用于治疗细胞内细菌感染的组合物的制作方法

方法

本发明涉及一种使用光化学内化方法引入抗菌剂来杀死细菌的治疗细胞内细菌感染的方法。该方法在治疗难以治疗的感染(例如在与生物材料相关的感染中发生的那些感染)方面具有特殊的效用。

细菌性病原体(例如结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus))的细胞内存活是引起许多感染性疾病的一个臭名昭著的原因(abed&couvreur,2014,int.j.antimicrob.ag.,43(6),p485-496；xiongetal.,2014,adv.drugdeliver.rev.,7,p63-76；brionesetal.,2008,j.controlrelease,125(3),p210-227)。例如，金黄色葡萄球菌(s.aureus)可引起多种皮肤或组织感染以及危及生命的侵入性疾病，例如菌血症、与生物材料相关的感染、糖尿病足感染、心内膜炎和骨髓炎(lew&waldvogel,2004,lancet,364(9431),p369-379；busscheretal.,2012,sci.transl.med.,4(153)；voneiffetal.，2002，lancetinfect.dis.,2(11),

p677-685；lipskyetal.,2004,clin.infect.dis.,39(7),p885-910；saginur&suh,2008,int.j.antimicrob.agents.,32suppl1,s21-25；dhawanetal.,1998,infect.immun.,66(7),

p3476-3479)。

一些体外、体内和临床研究提供了证据，证明巨噬细胞和中性粒细胞可能成为金黄色葡萄球菌生存和逃避宿主免疫防御的微环境(niches)(prajsnaretal.,2008,cellmicrobiol.,10(11),p2312-2325；tanetal.,2013,int.forumallergyrh.,3(4),p261-266；surewaardetal.,2016,j.exp.med.,213(7),p1141-1151；和seraletal.,2003,antimicrobialagentsandchemotherapy,47(7),p2283-2292)。此外，在某些情况下，例如在植入医疗装置后，即使通常具有低致病性的共生表皮葡萄球菌也可以在巨噬细胞内持续存在并在健康细胞和未感染的组织中定植(riooletal.,2014,actabiomater.,10(12),p5202-5212；broekhuizenetal.,2008,crit.caremed.,36(8),p2395-2402；broekhuizenetal.,2010,infect.immun.,78(3),p954-962；andzaatetal.,2010,futuremicrobiol.,5(8),p1149-1151)。因此，这些金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌或其他细菌物种的细胞内贮存可能引起与细胞内感染相关的疾病的发生或复发。

此外，已知某些细菌残留在吞噬体中并阻止这些吞噬体与溶酶体融合。采取这种策略的细菌的例子包括结核分枝杆菌(破坏性和广泛传播的结核病的原因)和伯纳特氏柯克斯氏体(coxiellaburnetti)(q热的原因)。

细胞内感染通常很难治疗，因为大多数现有抗生素的细胞内活性有限(abed&couvreur,2014supra；xiongetal.,2014,supra；brionesetal.,2008,supra；tulkens,1991,eur.j.clin.microbiol.,10(2),p100-106andcarrynetal.,2003,infect.dis.clin.n.am.,17(3),p615-634)。β-内酰胺类抗生素和氨基糖苷类对真核细胞的渗透性很低(abed&couvreur,2014,supra；tulkens,1991,supra；carrynetal.,2003,supra；seraletal.,2003,j.antimicrob.chemoth.,51(5),p1167-1173；和carrynetal.,2002,antimicrob.agentsch.,46(7),p2095-2103)，尽管氟喹诺酮类和大环内酯类可以穿过真核细胞膜，但它们表现出低的细胞内滞留性(seraletal.,2003,supra；andseraletal.,2003,antimicrob.agentsch.,47(3),p1047-1051)。利福平具有良好的细胞内穿透能力，但在用作单一抗生素时耐药发生的频率非常高。因此利福平与其他抗生素的联合治疗是强制性的(forrest&tamura,2010,clin.microbiol.rev.,23(1),p14-34)。然而，即使这样的联合疗法也可能无法消除细胞内感染(burns,2006,scand.j.infect.dis.,38(2),p133-136)。细胞内病原体也可能对某些抗生素产生耐药性，因为低细胞内浓度为敏感性降低的细菌细胞提供了选择性条件(baharogluetal.,2013,plosgenet.,9(4),e1003421)。

已经开发了几种基于脂质体、聚合物微/纳米颗粒和生物载体的递送系统，以用于细胞内活性差的不同抗生素(abed&couvreur,2014,supra；xiongetal.,2014,supra；leharetal.,2015,nature,527(7578),p323-328；randhawaetal.,2016,appl.microbiol.biotechnol.,100(9),p4073-4083；andbrezdenetal.,2016,j.am.chem.soc.,138(34),p10945-10949)。但是，这种系统和抗生素偶联物的开发非常复杂。

作为一种对抗多重耐药细菌的潜在策略，抗菌光动力疗法(photodynamictherapy,pdt)已用于局部感染，例如感染的皮肤伤口(maischetal.,2004,photoch.photobio.sci.,3(10),p907-917；andliuetal.,2015,j.clin.transl.research,1(3),p140-167)。

pdt疗法是基于光敏剂(photosensitiveagent、photosensitizer，ps)与光组合的应用。ps可以积聚在细菌的细胞质(cytoplasmic)膜中，并在照射治疗位点后通过诱导的反应性氧反应活性地杀死它们。然而，只有直接靠近光敏剂的细菌被杀死。

因此，迫切需要用于杀死细胞内细菌的新型抗生素和/或新技术。

本发明提供了用于杀死细胞内细菌的新方法，该方法涉及光化学内化(photochemicalinternalization，pci)和抗菌剂的使用。pci是为了允许分子的内化而开发的，例如用于治疗几种类型的肿瘤(selboetal.,2010,j.control.release,148(1),p2-12；和a,etal.,2004,adv.drugdeliver.rev.,56(1),p95-115)。在pci中，光敏剂特异性定位于内吞囊泡(endocyticvesicle)的膜中，并在照射后(部分地)破坏这些膜，从而导致分子的胞质溶胶释放(cytosolicrelease)。

令人惊讶地是，现已发现，抗菌剂的pci提供了一种用于杀死细胞内细菌的简单机制。

pci方法提供了一种机制，该机制用于将分子以一种不会导致广泛的细胞破坏或细胞死亡的方式(如果将方法学适当地调整以避免产生过量的有毒物种，例如通过减少照射时间或光敏剂剂量)引入细胞的胞质溶胶(cytosol)中。在wo96/07432和wo00/54802中描述了光化学内化(pci)的基本方法，wo96/07432和wo00/54802通过引用并入本文。在这种方法中，使待内化的分子(在本发明中为抗菌剂)和光敏剂与细胞接触。光敏剂和待内化的分子被摄取到细胞内被细胞膜包含的亚区室中，即它们被内吞到细胞内囊泡(例如溶酶体或核内体)中。当细胞暴露于适当波长的光时，光敏剂被激活，其直接或间接地产生破坏细胞内囊泡的膜的活性氧类。这使得内化的分子被释放到胞质溶胶中。已经发现，在这种方法中，大多数细胞的功能或生存力没有受到有害的影响。

由于本发明的方法不是一种复杂的方法，并且可以与多种抗菌剂和不同的靶细菌一起使用，因此它是特别有利的。它还允许所使用的抗菌剂浓度比常规方法所需的抗菌剂浓度低，同时实现有效的抗菌效果。这阻止了耐药性的发展。此外，可以控制照射的时间和位置以释放分子，使得其仅在期望的时间和位置释放以实现所需的效果。这样，使细胞对各种组分的暴露最小化，并且使不期望的副作用最小化。这与用于抗菌治疗的标准技术相反，在标准技术中，不可能控制各种组分释放的时间和位置，并且需要高浓度的各种组分和/或其载体。

与细菌病原体的细胞内存活相关的感染性疾病可以在人体的不同位点(例如皮肤、深层组织、泌尿道和肺)发生或复发。除专业吞噬细胞外，非专业吞噬细胞(例如上皮细胞、内皮细胞、成骨细胞和成纤维细胞)也可以是细胞内细菌的微环境。本发明的pci方法可以通过在感染位点或在其中驻留细胞内细菌的细胞的位置施加光来在特定位置实现。以这种方式，该方法可以用于治疗(皮下)皮肤或粘膜感染/损伤，例如慢性伤口、溃疡、脓肿和糖尿病足感染，以及口腔和鼻腔感染，例如慢性鼻窦炎和牙周炎，在这些位置光较容易到达感染位点。可以使用例如由光纤装置施用的光来治疗内部器官(例如，肺)或深部组织区域中的感染。

如本文实施例中所述，在小鼠巨噬细胞中体外评估了和使用斑马鱼胚胎模型(适用于研究葡萄球菌感染的整个动物系统)体内评估了在使用和不使用pci的情况下抗菌剂对细胞内葡萄球菌的抗微生物功效(prajsnaretal.,2008,supra；venemanetal.,2013,bmcgenomics,14,p255；andprajsnaretal.,2012,cellmicrobiol.,14(10),p1600-1619)。据我们所知，这是首次教导在一个全新的应用领域中使用pci，即用于(细胞内)感染的抗生素治疗中使用pci。

尽管不希望受到理论的束缚，但抗菌剂的光化学内化(pci)以对抗细胞内细菌的可能机理，首先取决于抗菌剂和光敏剂(ps)以及任选的细菌的细胞摄取。在形成含抗菌剂的核内体/吞噬体的过程中，ps定位于囊泡膜中。抗菌剂通过ps的激活(通过照射后破坏核内体/吞噬体的膜)释放到胞质溶胶中，在胞质溶胶中它们可能与细菌(通过共内化作用或预先存在于细胞中)接触。在照射期间，ps也从膜上解离，并且可以重定位到可能含有抗菌剂和/或细菌的其他核内体/吞噬体上，从而导致那些核内体/吞噬体中的细菌/抗菌剂释放到胞质溶胶中。也有可能在pci期间，通过光敏剂的光激活而破裂的囊泡可能会与完整的其他囊泡进行细胞内融合，导致甚至在没有额外照射的情况下，完整的囊泡也会变得渗漏/破裂。抗菌剂与胞质溶胶中的细菌接触允许抗菌剂的细胞内抗菌作用发生。

因此，在第一方面，本发明提供了治疗或预防细胞内细菌感染的方法，该方法包括使被感染的一个或多个细胞与抗菌剂和光敏剂接触，并用有效激活光敏剂的波长的光照射所述一个或多个细胞，其中所述抗菌剂释放到所述一个或多个细胞的胞质溶胶中并杀死、破坏所述一个或多个细胞中的细菌或阻止细菌在所述一个或多个细胞中的复制。

该方法可以在体外进行，但是优选在体内进行，并且所述一个或多个细胞在受试者体内。

优选地，该方法(或本文所述的用途)防止细菌耐药性的发展。它们可用于耐抗菌药或耐抗生素的细菌。

在这种方法中，光敏剂和抗菌剂各自被摄取到细胞内囊泡中；并且当细胞被照射时，细胞内囊泡的膜被破坏，从而将分子释放到细胞的胞质溶胶中。

不同成分可以被摄取到相对于彼此相同或不同的细胞内囊泡中。已经发现，由光敏剂产生的活性物种可以蔓延出将其包含的囊泡和/或囊泡可以聚结，从而通过与破裂的囊泡聚结而释放出囊泡的内容物。如本文所指，“摄取”表示被摄取的分子完全包含在囊泡内。细胞内囊泡被膜包围，并且可以是在内吞/吞噬作用之后产生的任何这种囊泡，例如核内体、溶酶体或吞噬体。

如本文所用，“破裂的”区室是指永久或暂时破坏该区室的膜的完整性，足以允许将包含在其中的分子释放。

如本文所定义，“治疗”是指相对于治疗之前的症状，减轻、缓解或消除正在治疗的细菌感染的一种或多种症状。这些症状可能与存在于被治疗的细胞中和/或被治疗的患者或受试者中的细菌的丰度相关。体外方法中的治疗包括杀死、破坏一个或多个细胞中的细菌或防止细菌在一个或多个细胞中的复制，并且可以通过评估一个或多个细胞中活菌的丰度来确定。“防止”(或预防)是指延迟或预防细菌感染症状的发作。预防可能是绝对的(使得不会发生细菌感染)，或者可能仅在某些个体、细胞或有限的时间内有效。

如本文所指，“细菌感染”是指在该位点增殖的细菌侵入一个或多个细胞或身体组织，并可能导致该细胞或组织受损。“被感染”的细胞包含一种或多种能够在该细胞内存活并潜在复制的细胞内细菌。优选地，细菌感染是由下文所述的细菌引起的，优选地由选自分枝杆菌属(mycobacterium)、假单胞菌属(pseudomonas)、埃希氏菌属(escherichia)和葡萄球菌属(staphylococcus)的细菌引起的。还优选的是由选自柯克斯氏体属(coxiella)、李斯特菌属(listeria)、弗朗西斯氏菌属(francisella)和立克次氏菌属(rickettsia)的细菌引起的细胞内细菌感染。在一个优选的方面，细菌不产生孢子。在一个进一步优选的方面，在细胞内出现的细菌也不存在于生物膜中，尽管在可替代的选择中它们也可能出现。

优选地，在本发明的方法和用途中，感染存在于骨骼、血液、心脏、泌尿道、肺、皮肤或粘膜表面的细胞中或与之相关的细胞中。因此，在一个方面，待治疗的细菌感染包括骨髓炎、菌血症、结核、q热和心内膜炎以及(皮下)皮肤或粘膜感染/损伤，例如慢性伤口、溃疡、脓肿和糖尿病足感染，以及口腔和鼻腔感染，例如慢性鼻窦炎和牙周炎。

在一个进一步优选的方面，该方法或用途用于治疗与生物材料相关的感染，并且待治疗的细胞存在于被引入受试者的生物材料上或其附近。例如，与生物材料相关的感染可以是种植体周围炎(牙齿植入物周围的感染)。还可以治疗从受试者内移除生物材料后保持的细胞内细菌感染。感染是使用诸如医疗装置的生物材料(尽管在其插入和护理过程中格外小心)的常见并发症。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的感染特别普遍。生物材料的感染非常难以治疗。需要长时间应用抗体，并且在许多情况下，必须移除生物材料，这可能对患者/受试者产生巨大的影响，例如当涉及永久性植入物，例如人工关节或心脏瓣膜时。即使移除后，根除存在于感染区域的细菌需要长期的抗生素治疗(可能长达6个月)。研究表明细菌在生物材料周围的组织中持续存在。巨噬细胞被认为是细胞内细菌的宿主，并为重复感染维持了一个细菌库。本发明的方法和用途允许这种“隐藏的”细菌被靶向。

如本文所指，“生物材料”是一种出于治疗目的可被引入受试者的人造材料或装置。此类生物材料包括医疗装置(device)、医疗仪器(instrument)、医疗工具(implement)或医疗设备(equipment)、假体或材料、组织或伤口敷料(例如，用于骨科、心血管、泌尿道、外科、妇科或牙科目的)。医疗装置包括心脏起搏器、心脏瓣膜和支架，医疗工具包括导管，假体或材料包括人工关节、植入物(包括乳房植入物和牙齿植入物)、骨固定板以及螺钉和支架材料(例如外科网片(surgicalmesh))。伤口敷料包括膏药(plaster)和绷带，以及可用于伤口修复的粘固剂(cement)、胶水或基质。如下文所讨论的，可以将抗菌剂和/或光敏剂提供在生物材料之上或之内(例如，嵌入或浸渍在其中)。

“细胞内”细菌感染是指其中细菌被摄取到细胞中并能够在该细胞中存活和复制的感染。此外，细菌可能在细胞外存在并复制。这种细胞内细菌可以存在于细胞内的任何位置，例如，在胞质溶胶中或在被膜包含的亚区室中，例如溶酶体、核内体或吞噬体。可以根据本发明治疗或预防的细胞内细菌感染的例子包括分枝杆菌属(例如结核分枝杆菌)、假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)、埃希氏菌属(例如大肠杆菌)和葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)的感染。在一个特定的实施方案中，待治疗的受试者是母牛，细菌感染是金黄色葡萄球菌乳腺炎。

其他感兴趣的细胞内细菌感染包括李斯特菌属(例如单核细胞增生李斯特菌)、弗朗西斯氏菌属(例如土拉弗朗西斯菌)、柯克斯氏体属(例如贝纳特氏柯克斯体(c.burnetti)和立克次氏菌属的感染。

在本发明的上下文中，“一个或多个细胞”可以在培养物中或在组织、器官中或体内。因此，该细胞可以在体外、离体(exvivo)提供，或在受试者或有机体(例如体内细胞)内。术语“细胞”包括所有真核细胞(包括昆虫细胞和真菌细胞)。因此，代表性的“细胞”包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和原生动物。然而，优选地，细胞是真核的，例如来自哺乳动物、爬行动物、鸟类、昆虫或鱼类。优选地，细胞来自哺乳动物，特别是灵长类动物、家畜、牲畜或实验动物。特别优选地，细胞是哺乳动物的，例如来自猴、猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、母牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠的细胞，但是最优选地来自人类。

被感染的细胞可以是吞噬细胞，例如巨噬细胞、树突状细胞或中性粒细胞，或者可以是“非专业”吞噬细胞，例如上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、成骨细胞和成纤维细胞。

“抗菌剂”是一种在体外条件下，例如在培养条件下直接接触时，具有杀死、破坏所选细菌或阻止所选细菌复制的能力的实体(例如分子)。所述细菌优选如本文所述。(如本文所指，细菌以单数和复数形式指代。特别地，当定义为待靶向的细菌的类型(即适用于每种细菌的类型，例如种类)时其以单数形式指代，当提及其可能受到的治疗(即多种微生物的治疗)时其以复数形式指代)。特别地，通过确定对一种或多种细菌(例如对葡萄球菌属细菌)的mic值或mbc值来评估抗菌活性。抗菌活性可以参考mic值(最小抑菌浓度(minimuminhibitionconcentration，mic))来确定，mic值被定义为在特定液体培养基中过夜培养后，抑制微生物可见生长的抗微生物剂最小浓度。或者，抗菌活性可以通过最小杀菌浓度(minimumbactericidalconcentration，mbc)来确定，最小杀菌浓度是在该培养期间杀死99.9％细菌的最小浓度。优选地，抗细菌剂的mic值(优选对本文所述的细菌而言)小于50μg/ml，优选小于30μg/ml，特别优选小于10μg/ml、5μg/ml或1μg/ml。

在一个优选的方面，抗菌剂是抗生素，即选择性地治疗特定细菌(属或种)。

抗菌剂可以选自氨基糖甙类(例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素或壮观霉素)；安沙霉素类(例如格尔德霉素、除莠霉素或利福昔明)；碳头孢烯类(例如氯碳头孢)；碳青霉烯类(例如厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南)；头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林或头孢吡普)；糖肽类(例如替考拉宁、万古霉素、特拉万星(telavancin)、达巴万星或奥利万星)；林可酰胺类(例如克林霉素或林可霉素)；脂肽类(例如达托霉素)；大环内酯类(例如阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、泰利霉素、非达索霉素或螺旋霉素)；单环β-内酰胺类(例如氨曲南)；硝基呋喃类(例如呋喃唑酮或呋喃妥因)；噁唑烷酮类(例如利奈唑胺、泼斯唑来(posizolid)、雷得唑来或特地佐利(torezolid))；青霉素类(例如阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、盘尼西林(g或v)、哌拉西林、替莫西林或替卡西林)；多肽类(杆菌肽、粘菌素、多粘菌素b)；喹诺酮类(例如环丙沙星、恩氟沙星(enfloxacin)、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格雷沙星、司帕沙星或替马沙星)；磺酰胺类(例如磺胺米隆、磺胺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑(sulfanilimide)、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑或磺酰胺柯衣汀(sulfonamidochrysoidine))；四环素类(例如地美环素、强力霉素、米诺环素、氧四环素或四环素)；以及其他抗菌剂，例如氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷丁、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、梭链孢酸、甲硝哒唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁/达福普丁、甲砜霉素、替加环素、替硝唑或甲氧苄啶；或其任何组合。

在一个优选的特征中，抗菌剂是氨基糖苷类(优选庆大霉素)、糖肽(优选万古霉素)或大环内酯(优选如上所述)。在本文所述的方法和用途中，可以任选地使用一种以上的抗菌剂，例如庆大霉素和利福平。当使用一种以上药剂(例如两种或三种药剂)时，对于本发明的方法和用途，如本文所述它们可以同时、依次或分别使用(例如给药)。

本文所指的“光敏剂”是一种化合物，当该药剂在适当波长和强度的照射下被激活以产生被激活的物种时，该化合物能够将被吸收的光的能量转化到化学反应中。这些过程的高反应性最终产物可以导致细胞毒性和血管毒性。方便地，这种光敏剂可以是定位于细胞内区室(特别是核内体、吞噬体或溶酶体)的光敏剂。

光敏剂可以通过各种机制直接或间接地发挥其作用。因此，例如，某些光敏剂在被光激活时直接变成有毒的，而另一些光敏剂则用于产生有毒物种，例如对细胞物质和生物分子(如脂质、蛋白质和核酸)具有极强的破坏性的氧化剂(例如单线态氧或其他活性氧物种)。

一系列这种光敏剂在本领域中是已知的，并且在文献中进行了描述，包括wo96/07432中，该文献通过引用并入本文，并且可以这种光敏剂用于本发明的方法和用途。有许多已知的光敏剂，包括卟啉类(porphyrins)、酞菁类(phthalocyanines)和二氢卟吩类(chlorins)(bergetal.,1997,j.photochemistryandphotobiology,65,p403-409，通过引用并入本文)。其他光敏剂包括细菌卟吩类(bacteriochlorins)。

卟啉类是研究最广泛的光敏剂。它们的分子结构包括四个通过次甲基桥连接在一起的吡咯环。它们是天然化合物，通常能够形成金属配合物。例如，在氧转运蛋白血红蛋白的情况下，铁原子被引入血红素b的卟啉核中。

二氢卟吩类是大的杂环芳族环，其母核由通过四个次甲基键连接的三个吡咯和一个吡咯啉组成。因此，与卟啉类不同，二氢卟吩类在很大程度上是芳香性的，但在环的整个圆周上不是芳香性的。

特别优选定位于细胞的核内体、吞噬体或溶酶体的光敏剂。因此，优选地，光敏剂是被摄取到溶酶体、吞噬体或核内体的内部区室中的药剂。优选地，光敏剂通过内吞作用或吞噬作用被摄取到细胞内区室中。优选的光敏剂是两亲性光敏剂(例如二磺化(disulphonated)光敏剂)，例如两亲性酞菁类、两亲性卟啉类、两亲性二氢卟吩类和/或两亲性细菌卟吩类，并且特别包括磺化(优选二磺化)内消旋四苯基二氢卟吩、磺化(优选二磺化)卟啉类和磺化(优选二磺化)酞菁类和磺化(优选二磺化)细菌卟吩类。在一个优选的方面，光敏剂选自卟啉、酞菁、红紫素(purpurin)、二氢卟吩、苯并卟啉、向溶酶体(lysomotropic)弱碱、萘酞菁(naphthalocyanine)、阳离子染料、四环素、5-氨基乙酰丙酸和/或其酯、或任何所述药剂的衍生物，优选tpps4、tpps2a、alpcs2a、tpcs2a、5-氨基乙酰丙酸或5-氨基乙酰丙酸的酯类、或其药学上可接受的盐。特别优选的是tpps2a(四苯基卟啉二磺酸盐(tetraphenylporphinedisulfonate))、alpcs2a(铝酞菁二磺酸盐(aluminiumphthalocyaninedisulfonate))、tpcs2a(四苯基二氢卟吩二磺酸盐(tetraphenylchlorindisulfonate))和tpbs2a(四苯基细菌卟吩二磺酸盐(tetraphenylbacteriochlorindisulfonate))或其药学上可接受的盐。优选地，光敏剂是tpcs2a(二磺化四苯基二氢卟吩(disulfonatedtetraphenylchlorin)，例如)。

如本文所用，“和/或”是指存在所列举的选项中的一个或两个(或多个)，例如a和/或b包括选项i)a，ii)b或iii)a和b。

优选的光敏剂的结构如下：

箭头表示两个分子之间的结构差异。

任选地，光敏剂可以附着于一种或多种载体分子或靶向分子或者与一种或多种载体分子或靶向分子相关联或偶联，所述一种或多种载体分子或靶向分子能够用于促进或增加光敏剂的摄取。因此，光敏剂可以与载体相连接。例如，光敏剂可以以偶联物的形式提供，如基于壳聚糖的偶联物，例如wo2013/189663(其通过引用并入本文)中公开的偶联物。

如本文所用，“接触”是指在适于内化到细胞中的条件下，例如优选在37℃下在合适的营养培养基中，例如25-39℃或体内，使一个或多个细胞和在本方法中所用的各种组分(或药剂)彼此之间进行物理接触。可以使细胞依次或同时与如本文所定义的方法中使用的光敏剂和抗菌剂接触。方便地，使多种组分同时与一个或多个细胞接触，并且优选地如下文中更详细的描述，一起应用于一个或多个细胞。不同的组分可以被一个或多个细胞摄取到相同或不同的细胞内区室中(例如，它们可以是共转位的)。然而，在一个可替代的实施方案中，所述多种组分不一起应用，即在不同时间和/或通过不同给药途径应用。

然后将细胞暴露于合适波长的光下以激活光敏化合物，这转而导致细胞内区室膜的破裂。

wo02/44396(其通过引用并入本文)描述了一种方法，其中该方法中的步骤的顺序可以被安排，使得例如在待内化的分子(在这种情况下，为抗菌剂)与细胞接触之前，光敏剂与细胞接触并通过照射被活化。该方法利用了以下事实：在照射时，没有必要使待内化的分子与光敏剂存在于同一细胞亚区室中。

因此，在一个实施方案中，如本文所定义的所述光敏剂和所述抗菌剂一起或相对于彼此分别地应用于细胞。然后在当光敏剂和抗菌剂出现在同一细胞内区室中时进行照射。这被称为“后光照(lightafter)”方法。

在一个可替代的实施方案中，所述方法可以按如下进行：首先使所述细胞与光敏剂接触，然后与如本文所定义的待使用的抗菌剂接触，并在光敏剂被摄取到细胞内区室中之后，但在抗菌剂被细胞摄取到含有所述光敏剂的细胞内区室中之前(例如，在暴露于光时所述光敏剂和所述抗菌剂可能存在于不同的细胞内区室中)，优选在抗菌剂被细胞摄取到任何细胞内区室之前，例如在抗菌剂被任何细胞摄取之前，进行照射。因此，例如可以在给药光敏剂之后进行照射，然后给药抗菌剂。这就是所谓的“前光照(lightbefore)”方法。

如本文所用，“内化”是指细胞内的(例如胞质溶胶的)分子传递。在本发明的情况下，“内化”可以包括将分子从细胞内/膜包围的区室释放到细胞的胞质溶胶中的步骤。

如本文所用，“细胞摄取”或“转位”是指内化步骤之一，其中例如通过内吞作用、吞噬作用或其他合适的摄取机制，将细胞膜外部的分子吸收到细胞中，使得发现它们位于外层细胞膜内部，例如进入细胞内膜限制的区室或与细胞内膜限制的区室相关联，所述细胞内膜限制的区室例如为内质网、高尔基体、溶酶体、核内体、吞噬体等。

通常，该方法在已经被细菌感染的一个或多个细胞上进行。但是，该方法还可以在尚未被细菌感染的一个或多个细胞或正在被细菌感染过程中的一个或多个细胞中进行(在这种情况下，该方法是预防方法)。当一个或多个细胞处于被感染过程中时，在pci方法中细菌可能会与光敏剂和/或抗菌剂一起被摄取。当所述一个或多个细胞尚未被感染时，所述一个或多个细胞可以是被鉴定为具有感染风险的一个或多个细胞(例如在可能发生细胞内感染的部位，例如当使用装置时与生物材料相关的感染)。在这种情况下，可以在即将放置装置之前在感兴趣的位点立即进行该方法。

使细胞与不同药剂接触的步骤可以以任何方便的或期望的方式进行。因此，如果接触步骤在体外进行，则可以将细胞方便地保持在水性培养基中，例如合适的细胞培养基，并且在适当的时间点，可以在适当的条件下，例如以适当的浓度和适当的时长，将各种药剂简单地添加到培养基中。例如，细胞可以在无血清培养基或含血清培养基的存在下与药剂接触。

下面的评论分别讨论了不同药剂对细胞的应用。然而，如上所述，这些药剂可以一起、分别、同时或依次地应用于细胞。如本文所指，在本发明的方法和用途中所用的药剂可以体外或体内应用于细胞。在后一种情况下，如下文更详细地描述，可以通过直接(即局部(localized)或外用(topical))或间接(即全身或非局部)给药来应用。

使光敏剂以适当的浓度和适当的时长与细胞接触，这可以由本领域技术人员使用常规技术容易地确定，并且将取决于诸如所使用的特定光敏剂、给药模式、治疗过程、患者/受试者的年龄和体重、医学指征、待治疗的身体或身体区域等因素，并且可以根据选择进行更改或调整。光敏剂的浓度方便地使得一旦被摄取到细胞中，例如被摄取到一个或多个其细胞内区室中或与其一个或多个其细胞内区室相关联，并通过照射激活，一个或多个细胞结构被破坏，例如一个或多个细胞内区室被裂解或破坏。

例如，如本文所述的光敏剂可以以例如0.1μg/ml至50μg/ml的浓度使用。对于体外使用，该范围可以更宽，例如0.0005μg/ml-500μg/ml。对于体内人体治疗，当系统性给药时，光敏剂可以以0.05mg/kg体重至20mg/kg体重的范围使用。或者，对于系统性给药，可以使用0.005mg/kg体重至20mg/kg体重的范围。对于系统性递送，提供的总剂量可以为1μg-5000μg的量级，例如10μg-2500μg、25μg-1000μg、50μg-500μg、10μg-300μg、25μg-200μg或100μg-300μg。优选地，剂量选自100μg、150μg、200μg和250μg。优选地，剂量是75μg-125μg，例如100μg。如果是局部给药，例如通过外用、皮内或皮下给药，则剂量可以在0.001μg–500μg或0.1μg-500μg范围内，例如0.001μg-0.1μg、0.0025μg-1μg、0.01μg-50μg、0.0025μg-250μg、1μg-250μg、2.5μg-100μg、2.5μg-40μg、5μg-50μg、1μg-30μg或10μg-30μg。对于局部递送，优选剂量选自10μg、15μg、20μg和25μg。优选地，剂量是7.5μg-12.5μg，例如10μg。提供的剂量适用于平均体重(即70公斤)的人。对于皮内注射，光敏剂剂量可以溶解在100μl-1ml中，即浓度可以在0.01μg/ml-50000μg/ml或1μg/ml-50000μg/ml的范围内。在较小的动物中，浓度范围可能不同并且可以相应地调整，但当局部使用时，不同的动物需要的剂量变化不大。

如本文所定义的抗菌剂的浓度还将取决于待使用的特定分子、给药模式、治疗过程、患者/受试者的年龄和体重、医学指征、待治疗的身体或身体区域，并且可以根据选择进行更改或调整。

例如，如本文所述的抗菌剂可以以例如0.01μg/ml至50μg/ml的浓度使用。对于体外使用，该范围可以更宽，例如0.0005μg/ml-500μg/ml。对于体内人体治疗，当系统性给药时，抗菌剂可以以0.05mg/kg体重至100mg/kg体重的范围使用。或者，对于系统性给药，可以使用0.005mg/kg体重至100mg/kg体重的范围，优选0.1mg/kg体重至50mg/kg体重。如果是局部给药，例如通过外用、皮内或皮下给药，则剂量可以在1μg-50000μg范围内，例如10μg-25000μg、25μg-10000μg、50μg-5000μg、10μg-3000μg或100μg-3000μg。优选地，剂量选自1mg、1.5mg、2mg和2.5mg。优选地，剂量是0.75mg-1.25mg，例如0.1mg。提供的剂量适用于平均体重(即70公斤)的人。对于皮内注射，抗菌剂剂量可以溶解在100μl-1ml中，即浓度可以在1μg/ml-50000μg/ml的范围内。在较小的动物中，浓度范围可能不同并且可以相应地调整，但当局部使用时，不同的动物需要的剂量变化不大。

在大多数情况下，光敏剂和抗菌剂同时给药，但是这可以改变。因此，对于每种不同的组分，可以考虑不同的给药(或与细胞接触)时间或模式或位点，并且这种方法涵盖在本发明的范围内。

在一个实施方案中，如本文所定义的抗菌剂与光敏剂分开给药，例如以分别的制剂给药，或系统性(例如通过口服)给药。因此，在一个实施方案中，分别地，可以在给药光敏剂或抗菌剂之前，例如在直至24或48小时之前，给药抗菌剂或光敏剂。优选地，分别给药间隔少于48小时、24小时、12小时、8小时、4小时或2小时。举例来说，可以首先给药光敏剂(例如局部给药以避免皮肤光敏性)，然后可以系统性给药抗菌剂。

使一个或多个细胞与如本文所定义的光敏剂和/或抗菌剂之间的接触方便地为15分钟至24(或48)小时(例如15分钟或30分钟至4小时，例如1小时-2小时)。接触可以是同时或依次的，或者与分别的组分接触的时间可以重叠。接触步骤是指一个或多个细胞与所讨论的药剂的总接触时间，并且接触时间可以由多个离散的分别的接触步骤组成。在照射步骤之前，可以将药剂从与细胞的接触中移除一段时间。在体外方法中，在一个优选的方面，每种药剂的接触步骤可以是15(或30)分钟至120分钟。在体内，可以使用相似的接触时间，但是在给药后(例如使用系统性给药的情况下)细胞可能不会立即与药剂接触，在这种情况下，需要在照射之前充分给药药剂，以使药剂到达靶细胞并与那些细胞已接触所需的接触时间，如下文更详细地讨论。

在一个优选的实施方案中，细胞的初始培养是与光敏剂一起进行的。在一个实施方案中，给药光敏剂和抗菌剂之间的时间为数小时。例如，可以在照射前16小时至20小时(或40小时至44小时)，例如18小时，应用光敏剂；并且可以在照射前1小时至3小时，例如2小时，应用抗菌剂。因此，给药光敏剂和抗菌剂之间的时间可以在15小时至23(或47)小时的范围内。不论先使用哪种药剂，此时间都适用。

方便地，在与光敏剂/抗菌剂接触之后并且在照射之前，可以将一个或多个细胞置于无光敏剂/抗菌剂的培养基中，例如30分钟至4小时，例如1.5小时至2.5小时，取决于与光敏剂和抗菌剂一起培养的时间。

在体内，使各种药剂与靶细胞接触的适当的培养方法和时间取决于诸如给药模式和所用药剂的类型等因素。例如，如果将药剂注射到要待治疗/照射的组织或器官中，或外用应用，则注射或应用点附近的细胞将与药剂接触，并因此趋于比距注射点或应用点远的细胞(其可能会在较晚的时间点和较低的浓度下与药剂接触)更快地摄取药剂。方便地，可以使用6小时-24小时(或6小时-48小时)的时间。

另外，通过静脉内注射或口服给药的药剂可能需要一些时间到达靶细胞，因此可能需要更长的给药后时间，例如几天，以使足够或最佳量的药剂积聚在靶细胞或组织中。因此，体内个别细胞所需的给药时间可能取决于这些参数和其他参数而变化。

然而，尽管体内情况比体外情况复杂，但是本发明的基本概念仍然相同，即分子与靶(即被感染的)细胞接触的时间必须使得在照射发生之前靶细胞已摄取了适量的光敏剂，并且发生以下情况之一：(i)在照射之前或期间，抗菌剂已经被摄取，或者将在与靶细胞充分接触后被摄取，进入细胞，例如相对于光敏剂进入相同或不同的细胞内区室，或者(ii)照射后，抗菌剂与细胞接触一段足以使其被摄取到细胞中的时间。

对于体内给药本文所述的药剂，可以使用本领域常用或标准的任何给药方式，例如口服、肠胃外(如肌内、透皮(transdermal)、皮下、经皮(percutaneous)、腹膜内、鞘内或静脉内)、肠道、口腔、直肠或外用(身体内表面和身体外表面)等。对于体内使用，本发明可用于包含细胞的任何组织，包括体液位置，以及实体组织，其中包含光敏剂的化合物或抗菌剂定位于所述细胞。只要光敏剂被靶细胞摄取，并且光可以被适当地传递，所有组织都可以被治疗。优选的给药模式是皮内、皮下或外用给药用或注射。优选地，给药是外用(topical)(在本文中也称为局部(local)给药)。

给药可以通过在治疗/预防方法时将所需的药剂应用于一个或多个细胞来进行(例如，对患者/受试者给药)，或者一种或多种所需的药剂可以以允许缓慢或受控(按需)释放的制剂形式提供，然后可以进行治疗/预防步骤。例如，可以将抗菌剂和/或光敏剂提供在待用于患者/受试者身上或体内的生物材料之上或之中(例如嵌入或浸渍在其中)。这种药剂可以随时间缓慢释放或按需释放，并且治疗/预防步骤通过照射引发(任选地，给药所需的一种药剂，如果其不存在于生物材料中/之上)。为了方便地评估时间和剂量，这种给药方式被考虑为局部给药。

为了实现期望的结果，即治疗或预防细菌感染，可以重复所述方法或其部分。因此，该方法整体可以在适当的间隔之后进行多次(例如，2、3或更多次)，或者可以重复该方法的部分，例如进一步给药如本文所定义的抗菌剂和/或光敏剂或进行额外的照射步骤。例如，该方法或该方法的一部分可以在首次进行后再次进行几天，例如5天到60天之间(例如7、14、15、21、22、42或51天)，例如7天至20天，优选为14天或几周，例如1周至5周(例如1、2、3或4周)。该方法的全部或部分可以在适当的时间间隔，例如每两周或14天，重复多次。在一个优选的实施方案中，该方法至少重复一次。在另一个实施方案中，该方法重复两次。

“照射”以活化光敏剂的是指直接或间接地施用光，如下文所述。因此，一个或多个细胞(其可能存在于受试者体内)可以用光源例如直接照射(例如体外的单个细胞上)，或间接照射，例如在体内，当细胞位于皮肤表面以下或以一层细胞的形式存在(并非所有细胞都被直接照射)，即没有筛选其他细胞时。在给药如本文所定义的方法中使用的各种组分后，可照射细胞或受试者约15分钟至24(或48)小时。在体外方法中，给药后例如15分钟至120分钟可发生照射，而在体内方法中，如果与受试者体内靶细胞的接触时间不是即时的，则可能需要更长的给药后时间(取决于给药途径)，例如给药后15分钟至24(或48)小时。

活化光敏剂的光照射步骤可以根据本领域公知的技术和步骤进行。照射的剂量、波长和持续时间必须足以激活光敏剂，即产生反应性物种。

根据所使用的光敏剂选择所使用的光的波长。合适的人造光源在本领域中是公知的，例如使用蓝色(400nm-475nm)或红色(620nm-750nm)波长的光。对于tpcs2a，例如，可以使用在400nm和500nm之间的波长，更优选地在400nm和450nm之间的波长，例如430nm-440nm的波长，更优选约435nm或435nm的波长。在适当的情况下，光敏剂，例如卟啉或二氢卟吩可以被绿光激活，例如killerred(evrogen，俄罗斯莫斯科)光敏剂可以被绿光激活。

合适的光源在本领域中是公知的，例如pcibiotechas的灯。或者，可以使用具有高达60mw的可调输出功率和430nm-435nm发射光谱的基于led的照射装置。对于红光，合适的照射源是pcibiotechas652nm激光系统sn576003二极管激光器，尽管可以使用任何合适的红光源。

在本发明的方法中细胞暴露于光的时间可以改变。分子内化到胞质溶胶中的效率随着暴露于光的增加而增加直至最大限度，超过该最大限度细胞破坏，从而细胞死亡增加。

照射步骤的优选时长取决于诸如靶标、光敏剂、在靶细胞或组织中积累的光敏剂的量以及光敏剂的吸收光谱与光源的发射光谱之间的重叠等因素。通常，照射步骤的时长为数秒至数分钟或长达数小时(甚至长达12小时)的量级，例如优选长达60分钟，例如0.25分钟或1分钟至60分钟，例如5分钟至60分钟，优选10至20分钟，优选15分钟。例如当使用较高剂量的光敏剂时，也可以使用较短的照射时间，例如1秒至60秒，例如10-50秒、20-40秒或25-35秒。

本领域技术人员可以选择适当的光剂量，并且适当的光剂量也取决于所使用的光敏剂和一个或多个靶细胞或组织中积累的光敏剂的量。当使用具有较高的可见光谱消光系数(例如在红区，如果使用蓝光则在蓝区，取决于所用的光敏剂)的光敏剂时，光剂量通常较低。例如，当采用具有高达60mw的可调输出功率和430nm-435nm发射光谱的基于led的照射装置时，在0.05mw/cm²-20mw/cm²，例如2.0mw/cm²的能量密度(fluence)范围内，可以使用0.24j/cm²-7.2j/cm²范围内的光剂量。或者，例如，如果采用灯，则在0.1-20mw/cm²(例如由提供的13mw/cm²)的能量密度范围内，0.1j/cm²-6j/cm²范围内的光剂量是合适的。对于红光，在0.1mw/cm²-5mw/cm²，例如0.81mw/cm²的能量密度范围内，可以使用0.03j/cm²-1j/cm²，例如0.3j/cm²的光剂量。

此外，如果要维持细胞生存力，则应避免产生过量水平的有毒物种，并且可以相应地调整相关参数。

借助于光化学处理，即借助于光动力疗法的作用，通过对光敏剂的活化产生有毒物种，本发明的方法不可避免地引起一些细胞损伤。取决于所建议的用途，这种细胞死亡可能不重要，并且确实可能有利于去除一些细菌感染的细胞。然而，在大多数实施方案中，避免了细胞死亡，例如以允许发生抗菌作用。可以修改本发明的方法，使得通过相对于光敏剂的浓度或剂量来选择光剂量，从而调节存活细胞的分数或比例。同样，这种技术在本领域中是已知的。

优选地，基本上所有细胞或绝大部分(例如至少75％，更优选至少80％、85％、90％或95％的细胞)没有被杀死(接受治疗的那些细胞)。可以通过本领域已知的标准技术，例如mts测试来测量pci处理后的体外细胞生存力。体内，一种或多种细胞类型的细胞死亡可以在1cm半径的给药点内(或在一定的组织深度处)例如通过显微镜进行评估。由于细胞死亡可能不会立即发生，因此细胞死亡百分比是指在照射数小时内(例如，照射后长达4小时)仍保持生存力的细胞的百分比，但优选地是指照射后4小时或更长时间的活细胞百分比。

pci使抗菌剂释放到一个或多个细胞的胞质溶胶中。药剂然后可以与细菌作用以杀死或破坏细菌或防止其复制。

“杀死”是指将细菌的破坏至无法进一步复制的程度。“破坏”是指影响细菌正常活动的能力，使其可能死亡或无法复制。“防止复制”是指部分地或完全地(例如根据下文所述的百分比)防止细菌的复制。优选地，本文所述的方法、治疗或用途导致进行治疗的细菌至少25％、50％、75％或90％死亡或破坏，或者防止复制，使得相对于未进行治疗的对照，防止或减少了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细菌感染。

该方法可在体内、体外或离体进行。优选地，该方法在体内使用。

当用于体外方法时，本发明的方法可替代地描述为杀死、破坏一个或多个细胞中的细菌或防止细菌在一个或多个细胞中复制的体外方法，包括使一个或多个细胞与抗菌剂和光敏剂接触，并用有效激活光敏剂的波长的光照射一个或多个细胞，其中抗菌剂被释放到一个或多个细胞的胞质溶胶中，并杀死、破坏所述一个或多个细胞中的细菌或阻止细菌在所述一个或多个细胞中复制。上述的优选方面也适用于该方法。

当在体内使用时，“受试者”是指哺乳动物、爬行动物、鸟类、昆虫或鱼类。优选地，受试者是哺乳动物，特别是灵长类动物(优选人)、家畜或伴侣动物、牲畜或实验动物。因此优选的动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗、猴、猪、母牛、山羊、绵羊和马。

方便地，光敏剂和抗菌剂可以提供在一种组合物中。或者，它们可以在分别的溶液或组合物中，以允许不同的给药或应用的机制或时间。如本文中所指，“共同给药”和“共同应用”是指两种组分在同一方法中使用但不同时使用(无论是在时间上还是在相同的组合物中)。

在本发明的一个替代性叙述中，本发明还提供了在治疗受试者体内的细胞内细菌感染中使用的如前文所定义的抗菌剂和如前文所定义的光敏剂或如后文所定义的包含抗菌剂和光敏剂的组合物，其中优选地，所述使用包括如前文所定义的方法。本发明还提供了如前文所文定义的抗菌剂和/或如前文所定义的光敏剂在制备用于治疗受试者体内的细胞内细菌感染(优选通过如前文所定义的方法)的药物中的用途。

还提供了抗菌剂和光敏剂作为抗菌药的用途，其中优选地，药剂如前文所述并且根据本文所述的方法使用。

本发明进一步提供了包含如前文所文定义的抗菌剂和如前文所文定义的光敏剂的组合物，优选在治疗中使用。该组合物可以是药物组合物的形式，还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

这些组合物(和本发明的产品，在下文中描述)可以按照药学领域已知的技术和步骤以任何方便的方式配制，例如使用一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。该组合物可以配制成缓慢或延迟释放的组合物。如本文所指，“药学上可接受的”是指与组合物(或产品)的其他成分相容以及接受者生理上可接受的成分。组合物和载体或赋形剂材料的性质、剂量等可以根据选择和所期望的给药途径、治疗目的等以常规方式进行选择。剂量也可以以常规方式确定，并且可以取决于分子(或组合物或产品的组分)的性质、治疗目的、患者/受试者的年龄、给药方式等。关于光敏剂，还应考虑到在照射时破坏膜的潜力/能力。

本发明还提供了包含如前文所定义的抗菌剂和如前文所定义的光敏剂作为组合制剂在治疗受试者体内的细胞内细菌感染中同时、分别或依次使用的产品。

最后，本发明提供了在治疗受试者体内的细胞内细菌感染中使用的试剂盒，所述试剂盒包括：

包含如前文所定义的光敏剂的第一容器，和

包含如前文所定义的抗菌剂的第二容器。

本发明的产品和试剂盒可用于治疗或预防如前文所定义的细胞内细菌感染。

实施例中描述的方法构成了本发明的进一步优选方面。可以预期上述优选特征的所有组合，特别是如实施例中所述的。现在将参考附图通过非限制性实施例描述本发明，其中：

图1显示了pci对庆大霉素治疗raw264.7细胞中细胞内表皮葡萄球菌的功效的影响。吞噬作用(摄取)后立即测定细胞内表皮葡萄球菌的初始数目为10⁶cfu/孔。吞噬作用后，仅用0.25μg/mltpps2a、单独用1μg/ml、10μg/ml和30μg/ml庆大霉素(gen)(-)或用各自的庆大霉素-tpps2a组合(+)处理细胞2小时。随后将细胞照射10分钟或15分钟。将未照射的细胞(未照射)和未处理的经照射细胞(无gen，tpps2a“-”)用作对照。处理后，用含有1μg/ml庆大霉素的更新的培养基替换培养基以抑制细胞外细菌的生长，并将细胞培养过夜。使用sidak的多重比较测试分析了gen单独处理组与各自的gen+tpps2a组之间的差异。数据表示为平均值±标准偏差(n＝3)。***，p<0.001。进行了两个独立的实验，其中一个如图所示。实验显示出高度相似的数据和统计显著性。

图2显示了在进行和未进行2分钟的照射以激活光敏剂的情况下，raw264.7细胞中庆大霉素和tpcs2a的细胞内分布。在照射前，将细胞在含有10μg/ml庆大霉素(gen，蓝色荧光)和1μg/mltpcs2a(红色荧光)的培养基中培养过夜。庆大霉素和tpcs2a的胞内共定位出现在合并图像中的品红色中。比例尺＝20μm。

图3显示了用于斑马鱼胚胎感染的金黄色葡萄球菌的剂量的确定，并显示了金黄色葡萄球菌和斑马鱼吞噬细胞的共定位的可视化。a)注射有不同接种物的斑马鱼胚胎中金黄色葡萄球菌的cfu数量。向胚胎注射1nl的每nl含100cfu至6000cfu的金黄色葡萄球菌悬浮液，在注射后直接破碎，将所得悬浮液进行定量培养以定量所注射的金黄色葡萄球菌的cfu数量。这些线表示中位cfu数量。b)不同的金黄色葡萄球菌接种物对斑马鱼胚胎存活的影响。将pbs注射用作对照。最初的组大小为26至38个胚胎。c)注射后2小时金黄色葡萄球菌和2天大的斑马鱼胚胎的吞噬细胞的共定位。该框表示d和e中显示的高倍率下记录的共定位区域。比例尺＝500μm。d)和e)中分别显示了表达绿色荧光蛋白(gfp)的金黄色葡萄球菌与表达mcherry蛋白的巨噬细胞或与表达dsred蛋白的中性粒细胞的共定位。d)和e)中的箭头表示共定位。比例尺＝100μm。

图4显示了用0.4ng庆大霉素(gen)、单独用0.1ng和0.05nggen或与2.5×10^-3ngtpcs2a(t)组合进行处理的金黄色葡萄球菌感染的胚胎的存活百分比。pbs模拟处理用作对照。最初的组大小为31至33个胚胎。使用log-rank测试分析单独的庆大霉素或庆大霉素-tpcs2a处理组的存活与pbs模拟处理组的存活之间的差异，以及庆大霉素-tpcs2a组和仅各自的庆大霉素组之间的差异。**p<0.01。***p<0.001。

图5显示了在巨噬细胞系中pci使万古霉素从内吞囊泡重新定位到胞质溶胶中。在照射之前(a)和照射之后(b)，通过荧光显微镜分析tpcs2a和fl-万古霉素的细胞内定位。

图6显示pci诱导巨噬细胞内万古霉素分解。以与图5中的细胞相同的方式处理raw264.7细胞。在该实验中，pci前后样品的显微镜光激发时间相同，因此可以定量比较荧光强度。

图7显示单独用0.4ng万古霉素(vanco)或与2.5×10^-3ngtpcs2a和照射(t)组合进行处理的金黄色葡萄球菌感染的胚胎的存活百分数。pbs模拟处理用作对照。使用log-rank测试分析万古霉素单独组与万古霉素-tpcs2a/照射组的存活之间的差异，*p<0.05。

实施例1：通过pci增强庆大霉素对细胞内葡萄球菌感染的抗菌作用

作为适用于pci应用的两亲性光敏剂，之前已使用四苯基卟啉二磺酸盐(tpps2a)及其衍生物四苯基二氢卟吩二磺酸盐(tpcs2a)。tpps2a和tpcs2a具有非常相似的理化性质，但是只有tpcs2a可以被红光激活。红光具有非常好的组织穿透性，因此tpcs2a适于广泛的临床应用。在本研究中，目的是评估pci与抗生素(抗菌剂)组合是否可以通过在照射后增强抗生素的胞质溶胶递送来对抗细胞内细菌感染。选择庆大霉素来研究pci的潜在作用，由于它具有较低的细胞内抗微生物功效。

材料和方法

菌株和接种物制备

表皮葡萄球菌菌株o-47(riooletal.,2014,supra)与raw264.7小鼠巨噬细胞(raw264.7细胞)(xiaetal.,2008,acsnano,2(10),p2121-2134)一起用于体外研究。在补充有5％胎牛血清(fcs)的rpmi培养基(gibco，英国佩斯利)(本文中称为rpmi)中，庆大霉素(centrafarmb.v.，荷兰)对表皮葡萄球菌的最小抑制浓度和最小杀菌浓度分别确定为0.04μg/ml和0.33μg/ml。金黄色葡萄球菌菌株atcc49230用于斑马鱼胚胎感染。按照先前描述的方案(riooletal.,2014,supra；andriooletal.,2017,europeancells&materials,33,p143-157)，构建含有gfp表达质粒wvw189的金黄色葡萄球菌菌株rn4220(金黄色葡萄球菌rn4220-gfp)，并将其用于斑马鱼胚胎中细胞-细菌相互作用的体内可视化。按照先前描述的方案(riooletal.,2014,supra；andriooletal.,2017,supra)，对不同实验制备所需浓度的细菌悬浮液(在pbs或rpmi中)。

庆大霉素和光敏剂tpps2a单独或与表皮葡萄球菌组合对raw264.7细胞的细胞毒性

将raw264.7细胞以1×10⁵细胞/孔的浓度接种在96孔板(聚苯乙烯nunclon^tm透明tc板，平底，greiner，荷兰)中，并在37℃下在rpmi中于含有5％co2的潮湿气氛中培养过夜(除非另有说明)。随后将细胞在200μl含有庆大霉素(15.6μg/ml至1000μg/ml)的rpmi中培养过夜，或在含有光敏剂tpps2a(0.1μg/ml至0.4μg/ml)(pcibiotechas，挪威)的rpmi中培养2小时，用更新的rpmi替换含光敏剂tpps2a的rpmi以除去未结合的tpps2a，再培养2小时。将一直在rpmi中培养的raw264.7细胞用作对照。除了使用lumisource(pcibiotechas，挪威)照射15分钟外，使用铝箔保护细胞免受照射。照射后，将细胞在更新的rpmi中培养24小时。根据制造商的说明(cellmtt或wst-1分析试剂盒，sigma-aldrich，荷兰)，在照射后24小时用mtt，或通过wst-1实验直接地并在照射后24小时，分别测试庆大霉素和tpps2a对raw264.7细胞的代谢活性的影响。为了测试tpps2a单独或与表皮葡萄球菌组合对raw264.7细胞的生存力的影响，让细胞吞噬细菌45分钟(吞噬作用分析如下详述)，然后在200μl含0.25μg/ml的tpps2a的rpmi中培养2小时，或始终在200μl仅含tpps2a的rpmi中培养(无细菌)。然后用更新的rpmi洗涤细胞，随后照射5分钟、10分钟或15分钟，或不照射。将仅用照射进行处理的细胞用作对照。直接或在照射后24小时测量碘化丙啶的流入以定量细胞生存力的损失。

raw264.7细胞对表皮葡萄球菌的吞噬作用

培养后，将表皮葡萄球菌细菌沉淀，重新悬浮于1.5ml与0.5ml人血清(h1血清，catn14-402e，biowhittaker，荷兰)混合的pbs中，培养20分钟以进行调理作用。用rpmi将接种物调节至1.8×10⁸cfu/ml。用40μl细菌接种物替换细胞的培养基(细菌与细胞的比例为40:1)，并进行吞噬作用45分钟。然后将raw264.7细胞用60μl预热的pbs(37℃)温和洗涤四次，最后用200μl预热的pbs(37℃)洗涤，以防止浮游的表皮葡萄球菌的残留，这些洗涤步骤后，残留通常少于回收的细胞内细菌数量的0.5％。通过在100μl含0.5mmedta的rpmi中培养来分离raw264.7细胞。分离的细胞被转移至小瓶中，并通过在水浴超声仪(transsonic460，elmaschmldbaurgmbh，德国)中培养，用40μl的1％皂苷(saponine)裂解5分钟。离心超声物(sonicate)，将沉淀的细菌反复洗涤并重新悬浮于pbs中，然后定量培养连续的10倍稀释物。raw264.7细胞中细胞内存活的表皮葡萄球菌以每孔cfu数量表示。

细胞内抗微生物活性测定

吞噬作用后，将raw264.7细胞在200μl的单独含有庆大霉素(1μg/ml、10μg/ml或30μg/ml)或与tpps2a(0.25μg/ml)组合的rpmi中培养2小时，以在rpmi中或仅含tpps2a的rpmi中培养的未经处理的细胞作为对照。对于用tpps2a培养的细胞，用含有相同浓度庆大霉素的更新的rpmi替换培养基，然后另外培养2小时，以去除未结合的tpps2a。然后将细胞在含有1μg/ml庆大霉素的更新的rpmi中培养，照射10分钟或15分钟，以未照射的细胞作为对照。照射后，将细胞培养过夜，裂解，然后定量培养存活的细菌。

荧光标记的庆大霉素的制备

将过量的庆大霉素(在k2co3中，ph9)(sigma-aldrich)与alexafluor405琥珀酰亚胺酯(lifetechnologies)混合，以使一个以上alexafluor405分子标记个别庆大霉素分子的可能性最小化。偶联后，使用c-18柱通过反相色谱法分离反应混合物，以从未偶联的庆大霉素和alexafluor405分子中纯化偶联物。将分离的alexafluor405标记的庆大霉素等分、冻干，并在-20℃下黑暗保存，直至使用。

共聚焦荧光显微镜检查raw264.7细胞中庆大霉素和光敏剂的细胞内分布

过夜培养后，将3.0×10⁵细胞/孔的raw264.7细胞接种到培养皿(mattek玻璃底培养皿，美国)的底部，并在1ml的单独含有10μg/ml庆大霉素或与1μg/mltpcs2a(pcibiotechas，挪威)组合的rpmi中培养过夜。然后将细胞用pbs反复温和洗涤，照射2分钟，并用gold抗褪色试剂(lifetechnologies，荷兰)覆盖以进行共聚焦显微镜(sp5，leica，荷兰)检查。

斑马鱼的饲养和维护

成年野生型(wt)或转基因(tg)斑马鱼的处理符合当地动物福利委员会(dec)批准的当地动物福利法规。成年斑马鱼和胚胎的维护早有描述(zhangetal.,2017,j.biomed.mater.res.a.,105(9),p2522-2532)。

向斑马鱼胚胎的血液循环中注射

按照前面所述的注射步骤(zhangetal.,2017,supra)，通过血岛或cuvier导管向斑马鱼胚胎的血液循环中进行注射(benardetal.,2012,journalofvisualizedexperiments:jove,61)。在本研究中，对于所有注射，每次注射的液体量均调整为1nl。

斑马鱼胚胎中庆大霉素单独或与tpcs2a组合的毒性测试

在受精后32小时(hourspostfertilization，hpf)，将庆大霉素溶液或tpcs2a溶液(均在pbs中)或混合物注入wt斑马鱼胚胎中。将pbs注射入对照胚胎。除了在34hpf使用lumisource照射10分钟外，使用铝箔保护胚胎免受光照。每天监测胚胎的存活(心跳、运动)，直到6dpi。

金黄色葡萄球菌对斑马鱼胚胎感染的剂量发现

在30hpf，在向野生型斑马鱼胚胎注射金黄色葡萄球菌atcc49230的分级接种物，并分别保存在200μl的e3培养基中。每天更新培养基。通过定量培养每组5-6个胚胎，使用magna裂解仪(roche，荷兰)将其破碎，来检查注射剂量。每天监测存活，直到4dpi。

斑马鱼胚胎中吞噬细胞和细菌共定位的可视化

受精后第2天(dayspostfertilization，dpf)，将金黄色葡萄球菌rn4220-gfp的接种物通过cuvier导管静脉注射到以红色荧光标记的中性粒细胞为特征的tg系(lyzc:dsred)(halletal.,2007,bmcdev.biol.,7,p42)或以红色荧光标记的巨噬细胞为特征的tg系(fms:gal4:mcherry)(grayetal.,2011,thromb.haemostasis,105(5),p811-819)的斑马鱼胚胎中。注射后2小时，使用荧光显微镜(lm80，leica，荷兰)用fitc和mcherry滤光片在明视场下记录图像。

使用庆大霉素单独或与tpcs2a组合处理的金黄色葡萄球菌感染的斑马鱼胚胎

在30hpf，通过血岛为野生型斑马鱼胚胎静脉注射合适剂量的金黄色葡萄球菌atcc49230，并随机分组以进行不同的处理。在32hpf，静脉注射1nl的单独含庆大霉素(0.05μg/ml、0.1μg/ml或0.4μg/ml)或与0.25μg/mltpcs2a(以提供2.5×10^-3ng)组合的pbs溶液。对照胚胎接受pbs注射。在34hpf，除了照射10分钟外，使用铝箔保护胚胎免受光照，并分别保存在e3培养基中，每天更新e3培养基。监测存活，直到6dpi。

统计分析

对于体外毒性测试以及raw264.7细胞中的细胞内细菌的杀伤作用，使用dunnett的多重比较测试分析了多个组和用于比较的相同组之间的差异。使用sidak的多重比较测试分析了指定用于成对比较的组之间的差异。使用kaplan-meier方法评估胚胎的存活百分比。使用对数秩检验(logranktest)分析成对的生存曲线之间的差异。对于p值<0.05，差异被认为是显著的。所有分析均使用graphpadprism7.0进行。

结果

庆大霉素和tpps2a对raw264.7细胞代谢活性的影响

为了进行细胞内杀伤测定，对于raw264.7细胞，分别通过mtt和wst-1测定评估了庆大霉素和tpps2a的允许浓度。培养24小时后，高达250μg/ml的庆大霉素细胞外浓度没有降低raw264.7细胞的代谢活性，因此在进一步的实验中将其选为庆大霉素的最大浓度。

直接地(t＝0)或在照射15分钟后24小时(t＝24)评估了光敏剂tpps2a对raw264.7细胞代谢活性的可能抑制。在0μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml和0.4μg/ml下测试tpps2a。在没有照射的情况下，tpps2a的最高测试浓度，0.4μg/ml，其在任一时间点均未降低代谢活性。照射后，高达0.25μg/ml的tpps2a浓度在任何一个时间点均未降低raw264.7细胞的代谢活性(数据未显示)。因此，在进一步的实验中，选择0.25μg/ml作为tpps2a的最大浓度。

为了研究pci处理单独或与感染组合对细胞生存力的潜在负面影响，单独用tpps2a(0.25μg/ml)处理raw264.7细胞或在表皮葡萄球菌存在下用tpps2a(tpps2a+表皮葡萄球菌)处理raw264.7细胞(细菌与细胞的比例为40:1)，并照射5分钟、10分钟或15分钟。未处理但经照射的细胞用作对照。测量碘化丙啶的流入以直接地(t＝0)和在照射后1小时(t＝1)定量生存力的损失。这样的照射不影响细胞生存力。tpps2a处理导致在照射5分钟、10分钟或15分钟后细胞生存力显著降低(数据未显示)。照射10分钟或15分钟tpps2a+表皮葡萄球菌处理的细胞可获得类似的结果(数据未显示)。尽管还观察到照射5分钟tpps2a+表皮葡萄球菌处理的细胞生存力降低，但与未经照射的对照组相比在统计学上没有差异(数据未显示)。

通过pci增强庆大霉素对raw264.7细胞中细胞内表皮葡萄球菌的杀伤作用

为了研究tpps2a-pci是否增强了庆大霉素对细胞内表皮葡萄球菌的杀伤作用，将感染表皮葡萄球菌的raw264.7细胞暴露于仅tpps2a(0.25μg/ml)中、仅庆大霉素(1μg/ml、10μg/ml或30μg/ml)中或各自的庆大霉素-tpps2a组合中(图1)。庆大霉素-tpps2a组合在照射5分钟后对细胞内细菌的杀伤作用未显示出效果(数据未显示)。因此，照射细胞10分钟或15分钟，以未照射的细胞和未处理的经照射的细胞作为对照。在未照射的情况下，与未处理组相比，没有一种处理引起raw264.7细胞中细胞内细菌数量的减少。在照射的情况下，与未处理的经照射的组相比，仅用tpps2a处理不影响表皮葡萄球菌的细胞内存活，这表明光触发的tpps2a活化本身不会杀死细胞内细菌。无论庆大霉素浓度和照射时间如何，仅用庆大霉素进行处理也不会杀死细胞内表皮葡萄球菌。在照射10分钟的情况下，tpps2a-pci显著增强了30μg/ml庆大霉素的杀伤作用(细胞内细菌数量减少了1log)，但没有增强10μg/ml庆大霉素的杀伤作用。在照射15分钟的情况下，用10μg/ml和30μg/ml庆大霉素与tpps2a组合处理的raw264.7细胞中细胞内表皮葡萄球菌的杀伤作用分别显著提高至1log和2.5log的减少。

在照射和未照射的情况下，庆大霉素和tpcs2a在raw264.7细胞中的细胞内分布

为了研究照射后pci是否诱导了庆大霉素的胞质溶胶内释放，可视化了照射和未照射情况下raw264.7细胞中的庆大霉素和光敏剂tpcs2a的细胞内分布(图2)。tpcs2a吸收红光，因此适用于体内应用。因此，选择tpcs2a用于该细胞研究和斑马鱼胚胎的体内研究。在未照射的情况下，庆大霉素和tpcs2a二者都定位于细胞外围的细胞区室内，很可能是内吞囊泡。照射后，两种药剂均释放到胞质溶胶中。庆大霉素似乎聚集在raw264.7细胞的细胞核上。

庆大霉素和tpcs2a单独或组合对斑马鱼胚胎的毒性

为了测试它们对斑马鱼胚胎的毒性，评估了注射分级剂量的庆大霉素(每只胚胎注射的剂量为每1nlpbs0.16ng到16ng，使用1nlpbs作为对照)、tpcs2a(每只胚胎注射的剂量为每1nlpbs2.5*10^-2ng、2.5*10^-3ng和2.5*10^-4ng，使用1nlpbs作为对照)和庆大霉素-tpcs2a组合(注射的剂量为1.6ng和0.8ng单独的gen或与2.5*10^-3ngtpcs2a组合的gen(在1nlpbs中)，以1nlpbs注射作为对照)对存活的影响。庆大霉素和tpcs2a二者均显示出剂量依赖性毒性，最大无毒浓度分别为2ng/胚胎和2.5*1^0-3ng/胚胎(数据未显示)。1.6ng/胚胎或0.8ng/胚胎的庆大霉素和2.5×10^-3ng/胚胎的tpcs2a的组合没有降低胚胎的存活(数据未显示)。最初的组大小为33至36个胚胎。

金黄色葡萄球菌用于斑马鱼胚胎感染的剂量发现和体内的细胞-病原体相互作用的可视化

为了评估斑马鱼胚胎感染实验的合适的金黄色葡萄球菌剂量，在受精后30小时将分级接种物注入血液循环。对于预期挑战剂量(intendedchallengedoses)为100cfu/胚胎、500cfu/胚胎、3000cfu/胚胎和6000cfu/胚胎的组，注射的金黄色葡萄球菌的中位cfu数量分别为150cfu/胚胎、500cfu/胚胎、2750cfu/胚胎和7500cfu/胚胎。组内回收的cfu数量变化很小(图3a)。金黄色葡萄球菌感染的胚胎的死亡与接种剂量成正比(图3b)。3000cfu/胚胎的剂量在注射后4天导致约50％的胚胎死亡(图3b)，这适于评估抗生素治疗的功效，因此被选择用于进一步的实验。

用庆大霉素单独或与tpcs2a组合处理的金黄色葡萄球菌感染的胚胎的存活

为了研究pci是否增强了庆大霉素对体内葡萄球菌感染的抗微生物功效，将金黄色葡萄球菌感染的斑马鱼胚胎用庆大霉素单独或与tpcs2a组合处理。注射的金黄色葡萄球菌的中位cfu数量确定为2850cfu/胚胎(数据未显示)。与pbs模拟处理相比，所有用庆大霉素进行的处理(有或无tpcs2a)均显著提高了存活(图4)。与仅用0.1ng庆大霉素单独处理相比，将tpcs2a添加到0.1ng庆大霉素中显著改善了治疗结果，从而获得与0.4ng庆大霉素处理相似的存活水平。这表明pci增强了庆大霉素对金黄色葡萄球菌感染的抗微生物活性，并降低了功效所需的剂量。但是，最小的庆大霉素剂量是观察tpcs2a增强效果所必需的，因为当用0.05ng庆大霉素处理胚胎时tpcs2a并未提高功效(图4)。

结论

已显示pci增强了庆大霉素(一种在细胞内具有有限抗微生物功效的抗生素)在体外和体内对细胞内葡萄球菌的细胞内活性。在raw264.7细胞中，照射后pci诱导庆大霉素的胞质溶胶释放，并增加了被吞噬的细胞内葡萄球菌的根除。在通过吞噬作用内化有金黄色葡萄球菌的斑马鱼胚胎模型中，pci增强了庆大霉素处理对(细胞内)金黄色葡萄球菌感染的功效，并降低了所需剂量。这些结果首次证明pci增强了抗生素对涉及细胞内细菌的感染的细胞内活性。

在本研究中，尽管在照射后观察到对raw264.7细胞有一定的细胞毒性，但是处理后斑马鱼胚胎的pci-庆大霉素组合处理并未负面影响斑马鱼胚胎的存活。这些结果表明，pci可能在体外对细胞造成中等水平的损伤，但在体内增强其抗生素活性所需的水平下却不会导致斑马鱼胚胎死亡。

这允许在向被感染区域实施照射后位点特异地应用pci介导的(细胞内)感染治疗。结果，可以大大降低光敏剂对未照射区域中的正常组织和细胞的潜在副作用。

在已报道的实验中，在用raw264.7细胞进行的体外测定中，有必要让细胞在吞噬细菌后保持存活，以便能够记录治疗后的细胞内杀伤作用。因此，使用表皮葡萄球菌，因为这些细菌可以存活，但在体外不能在巨噬细胞内剧烈繁殖(lemaireetal.,2010,antimicrob.agentsch.,54(6),p2549-2559)。但是，在斑马鱼胚胎模型中，应通过抗微生物处理使胚胎免于迅速死亡，因此需要一种能够杀死胚胎的细菌性病原体。表皮葡萄球菌即使在静脉内注射每胚胎约3.8×10⁴cfu的非常高的接种物后也没有杀死胚胎(数据未显示)。因此，以其能够在斑马鱼胚胎中引起快速传播感染而闻名的金黄色葡萄球菌(prajsnaretal.,2008,supra)被用于本发明的体内研究。在斑马鱼胚胎的早期发育阶段，金黄色葡萄球菌的清除主要依赖于巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用(prajsnaretal.,2008,supra)，巨噬细胞和中性粒细胞均在受精后30小时在胚胎中起作用(tredeetal.,2004,immunity,20(4),p367-379)。与其他使用斑马鱼胚胎的研究(prajsnaretal.,2008,supra；prajsnaretal.,2012,supra)类似，在本研究中，在注射后2小时就观察到金黄色葡萄球菌和吞噬细胞的共定位，表明在此期间发生了有效的吞噬作用。这强调了斑马鱼胚胎感染模型与测试抗生素的细胞内活性的相关性。

细胞内积累的抗生素的量对于杀死细胞内细菌的功效至关重要(seraletal.,2003,supra；和barcia-macayetal.,2006,antimicrob.agentsch.,50(3),p841-851)。因此，在吞噬表皮葡萄球菌的raw264.7细胞的体外模型中，将细胞暴露于相对较高浓度的庆大霉素(10μg/ml和30μg/ml)中2小时。即使具有如此高的细胞外浓度，庆大霉素也未杀死细胞内表皮葡萄球菌。令人惊讶的是，将治疗与pci的使用组合显著提高了庆大霉素的抗微生物功效(图1)。在斑马鱼胚胎金黄色葡萄球菌感染模型中，体内观察到了类似的pci的功效增强效果。pci显著增强了庆大霉素治疗金黄色葡萄球菌感染的胚胎的结果，并降低了所需剂量(图4)。但是，在体外或体内均未观察到pci对最低剂量庆大霉素功效的影响，表明足够量的细胞内庆大霉素是先决条件。增加庆大霉素的摄取时间，预期将在低抗生素剂量下实现pci增强的功效。

有趣的是，照射后，释放的庆大霉素分子似乎聚集在raw264.7细胞的细胞核(图2)。该观察结果与已报道的、庆大霉素可与肾细胞核结合的结果一致(myrdaletal.,2005,hearingres.,204(1-2),p156-169)。尽管理论上这种结合可能会减少胞质溶胶中游离的庆大霉素的量，但仍观察到pci增强了庆大霉素的功效。因此，通过pci实现的不显示细胞核结合的抗生素的细胞内活性的增强可能会更为显著。

细菌和抗生素分子的不同亚细胞位置也可能会影响抗生素的细胞内活性(carryn,2003,supra)。吞噬作用后，包括葡萄球菌在内的几种菌种主要被吞噬体诱捕，无法被其他囊泡中摄取的抗生素有效根除(seraletal.,2003,supra；barcia-macayetal.,2006,supra；和bernardoandsimons,2009,cytom.parta,77a(3),p10)。在本发明的研究中，推测在照射期间，在破坏含有抗生素的核内体后，(部分)离解的光敏剂可能会重新定位于含有细菌的吞噬体的膜上，并且也会破坏这些膜。因此，存在于吞噬体中的至少一部分细菌可以被释放到胞质溶胶中，并被庆大霉素更快地杀死。也有可能的是，在pci期间，通过光敏剂的光激活而破裂的囊泡可能会与完整的其他囊泡在细胞内融合，导致甚至在没有额外照射的情况下，完整的囊泡也会渗漏/破裂。因此，这种融合也可能(部分地)促进细菌和抗生素的胞质溶胶释放，从而促进细胞内的抗微生物作用。因此，基于这些实验，pci也有望改善其他抗生素，如万古霉素、奥利万星和各种大环内酯类的细胞内活性。因此，这可以防止由于此类抗生素在细胞内的低允许浓度而引起的耐药性发展。因此，pci能够增加可成功治疗细胞内感染的抗生素数量。此外，使用pci可以减少所需的抗生素剂量。

本实验说明pci可用于改善细胞内感染的抗生素治疗并帮助预防耐药性的发展。

实施例2：通过pci增强万古霉素对细胞内葡萄球菌感染的抗菌功效

与实施例1相比，进行了相似的实验，只是将万古霉素用作抗菌剂。

方法和结果

pci将万古霉素从内吞囊泡重新定位到巨噬细胞的胞质溶胶中。

为了研究pci处理是否可以使万古霉素从巨噬细胞的内吞囊泡中释放，使用raw264.7巨噬细胞细胞系进行了实验，研究了荧光标记的万古霉素和tpcs2a在照射前后的细胞内定位。

将巨噬细胞系raw264.7用1μg/mltpcs2a和50μg/mlfl-万古霉素(lifetechnologies)(vanco-fl)培养18小时。将细胞在无药培养基中洗涤2次，并在无药培养基中培养4小时，然后用lumisource照射120s。在照射前(a)和照射后(b)通过荧光显微镜对tpcs2a和fl-万古霉素的细胞内定位进行分析，使用如下滤光片设置：tpcs2a：激发：带通：395-440nm，二向色分束器460nm。发射：长通620nm。bodipy：激发：带通：450-490nm。发射：带通500-550nm。结果如图5所示。

可以看出，在照射前(图5a)，万古霉素和tpcs2a二者都定位于细胞内的小斑点中，对应于内吞囊泡，而万古霉素和tpcs2a在很大程度上共定位于同一囊泡中(“合并”组中的亮斑点)。照射后，万古霉素和tpcs2a从内吞囊泡中释放出来，可以从图5b中清楚地看到，离散的细胞内斑点消失，荧光化合物在整个细胞体内扩散定位。这表明pci能够将万古霉素从细胞内囊泡释放到细胞的胞质溶胶中。

在图6中甚至可以更清楚地看到pci的效果，在该图中还可以定量比较pci前后的万古霉素-bodipy荧光。可以看出，除了诱导万古霉素从内吞囊泡到细胞胞质溶胶的细胞内重新定位外，pci似乎还诱导了来自万古霉素-bodipy的荧光信号的强烈增加。其可能的原因是万古霉素分子聚集在核内体中，并在释放到胞质溶胶中更大的分布体积时发生解聚。众所周知，荧光分子的聚集导致荧光猝灭，并且来自聚集物中荧光团的荧光将在解聚时显著增加。由于聚集的分子通常将无法与治疗靶点相互作用，因此pci后出现的解聚将进一步增强可以由pci实现的抗微生物活性。

pci增强了万古霉素在斑马鱼胚胎中的抗微生物效果。

验证了万古霉素(vanco)单独或与tpcs2a和照射(t)组合对未感染的斑马鱼胚胎的毒性。每个胚胎注射一定剂量的万古霉素(每1nlpbs0.4ng、1.6ng或6.4ng)，或与每1nlpbs2.5*10^-3ngtpcs2a组合。注射后，斑马鱼胚胎在含e3培养基的陪替氏培养皿(petri-dish)中分组保存。将待照射的陪替氏培养皿放在lumisource照射装置上，将胚胎照射10分钟。最初的组大小是27到29个胚胎。

每个未感染的胚胎注射0.4-6.4ng剂量的万古霉素，显示出对斑马鱼胚胎的剂量依赖性毒性，在注射后6天(dpi)引起大约5％至20％的胚胎死亡，数据未显示。万古霉素和tpcs2a/照射的组合引起更强的毒性，约20-40％的胚胎在6dpi时死亡(数据未显示)。

为了研究pci是否增强了万古霉素对金黄色葡萄球菌感染的抗微生物功效，将金黄色葡萄球菌感染的斑马鱼胚胎用万古霉素单独(0.4ng)或与tpcs2a(2.5*10^-3ng)组合处理。pbs模拟处理用作对照。注射后，斑马鱼胚胎在含e3培养基的陪替氏培养皿中分组保存。将陪替氏培养皿培养皿放在lumisource照射装置上，将胚胎照射10分钟。最初的组大小是29到30个胚胎。使用log-rank测试分析万古霉素单独组与万古霉素-tpcs2a/照射组之间的存活差异，*p≤0.033。

注射的金黄色葡萄球菌的中位cfu数量被确定为4300cfu/胚胎。可以看出(图7)，虽然万古霉素单独对被感染的胚胎的存活没有影响，但万古霉素+tpcs2a/照射(t)组合显著延迟了感染介导的存活降低。值得注意的是，根据毒性测试(上文所讨论，数据未显示)，万古霉素+tpcs2a/照射组合本身比万古霉素单独引起更多的胚胎死亡(至少高出15％)，这意味着pci对万古霉素的抗微生物效果的增强效果可能甚至比图7所示的要强。