的发生或进展，所述癌如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如皮肤恶性黑色素瘤，黑色素致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤或其癌性肿瘤；抑制或预防与癌有关的症状的出现，所述癌例如，胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑色素瘤，黑素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤或其癌性肿瘤；减轻癌的严重性，所述癌如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如皮肤恶性黑素瘤，黑色素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，或其癌性肿瘤；引起癌或与癌症相关的一种或多种症状的消退(如肿瘤体积缩小)，所述癌例如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑素瘤，黑素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤或其癌性肿瘤；引起癌缓解(remission)，所述癌例如，胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结肠直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑色素瘤，黑素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤或其癌性肿瘤；或预防癌复发，所述癌如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑色素瘤，黑色素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，或其癌性肿瘤。在一些实施方案中，治疗不包括癌的预防性治疗(如，预防或改善将来的癌症)。
动物的治疗可以用任何合适的给药方法(例如本文公开的那些)和用任何合适量的本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)来进行。在一些实施方案中，治疗方法包括治疗动物癌症(如胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑素瘤，黑素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤或其癌性肿瘤)。本发明的一些实施方案包括用包含本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)的组合物(如，药物组合物)治疗受试者(如动物如人或灵长类动物)的方法，其包括一次或多次给药一种或多种这样的组合物；如果存在多于一次的给药，组合物可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中，治疗方法包括给药有效量的包含本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)的组合物。如本文所用，术语“有效量”是指足以影响在动物中的治疗的一个或一系列剂量(如，治疗癌症，例如但不限于胰腺癌(如胰腺导管腺癌)，肺癌，肝癌，结直肠癌(如结肠癌或直肠癌)，黑素瘤(如，皮肤恶性黑素瘤，黑素瘤致瘤)，膀胱癌，卵巢癌，前列腺癌，髓母细胞瘤，或它们的癌性肿瘤)。在一些实施方案中，有效量可以涵盖治疗有效量，如本文所公开的。在一些实施方案中，有效量可以根据受试者和所涉具体治疗而不同。所需的确切量可以例如根据受试者的不同而不同，取决于受试者的年龄和一般状况，所用的特定佐剂(如果有)，给药方案等。这样，有效量可以例如根据具体情况而不同，并且可以在具体情况下确定适当的有效量。有效量可以例如包括本文公开的任何剂量或组合物量。在一些实施方案中，至少一种本发明化合物(如，式(I)，诸如但不限于化合物I-1或I-2)的有效量(能给予诸如哺乳动物、灵长类、猴或人等动物的量)可以是约0.005至约50mg/kg体重，约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10mg/kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.005mg/kg，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约0.5mg/kg，约1mg/kg，约3mg/kg，约5mg/kg，约5.5mg/kg，约6mg/kg，约6.5mg/kg，约7mg/kg，约7.5mg/kg，约8mg/kg，约10mg/kg，约12mg/kg，或约15mg/kg。在一些实施方案中，所述剂量可以是约0.5mg/kg人的体重或约6.5mg/kg人的体重。在一些例子中，至少一种本发明化合物(如，式(I)，诸如但不限于化合物I-1或I-2)的有效量(能给予诸如哺乳动物、啮齿类、鼠类、兔、猫科、猪科、或犬科等动物的量)可以是约0.005至约50mg/kg体重，约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10mg/kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.005mg/kg，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约1mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约20mg/kg，约30mg/kg，约40mg/kg，约50mg/kg，约80mg/kg，约100mg/kg，或约150mg/kg。在一些实施方案中，至少一种本发明化合物(如，式(I)，诸如但不限于化合物I-1或I-2)的有效量(能给予诸如哺乳动物、灵长类、猴或人等动物的量)可以是约1至约1000mg/kg体重，约5至约500mg/kg体重，约10至约200mg/kg体重，约25至约100mg/kg体重，约1mg/kg，约2mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约25mg/kg，约50mg/kg，约100mg/kg，约150mg/kg，约200mg/kg，约300mg/kg，约400mg/kg，约500mg/kg，约600mg/kg，约700mg/kg，约800mg/kg，约900mg/kg，或约1000mg/kg。在一些实施方案中，所述剂量可以是约20mg/kg人的体重或约100mg/kg人的体重。在一些例子中，至少一种本发明化合物(如，式(I)，诸如但不限于化合物I-1或I-2)的有效量(能给予诸如哺乳动物、啮齿类、鼠类、兔、猫科、猪科、或犬科等动物的量)可以是约1至约1000mg/kg体重，约5至约500mg/kg体重，约10至约200mg/kg体重，约25至约100mg/kg体重，约1mg/kg，约2mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约25mg/kg，约50mg/kg，约100mg/kg，约150mg/kg，约200mg/kg，约300mg/kg，约400mg/kg，约500mg/kg，约600mg/kg，约700mg/kg，约800mg/kg，约900mg/kg，或约1000mg/kg。
“治疗有效量”意指有效实现期望和/或有益效果(如减小肿瘤尺寸)的量。治疗有效量可以在一次或多次给药中给予。为了本发明的一些目的，治疗有效量是适于治疗适应症(如，治疗癌症)的量。治疗适应症意味着实现任何期望的效果，所述效果例如以下一项或多项：减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟疾病(如癌症)进展，提高生活质量，或延长寿命。这种实现可以通过任何合适的方法来测量，例如但不限于测量肿瘤大小。
在一些实施方案中，治疗还可以包括手术干预，化疗，放疗，激素疗法，免疫疗法，和辅助系统疗法中的一种或多种。辅助可包括但不限于化疗(如替莫唑胺)，放疗，抗血管生成疗法(如贝伐单抗)，和激素疗法，如给药LHRH激动剂；抗雌激素药，如他莫昔芬；高剂量孕激素；芳香酶抑制剂；和/或肾上腺切除术。化疗可以用作单一手段或与已知或新疗法的组合。
在一些实施方案中，至少一种本发明化合物(如，式(I)，I-1或I-2)的给药是辅助性癌症治疗或该治疗的一部分。辅助治疗包括经本文公开的和属于本文所述癌症(包括但不限于肿瘤)的机理来进行治疗。相应的主要疗法可以包括但不限于手术，化疗或放疗。在一些例子中，辅助治疗可以是趋化因子受体拮抗剂与传统化学毒剂组合，或与增加对该癌症的治疗特异性、并潜在地限制额外的全身副作用的免疫疗法组合。在还有一些实施方案中，本发明的化合物(如，式(I)，I-1或I-2)可以用作其他化疗剂的辅助。在一些情况下，使用本发明的化合物(如，式(I)，I-1或I-2)可以减少药物和药物组合的用药持续时间，从而减少副作用。
在一些实施方案中，本文公开的治疗可以包括使用其他的药物(如抗生素)或治病疗法。例如，抗生素可用于治疗感染，并且可以与本发明的化合物组合用于治疗疾病(如，与癌症相关的感染)。在另一些实施方案中，可以将静脉内免疫球蛋白(IVIG)疗法用作治疗方案的一个组成部分(即，除了给药本发明的化合物之外)。
制备式(I)化合物的方法
本发明的一些实施方案包括制备式(I)化合物的方法。式(I)化合物可以用任何合适的方法制备，或者如果买得到则可以购买。在一些实施方案中，式(I)化合物的制备可以包括如下步骤，使式(II)化合物与式(III)化合物反应，得到式(IV)，再制得式(I)(如，用一或多步合成步骤)。
在一些实施方案中R11可以是卤素基团(如，F，Cl，Br，或I)或-CH2-卤素基团。在另一些实施方案中，R11可以是Cl或-CH2Cl。在还有一些实施方案中，R11可以是-CH2-卤素基团，-CH2Br，或-CH2Cl。而且，式(II)，式(III)，和式(IV)的R5，X，环A都与式(I)中指定的一样。式(II)可以用任何合适的方法制备，或者如果买得到则可以购买。式(III)可以用任何合适的方法制备，或者如果买得到则可以购买。
在一些实施方案中，式(II)可以与式(III)在下列条件下反应：可以将式(II)和式(III)置于含有溶剂(如，DMF)的混合物中。该混合物可以在指定温度(如，约120℃)加热(如，用微波炉)一段时间(如，约2小时)。然后，可选回收式(IV)。
在一些实施方案中，将式(III)(如，约1.3mL或约1.34g或约8.86mmol)加入式(II)(如，约718mg或约3.69mmol)的约6mL(如，从约1mL至约20mL)DMF(或任何合适溶剂)溶液中。所得溶液在约120℃(或从约90℃至约150℃)的加热条件(如，微波辐射)下搅拌约2小时(或从约0.5小时至约10小时)。冷却至室温后，可将化合物倾入约100mL(或从约20mL至约500ml)水中。将此含水化合物静置约5分钟(或从约1分钟至约25分钟)，然后用约75mL份(或从约10mL至约500mL)的乙酸乙酯(或任何合适溶剂)萃取3次(或从1至10次)。再将混合的有机层洗涤(如，用盐水)，干燥(如，用Na2SO4)和浓缩(如，真空)。粗产物可以溶于小量乙酸乙酯(或任何合适溶剂)，然后沉淀(如，通过滴加己烷(或任何合适溶剂))，以提供式(IV)。
式(IV)和式(V)的R5，X，环A都与式(I)中指定的一样。式(IV)可以用任何合适的方法制备(如上述)，或者如果买得到则可以购买。
在一些实施方案中，式(IV)可以在下列条件下生成式(V)：可以将式(IV)与POCl3(或任何适合将式(IV)的氧代基转换成Cl或其他卤素基团的化合物)混合，在指定温度(如，约90℃)加热(如，用微波)指定时间(如，约3小时)。然后可选回收式(V)。
在约3mL(或从约0.5mL至约20mL)POCl3(或任何适合将式(IV)的氧代基转换成Cl或其他卤素基团的化合物，如POBr3)中的式(IV)(如，约309mg或约0.971mmol)于约90℃(或从约30℃至约150℃)加热(如，微波辐射)搅拌约3小时(或从约0.5小时至约20小时)。冷却(如至室温)后，可除去溶剂(如，在减压条件下)。剩余物可以用约10mL(或从约2mL至约50mL)含约2g(或从约0.5g至约10g)合适的盐(如，碳酸钾)的水(如，冷水)稀释。静置约5分钟(或从约0.5分钟至约50分钟)后，可以用约10mL(或从约1mL至约100mL)任何合适溶剂(如，乙酸乙酯)对该水溶液萃取两次(或一次或最多10次)。混合有机层可以干燥(如，用Na2SO4)并浓缩(如，真空)。然后对浓缩物进行层析(如，上硅胶柱(Combiflash，4g柱，0-70％，己烷–乙酸乙酯，10分钟))，以生成式(V)。
式(V)和式(VI)的R1，R2，R3，R4，R5，X和环A都与式(I)中指定的一样。式(V)可以用任何合适的方法制备(如上述)，或者如果买得到则可以购买。式(VI)可以用任何合适的方法制备，或者如果买得到则可以购买。
在一些实施方案中,式(V)可以与式(VI)在下列条件下反应，生成式(I)：可以将式(V)和式(VI)混合，在指定温度(如，约100℃)加热(如，用微波)指定时间(如，约15小时)。然后可选回收式(I)。
可以将式(V)(如，约208mg或约0.636mmol)在约20mL(或从约1mL至约200mL)四氢呋喃(或任何合适溶剂)中的溶液加入式(VI)(如，约0.11mL或约113mg或约0.827mmol)中，以及加入三甲胺(或任何合适溶剂)(如，约0.44mL或约321mg或约3.18mmol)中。所得溶液可以在约100℃(或从约40℃至约300℃)加热(如，微波辐射)搅拌约15小时(或约2小时至约100小时)，然后可以冷却(如，至室温)。然后可将该混合物用约20mL(或从约2mL至约200mL)任何合适溶剂(如，乙酸乙酯)稀释，再用水洗(如，洗1，2，3，4，或5次)。有机相可以干燥(如，用Na2SO4)并浓缩(如，真空)。剩余物可以再进行层析(如，上硅胶柱(Combiflash，4g柱，0–100％，己烷–乙酸乙酯，11分钟))，以生成式(I)。
在一些实施方案中，可以回收式(I)(或上述任何其他化学式)。回收可以使用任何合适的方法，包括但不限于HPLC(如反相)，LC，沉淀，离心，柱层析(如尺寸排阻层析或离子交换层析)，使用硅胶，或其组合。
在一些实施方案中，制备式(I)化合物的方法可包括一个或多个上述步骤。在一些实施方案中，制备式(I)化合物的方法包括：
(a)使式(II)化合物与式(III)化合物反应，得到包含式(IV)化合物的混合物；
(b)使式(IV)化合物与合适的化合物(如POCl3或POBr3)反应，以将氧代基转化为卤素基团(如F，Cl，Br或I)，以产生包含式(Ⅴ)化合物的混合物；
(c)使式(V)化合物与式(VI)化合物反应；和
(d)回收式(I)。
本文公开的主题通过以下具体但非限制性的实例进一步说明。以下实例可包括数据汇编，其代表了与本发明相关的开发和实验过程中各个时间收集的数据。
实施例
A组实施例–合成方法和化合物鉴定
化合物I-1购自Molplex(Newcastle upon Tyne，UK)。
化合物I-2按以下方案合成，这是一例关于式(I)分子能怎样合成的实例。
所述合成始于商购的2-(氯甲基)-4(3H)-喹唑啉酮(A)与仲胺B反应。所得的喹唑啉酮C用磷酰氯处理，提供氯喹唑啉D。随后用3-甲氧基苄基胺(E)进行芳香取代，得到化合物I-2。
合成2-(((3-甲氧基苄基)(甲基)氨基)甲基)喹唑啉-4(3H)-酮(C)。向718mg(3.69mmol)2-(氯甲基)-4(3H)-喹唑啉酮(A)在6mL DMF中的溶液中加入1.3mL(1.34g，8.86mmol)1-(3-甲氧基苯基)-N-甲基甲胺(B)。在微波辐射下，将所得溶液在120℃搅拌2小时。冷却至室温后，将混合物倒入100mL水中。含水混合物静置5分钟，然后用75毫升乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。将粗产物溶解在极少量的乙酸乙酯中，滴加己烷进行沉淀，得到629mg(55％)C，为浅橙色固体：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.95(s，1H)，8.12(d，J＝8.0Hz，1H)，7.80(td，J＝7.4，1.2Hz，1H)，7.65(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(t，J＝7.6Hz，1H)，7.23(t，J＝8.0Hz，1H)，7.01(s，1H)，6.95(d，J＝7.6Hz，1H)，6.81(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，3.75(s，3H)，3.61(s，2H)，3.56(s，2H)，2.19(s，3H)；13C NMR(100.5MHz，DMSO-d6)δ161.6，159.2，154.7，148.4，139.9，134.3，129.1，127.0，126.4，125.8，121.3，121.1，114.5，112.5，60.8，59.8，54.9，41.5；ESI-HRMS m/z:[M+H]+计算值：C18H19N3O2 310.1550，实测值：310.1462。
合成1-(4-氯喹唑啉-2-基)-N-(3-甲氧基苄基)-N-甲基甲胺(D)。将309mg(0.971mmol)喹唑啉酮C在3mL POCl3中的溶液在微波辐射下于90℃搅拌3小时。冷却至室温后，减压下小心除去溶剂。将残余物用10mL含有2g碳酸钾的冷水缓慢稀释。静置5分钟后，将该含水溶液用10mL乙基乙酸酯萃取两次。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并真空浓缩。粗产物经硅胶(Combiflash，4g柱，0-70％，己烷-乙酸乙酯，10分钟)层析分离，得到222mg(70％)D，为黄色油状物:1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.25(dd，J＝8.4，0.8Hz，1H)，8.09(d，J＝8.0Hz，1H)，7.94(dd，J＝7.2，1.6Hz，1H)，7.69(dd，J＝7.2，1.2Hz，1H)，7.21(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04(s，1H)，6.98(d，J＝7.6Hz，1H)，6.78(dd，J＝7.8，2.2Hz，1H)，3.99(s，2H)，3.82(s，3H)，3.73(s，2H)，2.44(s，3H)；13C NMR(100.5MHz，CDCl3)δ163.6，162.5，159.6，151.3，140.0，134.8，129.1，128.6，128.4，125.7，122.4，121.6，114.3，113.0，63.2，61.8，55.2，42.9；ESI-HRMS m/z:[M+H]+计算值：C18H18ClN3O 328.1211，实测值：328.1203。
合成N-(3-甲氧基苄基)-2-(((3-甲氧基苄基)(甲基)氨基)甲基)喹唑啉-4-胺(化合物I-2)。向208mg(0.636mmol)氯喹唑啉D在20ml四氢呋喃中的溶液中加入0.11ml(113mg，0.827mmol)3-甲氧基苄基胺(E)和0.44ml(321mg，3.18mmol)三甲基胺。所得溶液在微波辐射下于100℃搅拌15小时，然后冷却至室温。混合物用20mL乙酸乙酯稀释，然后用水洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)并真空浓缩。将残余物经硅胶(Combiflash，4g柱，0-100％，己烷-乙酸乙酯，11分钟)层析分离，得到230mg(84％)化合物I-2，呈橙色油状：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.89(d，J＝8.4Hz，1H)，7.71(dd，J＝8.4，1.2Hz，1H)，7.67(d，J＝8.0Hz，1H)，7.41(dd，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.29(t，J＝8.0Hz，1H)，7.19(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04(s，1H)，7.00(s，1H)，6.99(s，1H)，6.96(s，1H)，6.84(dd，J＝8.4，2.8Hz，1H)，6.77(dd，J＝8.4，2.8Hz，1H)，5.90(s，1H)，4.89(d，J＝5.6Hz，2H)，3.84(s，2H)，3.77(s，6H)，3.74(s，2H)，2.41(s，3H)；13C NMR(100.5MHz，CDCl3)δ164.2，159.9，159.5，159.3，150.1，140.9，140.1，132.4，129.8，128.9，128.6，125.5，121.6，120.3(2C)，114.4，113.8，113.4，112.9，112.6，64.1，61.7，55.2(2C)，45.3，42.7；ESI-HRMS m/z:[M+H]+计算值：C26H28N4O2 429.2285，实测值：429.2286。
B组实施例-生物学鉴定
抑制软琼脂生长：
图1:一些式(Ⅰ)化合物对RalGEF抑制剂抑制2D中胰腺癌细胞系软琼脂生长和正常生长的影响。在图1A和1B中，含突变型Ras的胰腺肿瘤细胞系Panc-1(CRL-1469TM)和MiaPaCa-2(CRL-1420TM)铺在有10μM或0.9μM化合物I-1的软琼脂中，对集落形成进行评分。在图1C和1D中，测试了化合物I-1在塑料上的正常2D生长条件下抑制相同细胞系的细胞生长的能力。0＝载体。细胞以相同的密度接种并在培养两周后进行评分。
化合物I-1在低μM或亚μM水平下体外阻断Panc1和Mia PaCa-2的致瘤性表型(图1A和1B)。化合物I-1还体外阻断下列Ras驱动型肿瘤细胞系的致瘤性表型(数据未显示)：Caov-3[Caov3](HTB-75TM)(卵巢癌)；D283Med(HTB-185TM)(髓母细胞瘤)；A549(CCL-185TM)(肺癌)；和LNCaP克隆FGC(CRL-1740TM)(前列腺癌)。
人胰腺肿瘤细胞系MiaPaca-2和Panc-1含有活化的K-Ras，用于初始筛选以鉴定化合物I-1。软琼脂集落形成仍然是一个预测致瘤性的成熟的体外试验，用它预测化合物I-1的致瘤性。定量分析表明，10μM化合物I-1几乎完全阻断了所述细胞在软琼脂中生长的能力(图1A和1B)。效价实验显示，化合物I-1的IC 50(即，抑制50％集落形成的浓度)小于约1μM(数据未显示)。
在两个实验中，用软琼脂集落形成体外测定法，针对Mia Paca-2细胞系测试了几种其他化合物。两个实验的结果显示在表2和3中。对于每个表，用DMSO作为对照，并因此在每个表中，将DMSO集落作为量度，每个测量值都与它进行比较。
表2
表3
不受理论的限制，RalGEFs作为靶标的优点之一是它们的活化可以导致转化，但它们的活化不影响正常生长(如在平板附着的2D培养物中)。因此，根据这一理论，RalGEF抑制剂应阻断琼脂生长，但对正常2D生长几乎没有影响。
当我们针对在2D中生长的相同细胞系测定化合物I-1时，我们在1周的过程中未检测到生长的减少(图1C和1D)。化合物I-2与化合物I-1具有类似的效果(数据未显示)。
RalGEFS在胰腺癌细胞转化中:图2:抑制多重RalGEFs有时对胰腺癌细胞的琼脂生长有协同抑制作用。我们鉴定了一种对RalGDS有效的shRNA，并制备了一对稳定匹配的MiaPaCa-2细胞系(图2A)。然后，我们用经过验证的针对RGL2的siRNA(Invitrogen)瞬时转染所述匹配的细胞对。然后测量4组细胞系统的软琼脂生长抑制。未观察到对2D培养物中正常细胞生长的影响(数据未显示)。
MiaPaCa-2细胞仅表达RalGDS和RGL2GEF家族成员。对RGL2的稳定的shRNA抑制作用抑制了所述细胞在软琼脂中生长和在小鼠中形成肿瘤的能力。我们现已生成了用抗RalGDS shRNA稳定转染的Mia-PaCa2细胞，其中的RalGDS已被部分地敲低(图2A)。然后，我们用预先验证的抗RGL2siRNA瞬时转染所述匹配的+/-shRNA-RalGDS，以模拟泛-RalGEF抑制剂的效果。图2B显示，单一的RalGEF敲低抑制了集落形成，但遏制全部两种RalGEF具有比加和效果更大的效果。因此，对多个RalGEFs的作用进行阻断有时可比阻断单个RalGEF更为有效。因此，能起到泛-RalGEF抑制剂作用的小分子可以是有效的。
Ras/RalGEF结合的抑制-图3。一些式(I)化合物可以是泛-RalGEF抑制剂，如通过阻断K-Ras与RalGDS和与RGL2的相互作用所示。在一些化合物存在下，HEK-293细胞用HA激活的K-Ras和GFP-RalGDS(图3A)或RGL2(图3B)共转染。将这些细胞裂解。将待测化合物加入到裂解物中至终浓度为10μM，然后将其与抗GFP-珠一起温育过夜。然后通过免疫印迹(IB)分析免疫沉淀物(IP)中Ras的存在。图3A是原始数据的一个例子。图3B显示用化合物I-1和I-2对RGL2数据进行定量。
化合物I-1干扰Ras与RalGEFs的相互作用。在存在或不存在化合物I-1的情况下，HEK-293细胞用人流感病毒血凝素(HA)标记的K-Ras 12v和GFP-标记的RalGDS或GFP-标记的RGL2共转染。裂解细胞并通过免疫沉淀(IP)然后通过免疫印迹(IB)确定每个样品中Ras/RalGEF相互作用的程度。化合物I-1(但不是载体)抑制Ras和RalGDS的稳定结合(图3A)。为了确定化合物I-1是否也抑制第二种RalGEF(RGL2)，我们使用RGL2进行类似的实验。图3B显示化合物I-1也抑制RGL2。因此，化合物I-1看来发挥了泛-RalGEF抑制剂的作用。化合物I-2也使用该测定法来测试；结果发现它也抑制RGL2(图3B)。
内源性Ras/RalGEF信号传导的特异性抑制。图4。一些式(I)化合物对Ral活化的特异性抑制。在存在或不存在抑制剂(10μM)的情况下，使用Cell Biolabs(SanDiego CA)试剂盒，测定具有内源性超活化Ras的细胞的内源性Ral活化。将化合物I-1溶于DMSO中；DMSO作为载体阴性对照。IP是免疫沉淀。IB是免疫印迹。然后细胞裂解物用磷酸化ERK抗体测定MAPK途径活化的水平。他们是一样的。肌动蛋白是上样对照。
RalGEFs驱动Ral成为活化的GTP结合形式，因此它可以结合其效应子RalBP1。未活化的结合了GDP的Ral不结合RalBP1。来自几个供应商的市售试剂盒使用附着于珠子的RalBP1作为特异于Ral活性形式的亲和试剂。通过测量活化的Ral的水平并将其与Ral总水平进行比较，可以测量内源Ral活化作用的状态。我们测定含有内源性超活化Ras的未转染细胞，以了解化合物I-1处理对内源性活性Ral水平的影响。化合物I-1遏制内源活性Ral(GTP结合型)的水平(图4)。这种效应是特异性的，因为没有检测到对Ras/Raf/MAPK途径活化作用的抑制(如，磷酸化ERK的水平没有改变)。
一些式(I)化合物不具有体内毒性：对胰腺癌细胞的转基因敲出研究和shRNA实验显示，对Ras/RalGEF/Ral途径的遏制作用抑制了致瘤表型，但未严重妨碍正常细胞功能。在组织培养中，化合物I-1对正常细胞生长没有影响(图1)，化合物I-2也没有影响(数据未显示)。体内初步研究表明，25mg/kg化合物I-1的剂量在腹腔注射(ip)2周后对小鼠没有明显的有害作用(如，没有行为改变，也无体重减轻)(数据未显示)。
一些式(I)化合物在体内遏制Ral GTP水平-图5。NRG小鼠皮下接种Mia-PaCa2细胞异种移植物。用拉下测定试剂盒(目录号BK040，Cytoskeleton，Inc.，Denver Colarado)按说明书测定经载体处理的异种移植小鼠和经化合物I-1处理的小鼠的肺组织中活化的RalA的水平。来自经处理的异种移植动物的肺组织显示出活性RalA水平的降低。具体而言，图5显示，化合物I-1在体内看来是遏制肺组织中与GTP结合的活性Ral的水平。
一些式(I)化合物遏制胰腺癌细胞转移-图6。NRG小鼠皮下接种PBS(“无肿瘤细胞”)或5x106Ras驱动的Mia-PaCa-2细胞。使小鼠恢复1周，然后每隔一天用PBS/DMSO载体或10mg/kg化合物I-1注射(ip)2周。一周后，对小鼠进行原发肿瘤生长和肺转移评分。对皮下异种移植物来源的原发性肿瘤(血管化程度低，有时不能很好地吸收药物)的影响并不明显。但是，转移受到抑制，如图6A所示。量化如图6B所示。
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