组合施用嵌合抗原受体免疫疗法与4-1BB激动剂的方法与流程
本公开内容一般涉及t细胞疗法并且更具体地涉及包含嵌合抗原受体(car)的cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法。
背景技术：
人类癌症从本质上说是由已经经过遗传或表观遗传转化为异常癌细胞的健康细胞组成。通过这样做，癌细胞开始表达不同于健康细胞表达的蛋白质和其他抗原。这些异常的肿瘤抗原可以被身体的先天免疫系统用来特异性靶向并杀死癌细胞。但是，癌细胞采用各种机制来防止免疫细胞(例如，t淋巴细胞和b淋巴细胞)成功靶向癌细胞。
嵌合抗原受体(car)包含能够与特定肿瘤抗原相互作用的结合结构域，使得被诱导表达它们的t细胞靶向并杀死表达它们所识别的特定肿瘤抗原的癌细胞。
4-1bb(也称为cd137，tnfrsf9等)是肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrs)的跨膜蛋白。4-1bb促进增强的细胞增殖、存活和细胞因子产生(croft，2009，natrevimmunol9:271-285)。
技术实现要素：
如以下详细描述的，本公开内容部分地基于令人惊讶的发现，即本文公开的施用方法导致改善的抗cd19cart细胞免疫疗法。
除非上下文另外指出，否则本文描述的任何方面或实施方式可以与本文公开的任何其他方面或实施方式组合。尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在示例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
在一方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗b细胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，对cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)，所述car包含与cd28和cd3-ζ共刺激结构域连接的抗cd19单链可变片段(scfv)。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是自体免疫疗法。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是同种异体免疫疗法。
在一些实施方案中，对t细胞进行离体遗传修饰。在一些实施方案中，通过病毒转导对t细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，通过逆转录病毒转导对t细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，通过慢病毒转导对t细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是axicabtageneciloleucel。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是抗原结合分子或其片段。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列的三个cdr和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列的三个cdr。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含：(a)seqidno：5所示的h-cdr1；(b)seqidno：6所示的h-cdr2；(c)seqidno：7所示的h-cdr3；(d)seqidno：8所示的l-cdr1；(e)seqidno：9所示的l-cdr2；和(f)seqidno：10所示的l-cdr3。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是完全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：2所示的重链氨基酸序列和seqidno：4所示的轻链氨基酸序列，前提条件是任选地不存在seqidno：2的c末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是utomilumab。
在一些实施方案中，b细胞淋巴瘤或白血病选自急性成淋巴细胞性白血病(all)、aids相关淋巴瘤、alk阳性大b细胞淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)、滤泡性淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、在hhv8相关多中心castleman病中出现的大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘区b细胞淋巴瘤(mzl)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤(nmzl)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、和
在一些实施方案中，b细胞淋巴瘤选自复发性或难治性大b细胞淋巴瘤、未另外指明的弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)、高级别b细胞淋巴瘤和发生自滤泡性淋巴瘤的dlbcl。swerdlow等人,blood2016127:2375-2390；doi:https://doi.org/10.1182/blood-2016-01-643569在2016年修订的淋巴样肿瘤的世界卫生组织分类中描述了各种其他淋巴瘤类型。
在一些实施方案中，b细胞淋巴瘤是复发性或难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，在二线或更多线全身疗法之后向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂。在一些实施方案中，向未治疗的患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂。在一些实施方案中，在施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂之前，向未接受其他全身疗法的患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，以每kg体重约1×106至约2×106个car阳性活t细胞的剂量，多至约1x108个car阳性活t细胞的最大剂量，通过静脉内输注向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法。
在一些实施方案中，仅施用一次cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法。
在一些实施方案中，多次施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法。
在一些实施方案中，通过静脉内输注施用4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，以约1mg至约200mg的剂量施用4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，以约1mg、约10mg、约100mg或约200mg的剂量施用4-1bb(cd137)激动剂。在一些实施方案中，以约1-200mg、约1-150mg、约1-125mg、约1-100mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-125mg，约10-100mg、约25-200mg、约25-150mg、约25-125mg、约25-100mg、约30-200mg、约30-150mg、约30-125mg、约30-100mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-125mg、50-100mg或约100-200mg的剂量施用4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，同时施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，在4-1bb(cd137)激动剂之前施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法。
在一些实施方案中，在cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法输注后的那一天施用第一剂量的4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，在4-1bb(cd137)激动剂之后施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法。
在一些实施方案中，持续进行4-1bb(cd137)激动剂给药，直至患者表现出完全缓解，无应答/进行性疾病。在一些实施方案中，施用4-1bb(cd137)激动剂约1年。
在一些实施方案中，约每4周施用4-1bb(cd137)激动剂。在一些实施方案中，每月施用4-1bb(cd137)激动剂。在一些实施方案中，约每28天施用4-1bb(cd137)激动剂。在一些实施方案中，约每30天施用4-1bb(cd137)激动剂。
在一些实施方案中，在施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂之前，向患者施用调理化疗方案。
在一方面，本发明提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于在有此需要的患者中治疗b细胞淋巴瘤或白血病的方法。
在一方面，本发明提供了在有此需要的患者中治疗b细胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者的不良反应的征候和症状。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是自体免疫疗法。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是同种异体免疫疗法。
在一些实施方案中，对t细胞进行离体遗传修饰。
在一些实施方案中，通过病毒转导对t细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，通过逆转录病毒转导对t细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，通过慢病毒转导对t细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，对cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)，所述car包含与cd28和cd3-ζ共刺激结构域连接的抗cd19单链可变片段(scfv)。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是axicabtageneciloleucel。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是抗原结合分子或其片段。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列的三个cdr和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列的三个cdr。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含：(a)seqidno：5所示的h-cdr1；(b)seqidno：6所示的h-cdr2；(c)seqidno：7所示的h-cdr3；(d)seqidno：8所示的l-cdr1；(e)seqidno：9所示的l-cdr2；和(f)seqidno：10所示的l-cdr3。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是完全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：2所示的重链氨基酸序列和seqidno：4所示的轻链氨基酸序列，前提条件是任选地不存在seqidno：2的c末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是utomilumab。
在一些实施方案中，b细胞淋巴瘤或白血病选自急性成淋巴细胞性白血病(all)、aids相关淋巴瘤、alk阳性大b细胞淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)、滤泡性淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、在hhv8相关多中心castleman病中出现的大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘区b细胞淋巴瘤(mzl)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤(nmzl)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、和
在一些实施方案中，b细胞淋巴瘤选自复发性或难治性大b细胞淋巴瘤、未另外指明的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、高级别b细胞淋巴瘤和发生自滤泡性淋巴瘤的dlbcl。
在一些实施方案中，b细胞淋巴瘤是难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，不良反应选自细胞因子释放综合征(crs)、神经毒性、超敏反应、严重感染、血细胞减少症和低丙种球蛋白血症。
在一方面，本发明提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于在有此需要的患者中治疗b细胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者的不良反应的征候和症状。
在一方面，本发明提供了在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者在患者外周血单核细胞(pbmc)的表型和活化标志物中的变化。
在一方面，本发明提供了在二线或更多线全身疗法之后在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者在患者外周血单核细胞(pbmc)的表型和活化标志物中的变化。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是自体免疫疗法。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是同种异体免疫疗法。
在一些实施方案中，对t细胞进行离体遗传修饰。
在一些实施方案中，通过逆转录病毒转导对t细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，对cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)，所述car包含与cd28和cd3-ζ共刺激结构域连接的抗cd19单链可变片段(scfv)。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是axicabtageneciloleucel。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是抗原结合分子或其片段。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列的三个cdr和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列的三个cdr。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含：(a)seqidno：5所示的h-cdr1；(b)seqidno：6所示的h-cdr2；(c)seqidno：7所示的h-cdr3；(d)seqidno：8所示的l-cdr1；(e)seqidno：9所示的l-cdr2；和(f)seqidno：10所示的l-cdr3。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是完全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：2所示的重链氨基酸序列和seqidno：4所示的轻链氨基酸序列，前提条件是任选地不存在seqidno：2的c末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是utomilumab。
在一些实施方案中，患者pbmc的表型和活化标志物包括泛t细胞标志物、细胞毒性t细胞标志物、分化t细胞标志物、分化标志物、il-2受体、活化标志物、pd1、4-1bb、辅助t细胞标志物、粒细胞标志物、b细胞标志物、单核细胞/巨噬细胞标志物、nk细胞标志物和/或axicabtageneciloleucel鉴定。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd8、cd45ra、ccr7、cd122、cd27、cd28、cd95和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd8、cd45ra、ccr7、cd57、cd107α、cd279和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd8、cd45ra、ccr7、cd25、cd69、cd137和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd4、cd8、cd66b、cd19、cd14、cd56和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过流式细胞术测定法测定标志物。
在一方面，本发明提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者在患者外周血单核细胞(pbmc)的表型和活化标志物中的变化。
在一方面，本发明提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于在二线或更多线全身疗法之后在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者血清中的趋化因子、细胞因子和/或免疫效应子水平。
在一方面，本发明提供了在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者血清中的趋化因子、细胞因子和/或免疫效应子水平。
在一方面，本发明提供了在二线或更多线全身疗法之后在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者血清中的趋化因子、细胞因子和/或免疫效应子的水平。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是自体免疫疗法。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是同种异体免疫疗法。
在一些实施方案中，对t细胞进行离体遗传修饰。
在一些实施方案中，通过逆转录病毒转导对t细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，对cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)，所述car包含与cd28和cd3-ζ共刺激结构域连接的抗cd19单链可变片段(scfv)。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是axicabtageneciloleucel。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是抗原结合分子或其片段。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列的三个cdr和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列的三个cdr。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含：(a)seqidno：5所示的h-cdr1；(b)seqidno：6所示的h-cdr2；(c)seqidno：7所示的h-cdr3；(d)seqidno：8所示的l-cdr1；(e)seqidno：9所示的l-cdr2；和(f)seqidno：10所示的l-cdr3。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是完全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)包含seqidno：2所示的重链氨基酸序列和seqidno：4所示的轻链氨基酸序列，前提条件是任选地不存在seqidno：2的c末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是utomilumab。
在一些实施方案中，监测患者血清中的il-15、il-7、il-2、il-6、il1α、il-1β、il-17α、tnfα、tnfβ、gm-csf、crp、saa、il-13、il-4、il-5、il-10、ifnγ、il-12p40、il-12p70、il-16、il-8、mcp-1、mcp-4、mip-1α、mip-1β、ip-10、tarc、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3、mdc、粒酶a、粒酶b、sfasl、穿孔素、fgf-2、sicam-1、svcam-1、vegf、vegf-c、vegf-d、plgf、il1rα、il1rβ和/或铁蛋白。
在一些实施方案中，使用多重测定法测定趋化因子、细胞因子和/或免疫效应子水平。
在一方面，本发明提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于在二线或更多线全身疗法之后在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫治疗；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后监测患者血清中的趋化因子、细胞因子和/或免疫效应子水平。
在一方面，本发明提供了在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后就消退[完全应答(cr)或部分应答(pr)]、对治疗是难治的[进行性疾病(pd)]、复发或持续而无进展或完全消退的证据[长期pr或稳定疾病(sd)]对患者应答进行分析。
在一方面，本发明提供了在二线或更多线全身疗法之后在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后就消退[完全应答(cr)或部分应答(pr)]、对治疗是难治的[进行性病(pd)]、复发或持续而无进展或完全消退的证据[长期pr或稳定疾病(sd)]对患者应答进行分析。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是自体免疫疗法。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是同种异体免疫疗法。
在一些实施方案中，对t细胞进行离体遗传修饰。
在一些实施方案中，通过逆转录病毒转导对t细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，对cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)，所述car包含与cd28和cd3-ζ共刺激结构域连接的抗cd19单链可变片段(scfv)。
在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法是axicabtageneciloleucel。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是抗原结合分子或其片段。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列的三个cdr和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列的三个cdr。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含：(a)seqidno：5所示的h-cdr1；(b)seqidno：6所示的h-cdr2；(c)seqidno：7所示的h-cdr3；(d)seqidno：8所示的l-cdr1；(e)seqidno：9所示的l-cdr2；和(f)seqidno：10所示的l-cdr3。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是完全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂包含seqidno：2所示的重链氨基酸序列和seqidno：4所示的轻链氨基酸序列，前提条件是任选地不存在seqidno：2的c末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是utomilumab。
在一些实施方案中，在施用后就消退[完全应答(cr)或部分应答(pr)]、对治疗是难治的[进行性疾病(pd)]、复发或持续而无进展或完全退化的证据[长期pr或稳定疾病(sd)]对患者应答进行分析包括监测患者pbmc的表型和活化标志物，包括泛t细胞标志物、细胞毒性t细胞标志物、分化t细胞标志物、分化标志物、il-2受体、活化标志物、pd1、4-1bb、辅助t细胞标志物、粒细胞标志物、b细胞标志物、单核细胞/巨噬细胞标志物、nk细胞标志物和/或axicabtageneciloleucel鉴定。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd8、cd45ra、ccr7、cd122、cd27、cd28、cd95和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd8、cd45ra、ccr7、cd57、cd107α、cd279和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd8、cd45ra、ccr7、cd25、cd69、cd137和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过包括针对cd3、cd4、cd8、cd66b、cd19、cd14、cd56和/或cd19car的抗体的组监测患者pbmc的表型和活化标志物。
在一些实施方案中，通过流式细胞术测定法测定标志物。
在一些实施方案中，监测患者血清中的il-15、il-7、il-2、il-6、il1α、il-1β、il-17α、tnfα、tnfβ、gm-csf、crp、saa、il-13、il-4、il-5、il-10、ifnγ、il-12p40、il-12p70、il-16、il-8、mcp-1、mcp-4、mip-1α、mip-1β、ip-10、tarc、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3、mdc、粒酶a、粒酶b、sfasl、穿孔素、fgf-2、sicam-1、svcam-1、vegf、vegf-c、vegf-d、plgf、il1rα、il1rβ和/或铁蛋白。
在一些实施方案中，使用多重测定法测定趋化因子、细胞因子和/或免疫效应子水平。
在一方面，本发明提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于在二线或更多线全身疗法之后在有此需要的患者中治疗难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，其包括：(a)向患者施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法；(b)向患者施用4-1bb(cd137)激动剂；和(c)在施用后就完全应答(cr)、部分应答(pr)、稳定疾病(sd)或进行性疾病(pd)对患者应答进行分析。
本发明还提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于所公开的治疗方法；以及cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂在制备用于所公开的治疗方法的药物中的用途。
根据以下包括实施例和权利要求的详细描述，本公开内容的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
附图仅用于示例说明目的，而不是用于限制。
图1.示例说明了在患有难治性大b细胞淋巴瘤或难治性弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)的受试者中评价kte-c19(axicabtageneciloleucel)与utomilumab组合的安全性和功效的研究设计。
图2a-2c.描述了输注后的前28天(auc0-28)中血液中的抗cd19car水平与以下的关系：a.客观应答率(orr)(完全缓解(cr)或部分缓解(pr))，b.(ne)，并发展出≥3级神经毒性或c.细胞因子释放综合征(crs)。
图3输注后的前28天中，淋巴耗竭化疗和抗cd19cart诱导关键免疫程序的结果。在测量的44个患者的组中，在具有高于基线≥2倍诱导的≥50％的患者中显示分析物升高。通过
图4描绘了与≥3级crs和≥3级神经系统毒性相关的生物标志物。显示了血清分析物的峰值水平与≥3级神经毒性或crs的相关性。比较中使用了axi-celtm输注后的峰值水平。auc，曲线下面积；crs，细胞因子释放综合征；ifn，干扰素；il，白介素，mcp，单核细胞趋化蛋白；ne，神经事件。
图5a-5h抗cd19cart细胞在与cd19+肿瘤细胞共培养中显示出广泛的多功能性。a-d.细胞因子：a.il-2，b.il-4，c.粒酶b，d.ifnγ，e-h.表面标志物：e.cd69，f.cd107α，g.cd137，h.pd1。
图6显示了拟定的活组织检查收集时间表，以使能够分析落入以下四个一般应答类别的样品：1)消退[完全应答(cr)或部分应答(pr)]，2)对治疗是难治的[进行性疾病(pd)]，3)复发或4)持续而无进展或完全消退的证据[长期pr或稳定疾病(sd)]。
图7示例显示了示例性生物标志物样品收集时间表。axi-cel：axicabtageneciloleucel；car：嵌合抗原受体；elisa：酶联免疫吸附测定法；qpcr：定量聚合酶链式反应。
图8示例显示了示例性成对活组织检查收集时间表。
图9示例显示了用于芯针活组织检查的样品处理方案。
图10描绘了用于评价患者活组织检查样品的标志物和分析方法的示意图。
图11显示了utomilumab的抗体序列(重链：seqidno：2，轻链：seqidno：4)和结构特征。
图12描绘了utomilumab的作用机制。
图13示例显示了在患有难治性大b细胞淋巴瘤或难治性弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)的受试者中评价kte-c19(axicabtageneciloleucel)与utomilumab组合的安全性和功效的另一种研究设计。
图14a-14b.抗cd19cart细胞的il-2产生。将细胞与工具抗体(0.33μg/ml)在对照抗体(a)或utomilumab(b)存在的情况下孵育16小时。x轴上的第一个数据点代表仅工具抗体。数据代表一式三份孔的平均值。
发明详述
本发明涉及治疗患者的疾病或病症的方法，其包括组合施用axicabtageneciloleucel(kte-c19)与utomilumab(pf-05082566)(4-1bb(cd137)激动剂完全人igg2单克隆抗体)。axicabtageneciloleucel是一种cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法细胞悬浮液，包含收获的患者自身的t细胞，并且这些细胞是通过逆转录病毒转导进行离体遗传修饰以表达包含与cd28和cd3-ζ共刺激结构域连接的fmc63抗cd19单链可变片段(scfv)的嵌合抗原受体(car)。参见，例如，neelapu等人,clin.adv.hem.onc.,第15卷,第2期(2017)。在一些实施方案中，疾病或病症是淋巴瘤，例如难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)或白血病，例如急性成淋巴细胞性白血病(all)。
为了制备cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法，可以收获患者自身的t细胞并通过逆转录病毒转导进行离体遗传修饰以表达包含与cd28和cd3-ζ共刺激结构域连接的鼠抗cd19单链可变片段(scfv)的嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，car包含与4-1bb和cd3-ζ共刺激结构域连接的鼠抗cd19单链可变片段(scfv)。可以将抗cd19cart细胞扩增并输注回患者体内，在那里他们可以识别并消除表达cd19的靶细胞。yescartatm(axi-celtm；axicabtageneciloleucel)是这种cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的实例。参见，kochenderfer等人，(jimmunother2009；32：689702)。其他cd19定向的car疗法包括jcar017、jcar015、jcar014、kymriah(tisagenlecleucel)。参见，sadelain等人，naturerev.cancer第3卷(2003)，ruella等人，currhematolmaligrep.，spring，ny(2016)和sadelain等人,cancerdiscovery(2013年4月)。
可以从患者的外周血单核细胞制备cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法，外周血单核细胞通常通过标准的白细胞分离术程序获得。可以针对t细胞富集单核细胞并在il-2存在的情况下用抗cd3抗体激活，然后用含有抗cd19car转基因的无复制能力的逆转录病毒载体进行转导。转导的t细胞可以在细胞培养物中扩增、洗涤、配制为悬浮液和/或冷冻保存。通常，包含遗传修饰的自体t细胞的产品在释放之前必须通过无菌测试，以在患者专用输注容器(例如输液袋)中作为冷冻悬浮液运输。通常，在输注之前将产品解冻。
除t细胞外，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法可以包含nk细胞和nk-t细胞。在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法制剂包含约5％二甲基亚砜(dmso)和约2.5％白蛋白(人)(v/v)。
cd19定向的遗传修饰的自体和/或同种异体t细胞可以结合表达cd19的癌细胞和正常b细胞。某些研究已经证明在抗cd19cart细胞与表达cd19的靶细胞结合后，cd28共刺激和cd3ζ激活结构域触发下游信号传导级联反应，从而导致t细胞活化、增殖、效应子功能的获得和炎性细胞因子和趋化因子的分泌。这一系列事件导致杀死表达cd19的细胞。
结合4-1bb并且适用于本发明的抗原结合分子或其片段是4-1bb抗体。在一些实施方案中，抗体是4-1bb激动剂抗体。在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列的三个cdr和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列的三个cdr。在一些实施方案中，抗体结合人4-1bb。在一些实施方案中，4-1bb抗体包含(a)seqidno：5所示的h-cdr1；(b)seqidno：6所示的h-cdr2；(c)seqidno：7所示的h-cdr3；(d)seqidno：8所示的l-cdr1；(e)seqidno：9所示的l-cdr2；和(f)seqidno：10所示的l-cdr3。在一些实施方案中，cd137(4-1bb)抗体包含(1)seqidno：1所示的vh区氨基酸序列，和(2)seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。在一些实施方案中，4-1bb抗体包含seqidno：2所示的重链氨基酸序列和seqidno：4所示的轻链氨基酸序列，前提条件是任选地不存在seqidno：2的c末端赖氨酸残基。在一些实施方案中，4-1bb抗体是完全人单克隆抗体。utomilumab是这种结合人4-1bb的完全人单克隆抗体的实例。
4-1bb对工程化的抗cd19cart细胞的激动作用可以通过以下机制来增强axicabtageneciloleucel的抗肿瘤活性：(1)通过上调抗凋亡蛋白来提高抗cd19cart细胞的生存力，2)增强抗cd19cart细胞的扩增和增殖，和3)促进t细胞免疫应答。
定义
为了使本发明更容易理解，首先在下面定义某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。
如在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。
除非明确说明或从上下文明显看出，否则本文所使用的术语“或”应理解为是包括性的并且涵盖“或”和“与”。
在本文中使用的术语“和/或”应被视为两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，在本文中诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括a和b；a或b；a(单独)；和b(单独)。类似地，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖每个以下方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
如在本文中使用的术语“例如”和“即”仅作为示例使用，而无意于限制，并且不应被解释为仅指代说明书中明确列举的那些项目。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一个”应理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1920、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过指定值。还包括其间更大的数字或分数。
相反，术语“不超过”包括每个小于指定值的值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1920、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、5657、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间更大的数字或分数。
在整个说明书中，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”之类的变体将理解为暗示包括陈述的元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但是不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。应理解的是，无论本文在何处用语言“包括”来描述方面，还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的类似方面。
除非明确说明或从上下文明显看出，否则本文使用的术语“约”是指如本领域普通技术人员所确定的在特定值或组成可接受的误差范围内的值或组成，这将部分取决于如何测量或确定值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“大约”可以表示在一个或多于一个标准偏差之内。“约”或“大约”可以表示多至10％(即±10％)的范围。因此，“约”可以理解为大于或小于指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％之内。例如，约5mg可以包括在4.5mg至5.5mg之间的任何量。此外，特别是对于生物系统或过程而言，这些术语可以表示多至一个数量级或多至值的5倍。当在本公开内容中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“大约”的含义应假定在该特定值或组成可接受的误差范围内。
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。
本文使用的单位、前缀和符号使用其systèmeinternationaldeunites(si)接受的形式提供。数字范围包括定义该范围的数字。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，juo，“theconcisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology”,第2版,(2001),crcpress；“thedictionaryofcell&molecularbiology”,第5版,(2013),academicpress；和“theoxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology”,cammack等人,编辑,第2版,(2006),oxforduniversitypress，为本领域技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的通用词典。
“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将试剂物理引入至受试者。用于本文公开的制剂的示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径(例如，通过注射或输注)。本文使用的短语“肠胃外施用”是指除了肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。在一些实施方案中，通过非肠胃外途径(例如，口服)施用制剂。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段执行施用。
术语“激动剂”是指如本文所定义的抗原结合分子，其与4-1bb结合后，(1)刺激或激活4-1bb，(2)增强、增加、促进、诱导或延长4-1bb的活性、功能或存在，或(3)增强、增加、促进或诱导4-1bb的表达。
术语“抗体”(ab)包括但不限于特异性结合抗原的糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗体可以包括通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，或其抗原结合分子。每个h链包括重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包括三个恒定结构域，ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个恒定结构域，cl。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其被更为保守的区(称为框架区(fr))所间隔。每个vh和vl包含三个cdr和四个fr，其从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。重链和轻链的可变区包括与抗原相互作用的结合结构域。ab的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
抗体可以包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化的抗体、人源化的抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合体(有时在本文中称为“抗体缀合物”)、异源缀合物抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链fv(scfv)、骆驼化的抗体、亲和体、fab片段、f(ab')2片段、二硫键连接的fv(sdfv)、抗独特型(抗id)抗体(包括例如抗抗(anti-anti)id抗体)、小抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)以及上述任何的抗原结合片段。在一些实施方案中，本文描述的抗体是指多克隆抗体群体。
“抗原结合分子”、“抗原结合部分”或“抗体片段”是指包含衍生该分子的抗体的抗原结合部分(例如，cdr)的任何分子。抗原结合分子可以包括抗原互补决定区(cdr)。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、和fv片段、dab、线性抗体、scfv抗体和由抗原结合分子形成的多特异性抗体。肽体(即，包含肽结合结构域的fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个实例。在一些实施方案中，抗原结合分子结合肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合参与过度增殖性疾病的细胞上的抗原或者病毒或细菌抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合cd19。在一些实施方案中，抗原结合分子结合4-1bb(cd137)。在进一步的实施方案中，抗原结合分子是特异性结合抗原的抗体片段，包括其一个或多个互补决定区(cdr)。在进一步的实施方案中，抗原结合分子是单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，抗原结合分子包含avimer或由其组成。
“抗原”是指引起免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可以涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的活化，或两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。抗原可以内源表达，即由基因组dna表达，或者可以重组表达。抗原可以特异于某些组织(例如，癌细胞)，或者可以广泛表达。另外，较大分子的片段可以充当抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。
术语“抗体衍生物”或抗体的“衍生物”是指能够结合抗体结合的相同抗原(例如，4-1bb)并包含与附加分子实体连接的抗体的氨基酸序列的分子。抗体衍生物中包含的抗体的氨基酸序列可以是抗体的全长重链、全长轻链、全长重链的任何部分或多个部分、全长轻链的任何部分或多个部分、抗体的任何其他一个或多个片段或完整抗体。附加分子实体可以是化学分子或生物学分子。附加分子实体的实例包括化学基团、氨基酸、肽、蛋白质(例如，酶、抗体)和化合物。附加分子实体可以具有任何用途，例如，用作检测剂、标记物、标志物、药剂或治疗剂。抗体的氨基酸序列可以通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式附着或连接至附加分子实体。术语“抗体衍生物”还涵盖嵌合抗体、人源化抗体和衍生自4-1bb抗体的氨基酸序列修饰的分子，修饰例如保守氨基酸置换、添加和插入。
术语“人抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。术语“人抗体”无意包括包含非人抗原结合残基的嵌合或人源化的抗体。
“cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法”是指嵌合抗原受体(car)阳性t细胞的悬浮液。这种免疫疗法的一个实例是axicabtageneciloleucel(也称为axi-celtm，yescartatm)，由kitepharmaceuticals，inc.开发。
术语“中和”是指结合配体并防止或降低该配体的生物学作用的抗原结合分子、scfv、抗体或其片段。在一些实施方案中，抗原结合分子、scfv、抗体或其片段直接阻断配体上的结合位点，或通过间接方式(例如，配体中的结构或能量改变)改变配体的结合能力。在一些实施方案中，抗原结合分子、scfv、抗体或其片段阻止与其结合的蛋白质执行生物学功能。
术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们可以被合成而不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，或者可以使用重组dna方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。还可以使用例如clackson等人，nature，352:624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
术语“自体”是指衍生自相同个体并其后再次引入该个体的任何材料。例如，本文所述的工程化的自体细胞治疗(eacttm)方法涉及从患者收集淋巴细胞，然后将其工程化以表达例如car构建体，并且然后施用回同一患者。
术语“同种异体”是指衍生自一个个体并然后引入相同物种的另一个个体的任何材料，例如同种异体t细胞移植。
术语“转导”和“转导的”是指通过病毒载体将外源dna引入细胞的过程(参见，jones等人，“genetics：principlesandanalysis”，boston：jones&bartlettpubl.(1998))。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、dna载体、rna载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、epstein-barr病毒载体、乳头病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。
“癌症”是指广泛的各种疾病，特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，其侵袭邻近组织并且还可以通过淋巴系统或血液转移到身体的远端部分。“癌症”或“癌组织”可以包括肿瘤。可以通过本文公开的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于减少衍生自例如以下的肿瘤的肿瘤尺寸：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、多发性骨髓瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbc)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(all)(包括非t细胞all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌，肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的肿瘤(cns)、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境引起的癌症包括石棉引起的那些癌症、其他b细胞恶性肿瘤以及所述癌症的组合。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。特定癌症可能对化学疗法或放射疗法有应答，或者癌症可能是难治性的。难治性癌症是指无法通过外科手术干预进行修正的癌症，并且该癌症最初对化学疗法或放射疗法无应答，或者该癌症随着时间的推移而变得无应答。
本文使用的“肿瘤”是指在细胞分裂得比其应有的更快或在应有的情况下不死时产生的异常组织块。肿瘤可以是良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。肿瘤也被称为“赘生物”。“实体瘤”是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。实体瘤的实例是肉瘤和癌。相反地，“液体肿瘤”(例如，淋巴瘤和白血病(也称为血液癌症))通常不形成实体瘤。
本文使用的“抗肿瘤作用”是指可表现为肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、转移数量减少、总体或无进展生存期增加、预期寿命增加或与肿瘤相关的各种生理症状改善的生物学作用。抗肿瘤作用还可以指预防肿瘤的发生，例如疫苗。
本文使用的“细胞因子”是指响应于与特定抗原接触而由一种细胞释放的非抗体蛋白，其中细胞因子与第二种细胞相互作用以介导在第二种细胞中的应答。本文使用的“细胞因子”是指由一种细胞群释放作为细胞间介体而作用于另一细胞的蛋白质。细胞因子可以由细胞内源表达或施用给受试者。细胞因子可由免疫细胞(包括巨噬细胞、b细胞、t细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可以在受体细胞中诱导多种应答。细胞因子可以包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎细胞因子、效应子和急性期蛋白质。例如，包括白介素(il)7和il-15在内的稳态细胞因子促进免疫细胞存活和增殖，以及促炎细胞因子可以促进炎症反应。稳态细胞因子的实例包括但不限于il-2、il-4、il-5、il-7、il-10、il-12p40、il-12p70、il-15和干扰素(ifn)γ。促炎细胞因子的实例包括但不限于il-1a、il-1b、il-6、il-13、il-17a、肿瘤坏死因子(tnf)-α、tnf-β、成纤维细胞生长因子(fgf)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、可溶性细胞间粘附分子1(sicam-1)、可溶性血管粘附分子1(svcam-1)、血管内皮生长因子(vegf)、vegf-c、vegf-d和胎盘生长因子(plgf)。效应子的实例包括但不限于粒酶a、粒酶b、可溶性fas配体(sfasl)和穿孔素。急性期蛋白质的实例包括但不限于c反应蛋白(crp)和血清淀粉样蛋白a(saa)。
“趋化因子”是介导细胞趋化性或定向运动的细胞因子。趋化因子的实例包括但不限于il-8、il-16、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3、巨噬细胞衍生趋化因子(mdc或ccl22)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1或ccl2)、mcp-4、巨噬细胞炎症蛋白1α(mip-1α、mip-1a)、mip-1β(mip-1b)、γ诱导蛋白10(ip-10)以及胸腺和激活调节趋化因子(tarc或ccl17)。
治疗剂(例如，工程化的cart细胞)的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独或与另一种治疗剂组合使用时，保护受试者免受疾病发作或促进疾病消退(通过减少疾病症状的严重程度，增加无症状疾病期的频率和持续时间)或者预防由于疾病痛苦导致的障碍或残疾的任何量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评估治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间的人类受试者中，在预测对人的功效的动物模型系统中，或通过在体外测定法中测定试剂的活性。
本文使用的术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(nk)细胞、t细胞或b细胞。nk细胞是一种细胞毒性(细胞有毒的)淋巴细胞，代表固有免疫系统的主要组分。nk细胞排斥肿瘤和被病毒感染的细胞。它通过细胞凋亡或程序性细胞死亡的过程起作用。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要活化即可杀死细胞。t细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中起主要作用。他们的t细胞受体(tcr)将自己与其他淋巴细胞类型区分开。胸腺是免疫系统的专门器官，主要负责t细胞的成熟。t细胞有六种类型，即：辅助t细胞(例如，cd4+细胞)，细胞毒性t细胞(也称为tc、细胞毒性t淋巴细胞、ctl、t杀伤细胞、溶细胞性t细胞、cd8+t细胞或杀伤性t细胞)，记忆t细胞((i)干记忆tscm细胞(例如，幼稚细胞)是cd45ro-、ccr7+、cd45ra+、cd62l+(l-选择素)、cd27+、cd28+和il-7rα+，但它们还表达大量的cd95、il-2rβ、cxcr3和lfa-1，并显示出许多记忆细胞特有的功能属性；(ii)中枢记忆tcm细胞表达l-选择素和ccr7，它们分泌il-2，但不分泌ifnγ或il-4，以及(iii)效应记忆tem细胞，但是，不表达l-选择素或ccr7，但产生效应细胞因子(例如，ifnγ和il-4)，调节性t细胞(treg、抑制性t细胞或cd4+cd25+调节性t细胞)，自然杀伤t细胞(nkt)和γ-δt细胞，另一方面，b细胞在体液免疫(有抗体参与)中起主要作用。它制造抗体和抗原并发挥抗原呈递细胞(apc)的作用，并在通过抗原相互作用活化后转变为记忆b细胞。在哺乳动物中，未成熟的b细胞在其名称所来源的骨髓中形成。
术语“遗传修饰的”、“遗传工程化的”或“工程化的”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于删除编码或非编码区或者其部分，或者插入编码区或其部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞是淋巴细胞，例如t细胞，其可以从患者或供体获得。可以修饰细胞以表达掺入细胞基因组中的外源构建体，例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。
“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如，t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)和这些细胞中的任何或肝脏产生的可溶性大分子(包括ab、细胞因子和补体)的作用，导致选择性地靶向、结合、损害、破坏和/或清除来自脊椎动物体的侵入病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
关于本文定义的结合分子(例如，抗体)与其结合伴侣(例如，抗原)的相互作用，术语“选择性结合”或“选择性结合至”或“选择性靶向”是指结合分子在给定条件下区分来自动物物种的目的抗原(例如，人4-1bb)和来自相同动物物种的不同抗原(例如，人cd40)的能力。如果在体外测定法中4-1bb结合分子结合人4-1bb的ec50低于其结合人cd40或人cd134的ec50的10％，则称为4-1bb结合分子选择性结合人4-1bb。
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法来治疗罹患疾病或者有患上疾病或复发的风险的受试者。免疫疗法的实例包括但不限于t细胞疗法。t细胞疗法可以包括过继性t细胞疗法、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)免疫疗法、自体细胞疗法、工程化的自体细胞疗法(eacttm)和同种异体t细胞移植。但是，本领域技术人员将认识到本文公开的调理方法将增强任何移植的t细胞疗法的功效。t细胞疗法的实例描述在美国专利公开号2014/0154228和2002/0006409、美国专利号7,741,465、美国专利号6,319,494、美国专利号5,728,388和pct公开号wo2008/081035中。
免疫疗法的t细胞可以来自本领域已知的任何来源。例如，可以在体外从造血干细胞群中分化出t细胞，或者可以从受试者获得t细胞。t细胞可以获自例如外周血单核细胞(pbmc)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。另外，t细胞可以衍生自本领域可用的一种或多种t细胞系。还可以使用本领域技术人员已知的任何多种技术，例如ficolltm分离和/或血液单采术，从收集自受试者的血液单位中获得t细胞。分离用于t细胞疗法的t细胞的其他方法公开在美国专利公开号2013/0287748中，其通过引用整体并入本文。
术语“工程化的自体细胞疗法”(可以缩写为“eacttm”)也称为过继细胞转移，是通过其收集患者自己的t细胞并随后对其进行遗传改造以识别和靶向在一种或多种特定肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的一种或多种抗原的过程。可以将t细胞工程化以表达例如嵌合抗原受体(car)。将car阳性(+)t细胞工程化以表达对特定肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变片段(scfv)，其与包含至少一个共刺激结构域和至少一个激活结构域的细胞内信号传导部分连接。carscfv可以设计为靶向例如cd19，cd19是由b细胞谱系中的细胞(包括所有正常b细胞和b细胞恶性肿瘤，包括但不限于未另外指明的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、高级别b细胞淋巴瘤、和由发生自滤泡性淋巴瘤的dlbcl、nhl、cll和非t细胞all)表达的跨膜蛋白。示例性cart细胞疗法和构建体描述在美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中，这些参考文献通过引用整体并入。
本文使用的“患者”包括罹患癌症(例如，淋巴瘤或白血病)的任何人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
本文使用的术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。特别地，体外细胞可以包括t细胞。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用的，该术语是指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)和长链(其在本领域中通常称为蛋白质，其中有很多类型)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
本文使用的“刺激”是指通过刺激性分子与其同源配体的结合而诱导的初级应答，其中结合介导信号转导事件。“刺激性分子”是t细胞上的分子(例如，t细胞受体(tcr)/cd3复合物)，其与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激性配体特异性结合。“刺激性配体”是当存在于抗原呈递细胞(例如，apc、树突细胞、b细胞等)上时可以与t细胞上的刺激性分子特异性结合，从而介导t细胞的初级应答(包括但不限于活化、起始免疫应答、增殖等)的配体。刺激性配体包括但不限于抗cd3抗体、装载有肽的i类mhc分子、超激动剂抗cd2抗体和超激动剂抗cd28抗体。
本文使用的“共刺激信号”是指与诸如tcr/cd3连接和/或活化之类的初级信号(信号1)组合导致t细胞应答的信号，例如但不限于增殖和/或对关键分子的上调或下调。
本文使用的“共刺激配体”包括在抗原呈递细胞上的分子，其特异性结合t细胞上的同源共刺激分子。共刺激配体的结合提供了介导t细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的信号。共刺激配体诱导除了刺激性分子提供的初级信号之外的信号，例如，通过t细胞受体(tcr)/cd3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(mhc)分子的结合。共刺激配体可以包括但不限于3/tr6、4-1bb配体、结合toll配体受体的激动剂或抗体、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、cd30配体、cd40、cd7、cd70、cd83、疱疹病毒进入介体(hvem)、人白细胞抗原g(hla-g)、ilt4、免疫球蛋白样转录物(ilt)3、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、特异性结合b7-h3的配体、淋巴毒素β受体、i类mhc链相关蛋白a(mica)、i类mhc链相关蛋白b(micb)、ox40配体、pd-l2或程序性死亡(pd)l1。共刺激配体包括但不限于与t细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，例如但不限于4-1bb、b7-h3、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd7、icos、与cd83特异性结合的配体、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、自然杀伤细胞受体c(nkg2c)、ox40、pd-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(tnfsf14或light)。
“共刺激分子”能够介导t细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺激通常称为“信号2”。共刺激分子包括但不限于4-1bb/cd137、b7-h3、baffr、blame(slamf8)、btla、cd33、cd45、cd100(sema4d)、cd103、cd134、cd137、cd154、cd16、cd160(by55)、cd18、cd19、cd19a、cd2、cd22、cd247、cd27、cd276(b7-h3)、cd28、cd29、cd3(α；β；δ；ε；γ；ζ)、cd30、cd37、cd4、cd4、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd5、cd64、cd69、cd7、cd80、cd83配体、cd84、cd86、cd8α、cd8β、cd9、cd96(触觉)、cd1-1a、cd1-1b、cd1-1c、cd1-ld、cds、ceacam1、crtam、dap-10、dnam1(cd226)、fcγ受体、gads、gitr、hvem(lightr)、ia4、icam-1、icam-1、icos、igα(cd79a)、il2rβ、il2rγ、il7rα、整联蛋白、itga4、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb2、itgb7、itgb1、kirds2、lat、lfa-1、lfa-1、light、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、ltbr、ly9(cd229)、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1(cd11a/cd18)、i类mhc分子、nkg2c、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80(klrf1)、ox40、pag/cbp、pd-1、psgl1、selplg(cd162)、信号传导淋巴细胞活化分子、slam(slamf1；cd150；ipo-3)、slamf4(cd244；2b4)、slamf6(ntb-a；lyl08)、slamf7、slp-76、tnf、tnfr、tnfr2、toll配体受体、trance/rankl、vla1或vla-6，或者其片段、截短或组合。
本文使用的“共刺激结构域”是指被工程化成car的共刺激分子的全部或部分(片段、截短)或其组合。在一些实施方案中，共刺激结构域衍生自4-1bb/cd137、b7-h3、baffr、blame(slamf8)、btla、cd33、cd45、cd100(sema4d)、cd103、cd134、cd137、cd154、cd16、cd160(by55)、cd18、cd19、cd19a、cd2、cd22、cd247、cd27、cd276(b7-h3)、cd28、cd29、cd3(α；β；δ；ε；γ；ζ)、cd30、cd37、cd4、cd4、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd5、cd64、cd69、cd7、cd80、cd83配体、cd84、cd86、cd8α、cd8β、cd9、cd96(触觉)、cd1-1a、cd1-1b、cd1-1c、cd1-ld、cds、ceacam1、crtam、dap-10、dnam1(cd226)、fcγ受体、gads、gitr、hvem(lightr)、ia4、icam-1、icam-1、icos、igα(cd79a)、il2rβ、il2rγ、il7rα、整联蛋白、itga4、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb2、itgb7、itgb1、kirds2、lat、lfa-1、lfa-1、light、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、ltbr、ly9(cd229)、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1(cd11a/cd18)、i类mhc分子、nkg2c、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80(klrf1)、ox40、pag/cbp、pd-1、psgl1、selplg(cd162)、信号传导淋巴细胞活化分子、slam(slamf1；cd150；ipo-3)、slamf4(cd244；2b4)、slamf6(ntb-a；lyl08)、slamf7、slp-76、tnf、tnfr、tnfr2、toll配体受体、trance/rankl、vla1或vla-6，或者其片段、截短或组合。在一些实施方案中，共刺激结构域衍生自cd28、4-1bb，cd8，cd16、icos。
术语“减少”和“降低”在本文中可以互换使用并且指示任何小于原始值的变化。“减少”和“降低”是相对术语，需要在测量前和测量后之间进行比较。“减少”和“降低”包括完全耗竭。
受试者的“治疗”或“处理”是指在受试者上执行的任何类型的干预或过程，或对受试者施用活性试剂，目的是逆转、缓解、改善、抑制、减慢或预防与疾病相关的症状、并发症或病况或者生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。在一些实施方案中，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括完全缓解。
本文定义的术语“4-1bb抗体”、“cd137抗体”和“4-1bb(cd137)抗体”可以互换使用并且是指能够结合人4-1bb(cd137)受体的抗体。术语“4-1bb”和“4-1bb受体”在本申请中可以互换使用，并且包括人4-1bb受体及其变体、异构体和物种同源物。因此，本文定义和公开的结合分子也可以结合来自人以外的物种的4-1bb。在其他情况下，结合分子可以对人4-1bb是完全特异性的并且可以不表现出物种或其他类型的交叉反应性。这种4-1bb抗体的实例是pfizerinc.开发的utomilumab(pf-05082566)。4-1bb抗体的另一个实例是urelumab(bms-663513)。
本文所使用的二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见immunology-asynthesis(第2版,e.s.golub和d.r.gren,编辑,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))。
在以下小节中进一步详细描述本公开内容的各个方面。
嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(car或car-t)是遗传工程化的受体。根据本领域已知的技术，这些工程化的受体可以容易地插入包括t细胞在内的免疫细胞中并由其表达。使用car，可以对单个受体进行编程，使其既识别特定抗原，又在结合该抗原时激活免疫细胞以攻击并破坏携带该抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达car的免疫细胞可以靶向并杀死肿瘤细胞。
工程化的t细胞及用途
本文描述了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法，用于在二线或更多线全身疗法之后治疗具有复发性或难治性大b细胞淋巴瘤的患者，所述复发性或难治性大b细胞淋巴瘤包括未另行指明的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、高级别b细胞淋巴瘤和发生自滤泡性淋巴瘤的dlbcl。在一些实施方案中，cd19定向的免疫疗法是自体的。在一些实施方案中，cd19定向的免疫疗法是同种异体的。在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法是axicabtageneciloleucel(axi-celtm,yescartatm)。
本公开内容的细胞可以通过获自受试者的t细胞获得。t细胞可以获自例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。另外，t细胞可以衍生自本领域可用的一种或多种t细胞系。还可以使用本领域技术人员已知的任何多种技术，例如ficolltm分离和/或血液单采术，从收集自受试者的血液单位中获得t细胞。在一些实施方案中，洗涤通过血液单采术收集的细胞以去除血浆级分，并将其置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理。在一些实施方案中，用pbs洗涤细胞。应当理解，可以使用洗涤步骤，例如通过使用半自动流通式离心机，例如cobetm2991细胞处理器，baxtercytomatetm等。在一些实施方案中，将洗涤的细胞重悬于一种或多种生物相容性缓冲液或者具有或不具有缓冲液的其他盐溶液中。在一些实施方案中，除去血液单采术样品的不需要的组分。分离用于t细胞疗法的t细胞的其他方法公开于美国专利公开号2013/0287748中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，通过裂解红血细胞并耗竭单核细胞从pbmc分离t细胞，例如通过使用通过percolltm梯度的离心。在一些实施方案中，通过本领域已知的阳性或阴性选择技术进一步分离t细胞的特定亚群，例如cd4+、cd8+、cd28+、cd45ra+和cd45ro+t细胞。例如，可以使用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择的t细胞群的富集。在一些实施方案中，可以使用经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd8、cd11b、cd14、cd16、cd20和hla-dr的抗体。在一些实施方案中，使用流式细胞术和细胞分选来分离用于本公开内容目的细胞群。
在一些实施方案中，使用如本文描述的方法将pbmc直接用于免疫细胞(例如car)的遗传修饰。在一些实施方案中，在分离pbmc之后，进一步分离t淋巴细胞，并且在遗传修饰和/或扩增之前或之后，将细胞毒性和辅助t淋巴细胞分选为幼稚、记忆和效应t细胞亚群。
在一些实施方案中，通过鉴定与这些类型的cd8+细胞的每一种相关的细胞表面抗原，将cd8+细胞进一步分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。在一些实施方案中，中央记忆t细胞的表型标志物的表达包括ccr7、cd3、cd28、cd45ro、cd62l和cd127并且对粒酶b是阴性的。在一些实施方式中，中央记忆t细胞是cd8+、cd45ro+和cd62l+t细胞。在一些实施方案中，效应t细胞对于ccr7、cd28、cd62l和cd127是阴性的并且对粒酶b和穿孔素则是阳性的。在一些实施方案中，将cd4+t细胞进一步分选为亚群。例如，可以通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群将cd4+t辅助细胞分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。
根据本发明使用的合适的序列可以在genbank保藏号hm852952.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/305690546)中找到。另外，已经在例如pct公开号wo2015120096中描述了用于产生和/或制造表达嵌合抗原受体的t细胞的方法，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，使用已知方法在分离后对免疫细胞(例如，t细胞)进行遗传修饰，或者在对免疫细胞进行遗传修饰之前使其在体外被激活和扩增(或在祖细胞的情况下是分化)。在另一个实施方案中，用本文所述的嵌合抗原受体遗传修饰免疫细胞(例如，t细胞)(例如，用包含一个或多个编码car的核苷酸序列的病毒载体进行转导)，并然后在体外活化和/或扩增。用于激活和扩增t细胞的其他方法在本领域中是已知的并且描述在例如美国专利号6,905,874；6,867,041；和6,797,514；以及pct公开号wo2012/079000中，其内容通过引用整体并入本文。通常，这些方法包括在具有合适的细胞因子(例如，il-2)的培养基中使pbmc或分离的t细胞与通常附着于珠粒或其他表面的刺激性试剂和共刺激试剂(例如，抗cd3和抗cd28抗体)接触。附着在同一珠粒上的抗cd3抗体和抗cd28抗体充当“替代”抗原呈递细胞(apc)。一个实例是the
在一些实施方案中，t细胞获自供体受试者。在一些实施方案中，供体受试者是罹患癌症或肿瘤的人类患者。在一些实施方案中，供体受试者是未罹患癌症或肿瘤的人类患者。
在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的承载体、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，组合物包含赋形剂。
在一些实施方案中，选择组合物用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，例如口服。这种药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。在一些实施方案中，使用缓冲剂将组合物维持在生理ph或稍低的ph，通常在约5至约8的ph范围内。在一些实施方案中，当考虑肠胃外施用时，组合物以在药学上可接受的媒介物中的无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式，其包含本文所述的组合物，有或没有其他治疗剂。在一些实施方案中，用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中将本文所述的组合物与或不与至少一种其他治疗剂一起配制为适当保存的无菌等渗溶液。在一些实施方案中，制备涉及将所需分子与聚合化合物(例如，聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体一起配制，以提供产品的受控或持续释放，然后将其通过储库注射进行递送。在一些实施方案中，可植入药物递送装置用于引入所需的分子。
在一些实施方案中，在有此需要的受试者中治疗癌症的方法包括t细胞疗法。在一些实施方案中，本文公开的t细胞疗法是工程化的自体细胞疗法(eacttm)。根据该实施方案，方法可以包括从患者收集血细胞。然后可以将分离的血细胞(例如，t细胞)工程化以表达本文公开的car或tcr。在特定的实施方案中，向患者施用cart细胞或tcrt细胞。在一些实施方案中，cart细胞或tcrt细胞治疗患者的肿瘤或癌症。在一些实施方案中，cart细胞或tcrt细胞减少肿瘤或癌症的尺寸。
在一些实施方案中，用于t细胞疗法的供体t细胞获自患者(例如，用于自体t细胞疗法)。在其他实施方案中，用于t细胞疗法的供体t细胞获自不是患者的受试者。可以以治疗有效量施用t细胞。例如，治疗有效量的t细胞可以是至少约104个细胞、至少约105个细胞、至少约106个细胞、至少约107个细胞、至少约108个细胞、至少约109个或至少约1010个。在另一个实施方案中，治疗有效量的t细胞是约104个细胞、约105个细胞、约106个细胞、约107个细胞或约108个细胞。在一些实施方案中，治疗有效量的cart细胞是约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约2×107个细胞/kg、约3×107个细胞/kg、约4×107个细胞/kg、约5×107个细胞/kg、约6×107个细胞/kg、约7×107个细胞/kg、约8×107个细胞/kg或约9×107个细胞/kg。在一些实施方案中，治疗有效量的car阳性活t细胞是每kg体重约1×106至约2×106个car阳性活t细胞，多至最大剂量为约1×108个car阳性活t细胞。
治疗方法
本文公开的方法可以用于治疗受试者的癌症、减小肿瘤的尺寸、杀死肿瘤细胞、防止肿瘤细胞增殖、防止肿瘤的生长、消除患者的肿瘤、防止肿瘤的复发、防止肿瘤转移、诱导患者的缓解或其任何组合。在一些实施方案中，方法诱导完全应答。在其他实施方案中，方法诱导部分应答。
本发明还提供了cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂，用于所公开的治疗方法；以及cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb(cd137)激动剂在制备用于所公开的治疗方法的药物中的用途。
可以治疗的癌症包括未血管化的、未充分血管化或血管化的肿瘤。癌症还可以包括实体瘤或非实体瘤。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，癌症是白细胞的癌症。在其他实施方案中，癌症是浆细胞的癌症。在一些实施方案中，癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是成人和/或儿科急性成淋巴细胞性白血病(all)(包括非t细胞all)、aids相关淋巴瘤、alk阳性大b细胞淋巴瘤、急性淋巴性白血病(all)、和嗜血细胞性淋巴组织细胞增生症(hlh))、b细胞幼淋巴细胞白血病、b细胞急性淋巴性白血病(“ball”)、未成熟浆细胞样树突细胞瘤、burkitt淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性骨髓性白血病(cml)、慢性髓性白血病(cml)、慢性或急性肉芽肿性疾病、慢性或急性白血病、经典霍奇金淋巴瘤、难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(fl)、毛细胞白血病、嗜血细胞综合征(巨噬细胞活化综合征(mas)、霍奇金病、血管内大b细胞淋巴瘤、大细胞肉芽肿、在hhv8相关多中心castleman病中出现的大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、白细胞粘附缺乏症、恶性淋巴组织增生性病况、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘区淋巴瘤(mzl)、意义不明的单克隆伽玛病(mgus)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征(mds)、髓性疾病包括但不限于急性髓性白血病(aml)、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤(nmzl)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、浆细胞增生性疾病(例如，无症状性骨髓瘤(郁积型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶液质；孤立性骨髓瘤；孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤和多浆细胞瘤)、poems综合征(crow-fukase综合征；takatsuki病；pep综合征)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性病、t细胞急性淋巴性白血病(“tall”)、t细胞淋巴瘤、转化性滤泡性淋巴瘤、
在一些实施方案中，癌症是急性成淋巴细胞性白血病(all)、aids相关淋巴瘤、alk阳性大b细胞淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)、滤泡性淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、在hhv8相关多中心castleman病中出现的大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘区b细胞淋巴瘤(mzl)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤(nmzl)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、和
在一些实施方案中，癌症是骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是白血病。在一些实施方案中，癌症是急性髓性白血病。
本公开内容提供的结合分子和药物组合物可以用于治疗、诊断或其他目的，例如增强免疫应答、治疗癌症、增强组合疗法的功效、增强疫苗功效或治疗自身免疫性疾病。在一些方面，本公开内容提供了治疗哺乳动物的病症的方法，其包括向需要治疗的人施用治疗有效量的cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和4-1bb激动剂。
在一些实施方案中，病症是癌症。可以通过本公开内容提供的方法来治疗或预防其中涉及4-1bb的多种癌症(无论是恶性还是良性以及是原发性的还是继发性的)。这种癌症的实例包括肺癌，例如支气管癌(例如鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌和腺癌)、肺泡细胞癌、支气管腺瘤、软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌症，例如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌，例如骨软骨瘤、软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、类骨质骨瘤、巨细胞瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网状细胞肉瘤；脑癌，例如神经胶质瘤(例如多形胶质母细胞瘤)、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脊索瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、松果体瘤、骨瘤、血管母细胞瘤、颅咽管瘤、脊索瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、皮样囊肿和血管瘤；消化系统癌症，例如平滑肌瘤、表皮样癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、肠脂瘤、肠神经纤维瘤、肠纤维瘤、大肠息肉和结直肠癌；肝癌，例如肝细胞腺瘤、血管瘤、肝细胞癌、纤维状层癌、胆管癌、肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌，例如肾腺癌、肾细胞癌、肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液癌症，例如急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性髓性(髓细胞性、骨髓性、成髓细胞性、骨髓单核细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病(例如sezary综合征和毛细胞白血病)、慢性髓细胞性(髓性、骨髓性、粒细胞性)淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、蕈样真菌病和骨髓增生性病症(包括骨髓增生性病症，例如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、血小板增多症和慢性粒细胞性白血病)；皮肤癌，例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卡波济肉瘤和佩吉特氏病；头颈癌；与眼有关的癌症，例如视网膜母细胞瘤和眼内黑色素癌；男性生殖系统癌症，例如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症，例如子宫癌(子宫内膜癌)、子宫颈癌(宫颈癌)、卵巢的癌症(卵巢癌)、外阴癌、阴道癌、输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状、滤泡状、间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；以及血液系统癌症，例如白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，方法进一步包括施用一种或多种化疗剂。在一些实施方案中，选择一种或多种化疗剂作为淋巴耗竭(预调理)化疗剂。有益的预调理治疗方案在例如美国专利号9,855,298中提出，并在pct专利申请pct/us2016/034885中描述了相关的有益生物标志物，其内容通过引用整体并入本文。这些描述了例如调理需要t细胞疗法的患者的方法，包括向患者施用特定有益剂量的环磷酰胺(cytoxantm)(约200mg/m2/天至约2000mg/m2/天之间)和特定剂量的氟达拉滨(fludarabine)(fludaratm)(约20mg/m2/天至约900mg/m2/天)。一种这样的优选剂量方案涉及治疗患者，包括在向患者施用治疗有效量的工程化的t细胞之前，每天向患者施用约500-600mg/m2/天的环磷酰胺和约30mg/m2/天的氟达拉滨，持续三天。优选的细胞剂量包括但不限于1×106至约5×106个工程化的cart细胞/kg。
在一些实施方案中，分别以有效治疗受试者的疾病或病况的量施用抗原结合分子(例如，4-1bb(cd137)激动剂)、转导的(或以其他方式工程化的)细胞(例如，car)和化疗剂。
在一些实施方案中，包含本文公开的表达car的免疫效应细胞的组合物可以与任何数量的化疗剂联合施用。化疗剂的实例包括，烷化剂类，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐类，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamineresume)；氮芥类(nitrogenmustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素c(cactinomycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非美素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸蝶呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-fu；雄性激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；胺苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
在一些实施方案中，化疗剂与cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫治疗和/或4-1bb激动剂同时、以任何次序顺序地或分开地施用。在一些实施方案中，化疗剂在施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和/或4-1bb激动剂的同时或之后一周内施用。在其他实施方案中，在施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫治疗和/或4-1bb激动剂之后约1至约4周或约1周至约1个月、约1周至约2个月、约1周至约3个月、约1周至约6个月、约1周至约9个月或约1周至约12个月施用化疗剂。在一些实施方案中，在施用cd19定向的遗传修饰的t细胞免疫疗法和/或4-1bb激动剂之前至少1个月施用化疗剂。在一些实施方案中，方法还包括施用两种或更多种化疗剂。
多种其他治疗剂可以与本文所述的组合物联合使用。例如，潜在有用的其他治疗剂包括pd-1抑制剂，例如纳武单抗(nivolumab)
适用于与本文公开的组合物和方法组合使用的其他治疗剂包括但不限于依鲁替尼(ibrutinib)
在一些实施方案中，将包含car免疫细胞的组合物与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物可包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)，非甾体抗炎药物(nsaids)包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、抗tnf药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。示例性的nsaid包括布洛芬、萘普生、萘普生钠、cox-2抑制剂和唾液酸盐。示例性的镇痛药包括对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧吩的曲马朵。示例性的糖皮质激素包括可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性的生物应答修饰剂包括针对细胞表面标志物(例如cd4、cd5等)的分子、细胞因子抑制剂，例如tnf拮抗剂(例如依那西普(etanercept)
在一些实施方案中，本文所述的组合物与细胞因子联合施用。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、n-甲硫基人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；前列腺素；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和促黄体激素(lh)；肝生长因子(hgf)；成纤维细胞生长因子(fgf)；催乳素；胎盘催乳素；苗勒氏抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(tpo)；神经生长因子(ngf)，例如ngf-β；血小板生长因子；转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β；胰岛素样生长因子-i和-ii；促红细胞生成素(epo、
axicabtageneciloleucel和utomilumab的施用
axi-celtm输注后的药效学和药代动力学
yescartatm(axicabtageneciloleucel；axi-celtm；kte-c19)是cd19定向的遗传修饰的自体嵌合抗原受体(car)t细胞疗法，已获得美国食品和药品管理局(fda)的批准用于在二线或更多线全身疗法之后治疗患有复发性或难治性(r/r)大b细胞淋巴瘤的成年患者。批准的适应症包括未另外指明的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)、高级别b细胞淋巴瘤和发生自滤泡性淋巴瘤的dlbcl。
在axi-celtm用于治疗r/r大b细胞淋巴瘤的关键性zuma-1临床试验中，阐明了关键药代动力学(pk)和药效动力学(pd)关系，这些关系描述了抗cd19cart细胞扩增(pk)和血清细胞因子水平(pd)与临床结果的关系(locke等人,ct019-primaryresultsfromzuma-1:apivotaltrialofaxicabtageneciloleucel(axicel；kte-c19)inpatientswithrefractoryaggressivenon-hodgkinlymphoma(nhl).in:proceedingsofthe107thannualmeetingoftheamericanassociationforcancerresearch；2017年4月1日至5日；washington,dc.philadelphia(pa):aacr；2017.摘要4292)。图2描绘了输注后前28天(auc0-28)血液中的抗cd19car水平与客观应答(cr或pr)以及发展≥3级神经毒性或细胞因子释放综合征(crs)之间的关系。cart细胞的扩增与客观应答和≥3级神经毒性有关，而与≥3级crs没有关系。
图3突出显示了输注后前28天，淋巴耗竭化疗和关键免疫程序的抗cd19cart诱导。不同的生物标志物在axi-celtm治疗后7天内达到峰值。在测量的44个患者的组中具有高于基线≥2倍诱导的≥50％的患者中评估了显示的分析物。用
图4显示了与≥3级crs和≥3级神经毒性相关的生物标志物。显示了血清分析物的峰值水平与≥3级神经毒性或crs之间的相关性。比较中使用了axi-celtm输注后的峰值水平。抗cd19cart细胞在共培养中显示出广泛的多功能性(图5)。在评估的所有产品中，t细胞的活化标志物的共调节在cd8+细胞上得到门控。cd4+t细胞表现出相似的模式(数据未显示)。参见perez等人,ash2015,“pharmacodynamicprofileandclinicalresponseinpatientswithb-cellmalignanciesofanti-cd19cartcelltherapy”(还有摘要no.2042)。
axicabtageneciloleucel的剂量和施用
在一些实施方案中，用于治疗患有难治性大b细胞淋巴瘤的成年患者的cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法是在二线或更多线全身疗法之后施用的。在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的输液袋包含大约68ml的嵌合抗原受体(car)阳性t细胞的悬浮液。目标剂量可以是每kg体重约1×106个至约2×106个car阳性活t细胞，最多2×108个car阳性活t细胞。在一些实施方案中，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法是axi-celtm(yescartatm，axicabtageneciloleucel)。
在一些实施方式中，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法用于自体使用。患者的身份必须与cd19定向的基因改造的自体t细胞免疫治疗盒和输液袋上的患者标识符匹配。如果患者特异性标签上的信息与预期患者不匹配，则不能进行cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法。
在一些实施方案中，必须在开始淋巴耗竭方案之前确认cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的可用性。
在一些实施方案中，在cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法输注之前通过施用淋巴耗竭化疗对患者进行预处理。在一些实施方案中，在输注cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法之前的第五天、第四天和第三天，施用约500mg/m2iv的环磷酰胺和约30mg/m2iv的氟达拉滨的淋巴耗竭化疗方案。
在一些实施方案中，在cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法输注之前对患者进行预给药，通过在cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法输注前大约1小时经口施用约650mg的对乙酰氨基酚和静脉内或经口施用约12.5mg的苯海拉明。
在一些实施方案中，避免全身类固醇的预防性使用，因为其可能干扰cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的活性。
用于输注的cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的制备
协调cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法解冻和输注的时机。在一些实施方案中，预先确定输注时间，并调节cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法解冻的开始时间，使得其在患者准备好时可用于输注。
在一些实施方案中，在cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法解冻之前确认患者身份。在cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法制备之前，患者的身份与cd19定向遗传修饰的自体t细胞免疫治疗盒上的患者标识符匹配。在一些实施方案中，如果患者特异性标签上的信息与预期患者不匹配，则不从盒中取出cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法产品袋。
在一些实施方案中，一旦确认患者身份，就从盒中取出cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法产品袋并确认盒标签上的患者信息与袋标签匹配。
在一些实施方案中，方法包括在解冻之前对产品袋检查任何容器完整性的破坏，例如破裂或裂缝。在一些实施方案中，根据当地指南将输液袋放置在第二无菌袋内。
在一些实施方案中，方法包括使用水浴或干解冻方法在大约37℃解冻cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法，直到在输液袋中没有可见的冰。在一些实施方案中，方法包括混合或搅拌袋子的内容物以分散成团的细胞材料。在一些实施方案中，将袋子的内容物轻轻地混合或搅拌。在一些实施方案中，方法包括对袋子检查剩余的可见细胞团块的存在并继续混合或搅拌。小块的细胞物质应在缓慢的手动混合下分散。在一些实施方案中，方法不包括在输注之前在新培养基中洗涤、旋转和/或重新悬浮cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法。
在一些实施方案中，一旦解冻，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法可以在室温(20℃至25℃)保存长达3小时。
施用
在一些实施方案中，目前公开的施用cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的方法包括以下一种或多种作为步骤或考虑因素：
·确保在输注之前和恢复期间塔西单抗(tocilizumab)和急救设备是可用的。
·勿使用白细胞耗竭滤过器。
·推荐中心静脉用于输注cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法。
·确认患者的身份与cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法产品袋上的患者标识符匹配。
·输注前用生理盐水灌注管道。
·通过重力或蠕动泵，在30分钟内输注cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫治疗袋的全部内容物。解冻后，cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法在室温稳定长达3小时。
·在cd19定向的遗传改造的自体t细胞免疫疗法输注期间，轻轻搅拌产品袋，以防止细胞结块。
·输注产品袋的全部内容物后，以相同的输注速率用生理盐水冲洗管道，以确保递送所有产品。
·cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法包含用复制缺陷逆转录病毒载体进行遗传修饰的人血细胞。遵循通用预防措施和当地生物安全指南进行处理和处置，以避免潜在的传染病传播。
监测
在一些实施方案中，在经认证的医疗机构进行cd19定向的遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的施用。在一些实施方案中，本文公开的方法包括在输注后，在经认证的医疗机构中至少每天监测患者crs的征候和症状以及神经毒性，持续7天。在一些实施方案中，建议患者在输注后保持在经认证的医疗机构附近至少4周。
严重不良反应的管理
在一些实施方案中，方法包括不良反应的管理。在一些实施方案中，不良反应选自细胞因子释放综合征(crs)、神经毒性、超敏反应、严重感染、血细胞减少症和低丙种球蛋白血症。
在一些实施方式中，不良反应的征候和症状选自发烧、低血压、心动过速、缺氧、和发冷、包括心律失常(包括房颤和室性心动过速)、心脏骤停、心力衰竭、肾功能不全、毛细血管渗漏综合征、低血压、缺氧、器官毒性、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症/巨噬细胞活化综合征(hlh/mas)、癫痫发作、脑病、头痛、震颤、头晕、失语、谵妄、失眠焦虑、过敏反应、发热性嗜中性球减少症、血小板减少征、嗜中性球减少症和贫血。
4-1bb(cd-137)蛋白受体激动剂
在某些t细胞(主要在cd8+上，但也在cd4+记忆t细胞上)和自然杀伤(nk)细胞上发现了4-1bb(cd-137)蛋白受体。(fisher,t.s.，kamperschroer，c.，oliphant,t.等人,cancerimmunolimmunother(2012)61：1721.https：//doi.org/10.1007/s00262-012-1237-1；westwoodja，potdevinhunnamtcu，pegramhj，hicksrj，darcypk，kershawmh(2014)routesofdeliveryforcpgandanti-cd137forthetreatmentoforthotopickidneytumorsinmice.plosone9(5):e95847.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0095847)。4-1bb也可以称为tnfrsf9；肿瘤坏死因子受体超家族，成员9；ila；4-1bb；cd137；cdw137；肿瘤坏死因子受体超家族成员9；cd137抗原。4-1bb结合分子(包括utomilumab)进一步描述在美国专利号8,337,850中，其通过引用整体并入本文。
utomilumab是pf-05082566的非专有名称，其是一种研究性免疫疗法和完全人igg2单克隆抗体(mab)。如图12所示，当utomilumab(pf-05082566)结合4-1bb时，已观察到它刺激并增加免疫细胞的数量。将utomilumab(pf-05082566)与检查点抑制剂(例如，抗pd-1/抗pd-l1)或其他免疫疗法组合可以放大免疫应答。(gopala,barlettn,levyr,等人,aphaseistudyofpf-05082566(anti-4-1bb)+rituximabinpatientswithcd20+nhl.jclinoncol33,2015doi:10.1200/jco.2015.33.15_suppl.3004；tolchermd,anthonyw.phase1btrialinvestigatingutomilumab(a4-1bbagonist)incombinationwithacheckpointinhibitor.2016年第52届美国临床肿瘤学会(asco)年会上的口头报告.http://meetinglibrary.asco.org/content/125783？media＝sl.2017年2月27日访问；astudyofpf-05082566asasingleagentandincombinationwithrituximab.https://clinicaltrials.gov/ct2/show/nct01307267？term＝pf-05082566&rank＝3.2017年2月27日访问)
在一些实施方案中，4-1bb(cd137)激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列的三个cdr和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列的三个cdr。
在一些实施方案中，4-1bb激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含：(a)seqidno：5所示的h-cdr1；(b)seqidno：6所示的h-cdr2；(c)seqidno：7所示的h-cdr3；(d)seqidno：8所示的l-cdr1；(e)seqidno：9所示的l-cdr2；和(f)seqidno：10所示的l-cdr3。
在一些实施方案中，4-1bb激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分包含seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1bb激动剂是分离的抗体或其抗原结合部分，包含seqidno：1所示的vh区氨基酸序列和seqidno：3所示的vl区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1bb激动剂分离的抗体是igg2。在一些实施方案中，4-1bb激动剂是完全人抗体。
在一些方面，本发明提供了药物组合物，包含本文所述的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的承载体。
在一些实施方案中，4-1bb激动剂分离的抗体包含seqidno：2所示的重链氨基酸序列和seqidno：4所示的轻链氨基酸序列，前提条件是任选地不存在seqidno：2的c末端赖氨酸残基。
utomilumab的剂量和施用
结合分子的术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指对预期治疗目的有效的量。例如，在癌症的治疗中，期望的或有益的作用的实例包括抑制癌细胞的进一步生长或扩散，癌细胞的死亡，抑制癌症的复发，减轻与癌症有关的疼痛，或改善哺乳动物的生存期。4-1bb抗体的治疗有效量通常范围是约0.001mg/kg至约500mg/kg，更通常是约0.01mg/kg至约200mg/kg哺乳动物体重。例如，量可以是约0.3mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg或约200mg/kg哺乳动物体重。在一些实施方案中，4-1bb抗体的治疗有效量的范围是约0.01-30mg/kg哺乳动物体重。在一些其他实施方案中，4-1bb抗体的治疗有效量的范围是约0.05-15mg/kg哺乳动物的体重。待施用的精确剂量水平可以由本领域技术人员容易地确定并且将取决于许多因素，例如待治疗的疾病的类型和严重程度，所采用的特定结合分子，施用的途径，施用的时间，治疗的持续时间，所采用的特定附加疗法，所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。
在一些实施方案中，4-1bb抗体的治疗有效剂量是约1mg至约200mg。在一些实施方案中，4-1bb抗体的治疗有效剂量是约1mg至约100mg。结合分子或组合物通常在多种情况下施用。单剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三到六个月施用一次。4-1bb抗体的剂量方案可以包括通过静脉内施用的约1mg/kg体重或约3mg/kg体重，使用以下给药时间表之一：(i)每四周共六次剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)约3mg/kg体重一次，然后每三周约1mg/kg体重。
在一些实施方案中，以约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约7.5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约40mg、约50mg、约75mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg的剂量施用4-1bb激动剂完全人单克隆抗体。在一些实施方案中，持续进行4-1bb激动剂全人单克隆抗体给药，直到患者表现出完全缓解，无应答/进行性疾病，或持续约1年。在一些实施方案中，约每4周施用4-1bb激动剂完全人单克隆抗体。在一些实施方案中，每月施用4-1bb激动剂完全人单克隆抗体。
通过以下实施例进一步示例说明本公开内容，这些实施例不应解释为进一步的限制。贯穿本公开内容引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用将其整体明确地并入本文。
实施例
实施例1：难治性大b细胞淋巴瘤的临床研究
使用axicabtageneciloleucel与utomilumab组合的组合治疗可以用于有效地治疗癌症患者。本实施例示例说明了多中心研究，评估了kte-c19(axicabtageneciloleucel)与utomilumab组合在至少二线的全身疗法之后在患有难治性大b细胞淋巴瘤或难治性弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)受试者中的安全性和功效。该试验分为两个不同的阶段，分别称为阶段1和阶段2。
在阶段1期间，大约3-9或3-24名患有难治性大b细胞淋巴瘤或难治性dlbcl的受试者登记在3+3设计中的多达6个队列中的3或4个，以评估kte-c19和utomilumab组合方案的安全性。kte-c19以固定剂量或单次剂量施用，并且utomilumab剂量以递增剂量施用或者在3个队列的每个中依次增加。阶段1的主要目标是评估kte-c19和utomilumab组合方案的安全性，并确定utomilumab最合适的剂量和时机以进入阶段2。不良事件的发生率定义为剂量限制性毒性(dlt)是主要终点。
在阶段2中，根据对来自阶段1部分的数据进行审查后选择的剂量和时间表，登记了大约22名或24名受试者接受kte-c19和utomilumab的组合治疗。阶段2的主要目标是评估kte-c19和utomilumab的功效，通过在患有难治性大b细胞淋巴瘤或难治性dlbcl患者中的完全应答(cr)来测量。次要目标包括评估kte-c19与utomilumab组合的安全性和耐受性，以及评估其他功效终点。阶段2的主要终点是完全应答率(根据修订的国际工作组[iwg]完全应答[cr])恶性淋巴瘤的应答标准(cheson等人，jclinoncol25：579-586(2007))或卢加诺分类(cheson等人，2014)，由研究调查人员确定。
与研究的队列或阶段无关，每个受试者都经历以下研究期：
·筛选
·登记/白细胞分离术
·桥接疗法(如果适用)
·调理化疗
·组合治疗(kte-c19和utomilumab)
·治疗后评估
·长期随访
如图1和图13所示，患者首先接受登记和白细胞分离术，然后在开始用kte-c19和utomilumab的组合治疗之前的第-5、-4和-3天进行淋巴耗竭化疗。患者接受由氟达拉滨30mg/m2/天和环磷酰胺500mg/m2/天组成的调理化疗方案，施用3天。在第0天，kte-c19治疗包括以2×106个抗cd19cart细胞/kg的目标剂量静脉内施用单次输注car转导的自体t细胞。在受试者最初应答并随后复发的情况下，受试者可以有资格接受第二疗程的调理化疗和kte-c19。
utomilumab治疗包括约每四个周给予静脉输注。在kte-c19输注后的的那一天施用第一剂量，并持续给药直至患者表现出完全缓解，无应答/进行性疾病，或持续约1年，以较早者为准。在图1所示的一项研究设计中，队列1受试者接受约1mg的utomilumab，队列2受试者接受约10mg的utomilumab，和队列3受试者接受约100mg的utomilumab。在图13所示的另一项研究设计中，utomilumab将在队列1中从第1天开始以10mg的固定剂量开始，并且下表1概述了所施用的utomilumab方案。
表1.utomilumab方案
在特定时间点，受试者经历以下程序：收集知情同意书，一般病史(包括以前对nhl的治疗)，体格检查(包括生命征候和体力状态)以及神经系统评估。受试者还进行了抽血用于全血细胞计数(cbc)，化学组，细胞因子，c反应蛋白，淋巴细胞亚群，抗kte-c19抗体，ada评估，复制能力逆转录病毒(rcr)和抗cd19cart细胞分析。有生育能力的妇女经历尿液或血清妊娠试验。
受试者还进行了基线心电图(ecg)，超声心动图(echo)，脑磁共振图像(mri)，正电子发射断层扫描-计算机断层扫描(pet-ct)和白细胞分离术。
客观应答率(cr+pr)是根据修订的iwg恶性淋巴瘤应答标准(cheson，2007)确定的，并由iwg恶性淋巴瘤或卢加诺分类的应答标准确定的(cheson等人,journalofclinicaloncology32,no.27(2014年9月)3059-3067)。评估应答持续时间。根据卢加诺应答分类标准(cheson等人，2014)，通过研究者评估对无进展生存期(pfs)进行评估。
在数据允许的情况下，药代动力学测定包括utomilumab的pk参数：最大血浆浓度(cmax)，达到最大血浆浓度的时间(tmax)，从给药后时间0到τ小时的血浆浓度时间曲线下的面积(auc0-τ，其中τ取决于分析物)表观血浆清除率(cl/f)或全身清除率(cl)，以及单次和多次给药后每种分析物的表观分布体积(v/f)或稳态分布体积(vss)。
外周血和/或肿瘤组织和/或粪便中的分子、细胞和可溶性标志物可以与研究治疗的作用机制或应答/抗性有关，包括评估原始dlbcl亚型的abc/gbc细胞的分子谱。
确定了总体生存期和不良事件的发生率以及安全实验室值的临床显著变化。此外，评估了抗kte-c19抗体的发生率以及针对utomilumab的抗药物抗体(ada)和中和抗体(nab)的免疫原性评价。
在研究期间，还可以评估基线时肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞中的pd-l1表达水平、血液中kte-c19的水平以及血清中细胞因子和其他标志物的水平。
此外，还执行了探索性研究以探索外周血和/或肿瘤组织和/或粪便中可能与研究治疗的作用机制或者应答/抗性有关的基线和治疗后的分子、细胞和可溶性标志物(例如但不限于基线突变谱、基线微生物组谱、基因表达谱的基线和变化、肿瘤浸润淋巴细胞和细胞因子水平)。
还评估了在kte-c19之后持续急性毒性的utomilumab剂量延迟的频率。这项研究利用单臂设计来评估在用utomilumab和kte-c19组合治疗的患有难治性大b细胞淋巴瘤或者复发性或难治性dlbcl的患者中的真实完全应答率。在任何给定的给药方案下，总样本量为25名或27名患者，其中至少3名患者已在阶段1部分中进行了治疗，观察到的60％的cr率产生了95％的置信度，即对真实cr率的评估为39％至79％，或评估真实cr率的95％置信区间的最大半宽度不大于21％。
研究资格标准概述如下：
一方面，关键纳入标准包括：
·经组织学证实的大b细胞淋巴瘤，包括以下定义的几种类型(swerdlow等，2016)：
·未另外指明的dlbcl(abc/gcb)
·有或没有myc和bcl2和/或bcl6重排的hgbcl
·fl引起的dlbcl
·富含t细胞/组织细胞的大b细胞淋巴瘤
·慢性炎症相关的dlbcl
·原发性皮肤dlbcl，腿部类型
·epstein-barr病毒(ebv)+dlbcl
·化疗难治性疾病，定义为以下一种或多种：
·对二线或更多线疗法无应答
οpd作为对最新治疗方案的最佳应答
οsd作为最佳应答，在至少2个周期的最后一线疗法后，其中sd持续时间不超过自最后一剂疗法起6个月
或
·asct后的难治性
οasct后≤12个月的疾病进展或复发(必须具有在复发受试者中证实的再次发生的活组织检查)
ο如果在asct后给予挽救疗法，则受试者必须对最后一线疗法无应答或复发
·根据卢加诺分类(cheson等人，2014)，至少有1个可测量的病变。仅在完成放射疗法后已记录病情进展的情况下，才认为对先前已照射的病变是可测量的
·受试者必须已接受足够的先前疗法，最少包括：
·抗cd20单克隆抗体，除非研究者确定肿瘤为cd20阴性，和
·含蒽环类的化疗方案
·没有淋巴瘤累及中枢神经(cns)的证据、怀疑和/或病史
·自从受试者计划进行白细胞分离术时进行的任何先前的全身疗法以来，必须经过至少2周或5个半衰期(以较短者为准)
·先前疗法引起的毒性必须是稳定的并恢复至≤1级(除了临床上无显著毒性，例如脱发)
·18岁或以上
·东部合作肿瘤小组(ecog)体力状态为0或1
·嗜中性粒细胞绝对计数(anc)≥1000/μl
·血小板计数≥75,000/μl；
·绝对淋巴细胞计数≥100/μl
·足够的肾、肝、肺和心脏功能定义为：
·肌酐清除率(由crockcroftgault估计)≥60ml/min
·血清丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶alt/ast≤2.5正常的上限(uln)
·总胆红素≤1.5mg/dl，患有gilbert综合征的受试者除外。
·如果受试者未接受基于蒽环类的治疗或经历过心脏事件或体力状态改变，则心脏射血分数≥50％，并且在180天内没有心包积液的迹象
·没有临床上显著的胸腔积液
·室内空气中的基线氧饱和度>92％
·具有生育能力的女性必须具有阴性的血清或尿液妊娠试验(经历手术绝育或绝经后至少两年的女性不被视为具有生育能力)
在另一方面，关键纳入标准包括：
·经组织学证实的dlbcl
·经过至少2线全身疗法之后疾病是难治的记录
·基线可测量疾病的记录
·在筛选时收集活组织检查(存档或筛选/近期)
·预期寿命≥3个月
·至少18岁
·东部合作肿瘤小组(ecog)体力状态(ps)为0或1
·患者必须具有足够的骨髓功能，包括：
·嗜中性粒细胞绝对计数(anc)≥1.5x109/l；
·血小板计数≥100x109/l；
·血红蛋白≥8g/dl。
·患者必须具有足够的肝功能，包括：
·总胆红素水平≤1.5×正常的上限(uln)；
·天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)≤2.5xuln。
·患者必须具有足够的肾功能，根据cockcroftgault公式计算的肌酐清除率≥60ml/min为证明。
在一方面，关键排除标准包括：
·经过组织学验证的pmbcl
·cll的richter转化的病史
·先前的非药物抗癌疗法，包括嵌合抗原受体(car)t细胞(cart-cell)疗法或其他遗传修饰的t细胞疗法
·归因于氨基糖苷类的严重、即时超敏反应的病史
·存在或怀疑真菌、细菌、病毒或其他不受控制或需要iv抗生素进行管理的感染。如果对积极治疗有应答并在与捐献者的医疗监护人协商后，允许单纯uti和无并发症的细菌性咽炎
·hiv感染史或者急性或慢性活动性乙型或丙型肝炎感染史。具有肝炎感染史的受试者必须按照美国现行传染病学会(idsa)指南或适用的国家指南，通过标准的血清学和基因检测确定其感染已清除
·存在任何留置管路或引流管(例如，经皮肾造瘘管，留置的foley导管，胆汁引流管或胸膜/腹膜/心包导管)。允许使用专用的中央静脉通路导管，例如port-a-cath或hickman导管
·根据临床评估，患有可检测的脑脊液恶性细胞、脑转移瘤或中枢神经系统(cns)淋巴瘤病史的受试者
·cns病症的病史或存在，例如癫痫病症、脑血管缺血/出血、痴呆、小脑疾病或cns受累的任何自身免疫性疾病
·患有心房或心室淋巴瘤受累的受试者
·登记后12个月内有心肌梗塞、心脏血管成形术或支架植入、不稳定型心绞痛或其他临床上显著的心脏病的病史
·由于肿瘤块效应(例如，血管受压、肠梗阻或胃壁透壁受累)而需要紧急治疗
·原发性免疫缺陷
·最近两年内导致终末器官损伤或需要全身免疫抑制/全身性疾病调节剂的自身免疫病(例如，克罗恩病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)的病史。处于稳定剂量的甲状腺替代激素的具有自身免疫相关甲状腺功能减退病史的患者和处于稳定胰岛素治疗方案的患有受控1型糖尿病患者符合本研究
·登记后6个月内有症状的深静脉血栓形成或肺栓塞的病史
·任何可能干扰研究治疗的安全性或功效评估的医疗状况
·对本研究中使用的任何试剂有严重的速发型超敏反应的病史
·在计划开始进行调理化疗之前≤6周的活疫苗
·由于制备性化疗可能对胎儿或婴儿具有潜在危险，怀孕的或正在哺乳的有生育能力的妇女。经过手术绝育或绝经后至少两年的女性不被认为是具有生育能力的。
·从同意之时起直到最后一剂的utomilumab后90天以及完成调理化疗后至少6个月都不愿进行节育的男女受试者
·除了原位非黑素瘤皮肤癌(例如子宫颈、膀胱、乳腺)或低级别(gleason≤6)前列腺癌的恶性病史或没有任何治疗计划的监测，除非无病至少三年
·计划登记6周内的自体干细胞移植
·先前的器官移植，包括先前的同种异体干细胞移植(sct)
·先前的cd19靶向疗法，但在本研究中接受axicabtageneciloleucel(kte-c19)且有资格再次治疗的受试者除外
·在登记前2周内使用任何标准或实验抗癌疗法，包括细胞减灭疗法和放射疗法、免疫疗法或细胞因子疗法(促红细胞生成素除外)
·使用pd-l1抑制剂、pd-1抑制剂、抗ctla4、抗cd137(4-1bb)、抗ox40或其他免疫检查点阻断剂或活化剂治疗的先前疗法
·在第一个utomilumab剂量之前的6周内或在药物的5个半衰期中(以较短者为准)，用全身性免疫刺激剂(包括但不限于干扰素和il-2)的治疗
·特发性肺纤维化、组织性肺炎(例如闭塞性细支气管炎)、药物诱导的肺炎、特发性肺炎或每次筛查时胸部ct扫描发现活动性肺炎的证据的病史。允许放射区域有放射性肺炎病史(纤维化)
·根据研究者的判断，受试者不太可能完成所有方案要求的研究访问或程序，包括随访访问，或者不符合研究的参与要求。
另一方面，关键排除标准包括：
·基于临床评价的症状性中枢神经系统(cns)淋巴瘤
·先前的器官移植，包括先前的同种异体sct
·使用4-1bb激动剂的先前疗法
·在登记前2周内使用任何标准或实验性抗癌疗法，包括细胞减灭疗法和放射疗法、免疫疗法或细胞因子疗法(促红细胞生成素除外)
·登记3周内的自体干细胞移植
·先前的cd19靶向治疗，但在本研究中接受kte-c19且有资格再次治疗的受试者除外
·使用任何非药物抗癌疗法，包括嵌合抗原受体(car)t细胞(cart细胞)疗法。
·自身免疫性疾病的病史，在最近两年内需要全身免疫抑制。
·在第一剂量的研究治疗前≤3年诊断的任何其他恶性肿瘤，但以下情况除外：(i)充分治疗的基底细胞或鳞状细胞皮肤癌；(ii)乳腺或子宫颈原位癌；或(iii)低级别(gleason≤6)前列腺癌，没有任何治疗干预计划(例如，手术、放疗或去势)的监测。
实施例2：axicabtageneciloleucel(kte-c19，axi-celtm)和utomilumab的评估计划
将进一步评估对kte-c19抗性的某些方面。治疗评估计划包括对药代动力学、药效学、肿瘤和免疫生物标志物以及产品特性的评估，支持在实施例1中所述的评价axi-celtm与4-1bb(cd137)激动剂抗体utomilumab组合在患有难治性大b细胞淋巴瘤或难治性dlbcl的受试者中的安全性、功效和作用机制的多中心研究。通过翻译分析，评估计划确定抗cd19cart细胞表面cd137水平的快速上调是否导致对激动剂驱动的活化的应答性，导致扩增和临床活性增加。还可以研究在肿瘤微环境(tme)中的抗性作用机制和神经毒性(csf)的机制。
对在与峰值外周抗cd19cart细胞扩增相一致的时间点收获的成对(给药前和给药后)芯针肿瘤活组织检查执行分析，以更好地了解tme中cart细胞的生物学和utomilumab的可能影响。根据机构指南使用18g或20g针通过计算机断层扫描(ct)或超声引导的芯针活组织检查程序执行芯针活组织检查，以获得3-6个肿瘤核心样品。对来自患有难治性大b细胞淋巴瘤或r/rdlbcl的患者给药前和给药后芯针活组织检查的福尔马林固定的石蜡包埋的(ffpe)或冷冻的肿瘤组织执行免疫组织化学(ihc)和rna转录谱分析。流式细胞术方法也用于分析冷冻保存的bm。
评估计划可以包括积极的收集策略以收集观察到发生2级或更高神经毒性的受试者的脑脊液(csf)，以了解tme中抗性的作用机理以及神经毒性(csf)的机理。
样品收集和分析策略可以提供cart细胞迁移到肿瘤微环境中以及活化、靶向细胞破坏和持久性的直接证据。对肿瘤细胞特征和微环境的评估可以建立与分子和组织学疾病特征相关的car功效。
生物标志物收集策略(图6)建立了衍生自经治疗的患者的样本库，所述经治疗的患者分为根据客观应答特征定义的四大类应答：1)消退[完全应答(cr)或部分应答(pr)]，2)对治疗是难治的[进行性疾病(pd)]，3)复发或4)持续而无进展或完全消退的证据[长期pr或稳定疾病(sd)]。对持续性疾病(长期pr或sd)的评估提供了对有关肿瘤病变的免疫限制的机制性见解。此外，来自成对的活组织检查材料的数据可以阐明抗性或复发的潜在机制，从而使得能够合理设计下一代car产品和旨在利用适于增强免疫应答的组合方法的临床试验。
用于分析的档案肿瘤、血液[外周血单核细胞(pbmc)、血清/血浆]和csf样品的通用收集时间表汇总在图7中。血液收集策略包括在基线、第7、14、28天和第3、6、9、12、15、18、24个月以及每次utomilumab施用后第2天和第6天的样品抽血。血液样品用于确定抗cd19cart细胞和血清生物标志物(细胞因子)水平。
执行流式细胞术测定法以评价在转导/扩增之前存在的白细胞亚群以及患者血液单采材料中的t细胞活化状态。采用表2中汇总的血液单采组1和2评估冷冻保存的患者血液单采材料。
表2.流式细胞术组用于血液单采表征
执行流式细胞术测定法以评价转导效率，并且还评价已经释放用于患者输注的kte-c19产品样品的表型和t细胞活化状态。采用表3中汇总的产品组1-3评估冷冻保存的输注前产品。
表3.用于表征输注前产品的流式细胞术组
使用流式细胞术测定法来评估几种关键标志物的表面表达，因为它们与纵向患者pbmc的表型和活化有关，使用表4所示的pbl组1-4。这些数据用于监测kte-c19扩增、输注后的持久性和表型。除了car水平监测外，组4(表4)旨在询问pbmc群体的水平，其受到调理和靶向非肿瘤car活性(即正常b细胞)的影响。
将纵向患者血液样品处理成冷冻保存的pbmc。在第-5天、第0天、第7天、wk2、wk4(在utomilumab之前的wk4，然后第30天和第36天)收集冷冻保存的纵向患者pbmc。为了与utomilumab施用进行比对，额外的血液收集包括在utomilumab之前每4周，每次utomilumab施用后2天和6天抽血。在长期随访中，每3个月抽血多至2年以监测免疫重建。
表4.用于评估输注后pbmc的流式细胞术组
定量聚合酶链式反应(qpcr)测定法可以用于纵向监测抗cd19cart细胞在外周血中的存在、扩增和持久性。输注后冷冻保存的pbmc用于监测基因标记细胞随时间的水平和清除率。在第-5天、第0天、第7天、wk2、wk4(utomilumab之前的wk4，然后第30天和第36天)收集冷冻保存的纵向患者pbmc。为了与utomilumab施用比对，额外的血液收集包括在utomilumab之前每4周，每次utomilumab施用后2和6天抽血。在长期随访中，每3个月抽血多至2年以监测持久性抗cd19cart细胞的存在。
使用用于详细的抗cd19car产品表征的共培养测定法。靶向的44种分析物
表5.细胞因子共培养组
多参数测定法可以用于评价纵向血清趋化因子、细胞因子和免疫效应子水平，以监测关于抗cd19cart细胞扩增、表型和持久性的血清分析物表达变化。根据观察到的血清分析物变化评估客观应答特征和安全相关性。纵向患者血清样品经过处理并冷冻保存。纵向血清样品(第-5天，第0天，从第1天开始的q3d，然后住院期间每隔一天，wk2，wk4)和另外的血液采集包括在utomilumab之前每4周抽血，每次utomilumab施用后2天和6天抽血，以与utomilumab施用比对。评价可以包括表6中所述的分析物。
表6.血清分析物组(
在输注前(基线)、输注后第28天和3个月对患者血清样品评价抗kte-c19抗体或抗utomilumab抗体。对显示出抗kte-c19和/或抗utomilumab抗体形成证据的血清样品评价中和抗体形成的存在。
可以从发生神经毒性或crs的患者中收集脑脊液(csf)以及任何其他受试者样品(例如胸膜液)，使得能够评价炎性细胞因子和趋化因子的水平以及浸润性抗-cd19cart细胞的水平和表型。先前描述的流式细胞术和msd/luminex组可用于此评价。
表7提供了待执行的样品分析的总结。
表7.样品分析计划
实施例3：成对的组织活组织检查分析
芯针肿瘤活组织检查的收集发生在基线(调理前)和产品后t细胞输注，在第7-14天或左右，并且在很大程度上与血液中的产品扩增峰一致。成对的活组织检查收集时间表如图8所示。将在120ml广口瓶中创建芯针活组织检查ffpe，其中包含60ml的中性福尔马林缓冲液(ffpe固定剂)、1.5ml冷冻小管(fft)和适当的标签。将芯针活组织检查材料放入固定剂(3-4个芯)中以加工成ffpe。将剩余的芯(1-2个)立即放入1.5ml冷冻管中用于在液氮(ln2)或干冰/乙醇浆液中快速冷冻。样品可以在-80℃储存。图9总结了芯针活组织检查的样品处理方案。
对成对的组织活组织检查执行以下分析以评估在难治性大b细胞淋巴瘤或r/rdlbcl的情况下产品的抗肿瘤作用：
ihc-免疫浸润
·cd19car检测(原位杂交方法、fish和ish)
·cd25和cd107α(car活化和脱粒的证据)
·ki-67(肿瘤内car扩增的证据)
·pd-1(car耗尽的证据)
ihc-肿瘤
·cd19(car靶抗原)
·cd22(cd19阴性病变的患病率)
·pd-l1/2(检查点介导的抗性)
·胱天蛋白酶3(car定向杀伤肿瘤细胞的证据)
其他ihc分析/目标
·评估cart细胞/肿瘤细胞接近度
·car产品检测开发
·开发相关成像资源伙伴
此外，可以使用nanostring(immunosigntm)执行转录本分析和肿瘤测序用于使用固定的(即ffpe)或新鲜的样品形式进行基因表达分析。已开发出可商购可得的代码集来确定免疫浸润液中的表达模式(pancancer免疫组-浸润液组成，检查点调节的证据)以及炎症的标志物(人类炎症组-提供激活证据的其他标志物)。可以设计定制的“适合目的”组的创建。备选地，可以追求更高含量的微阵列以扩展分析表达的基因的范围(即almac或agilent高含量微阵列平台)。图10显示了可用于评价患者活组织检查样品的标志物和分析方法的示意图。
ihc分析用于确定产品t细胞的存在、表型和功能，产品靶标的肿瘤组织表达及其相对微环境定位。激活的t细胞在肿瘤组织中的长期存在将指示长期的局部免疫反应或免疫介导的肿瘤限制，作为持久性pr的主要作用机制。此类病变中car阴性t细胞的存在可能表明潜在使用识别无关肿瘤靶标的内源性t细胞。
可以通过分析来自复发或新病变的活组织检查来评估抗炎肿瘤微环境的存在(treg存在、上调的pd-l1/2肿瘤表达等)。可以执行靶标表达分析以及其他标志物(即，cd22或其他相关的cd抗原)，以及完整的hans算法，包括监测c-myc、bcl-2、bcl-6(与nhl适应症有关)的失调，以记录肿瘤进展、潜在的靶标丢失以及其他靶标的表达。另外，可以确定肿瘤病变内产品t细胞存在和表型的分析。
可以使用输注前产品(幼稚和有经验的抗原)和低温保存的纵向患者pbl(例如，来自第-5天、第0天、第7天、wk2、wk4、mth3、mth6、mth9、mth12、mth15、mth18、mth24、mth36、mth48、mth60、mth72和在以后适用时每年一次)执行单细胞转录本分析。使用合理设计的测定组在单个细胞水平上对输注前产品和纵向pbl分析rna转录本的表达模式。组设计包括用于cart细胞鉴定的标志物以及谱系、活化和耗尽的标志物。
实施例4：微小残留病(mrd)和bcr/tcr监测
微小残留病(mrd)
适应性生物技术
在登记期间(校准)收集的适应性(外周血)样品，在or评价时开始抽吸，每3个月纵向地直至1年、18月、24个月用于支持确定已经历完全应答的受试者的mrd(cr)。
bcr/tcr监测
适应性生物技术
输注前产品、输注后血液和系列活组织检查中的tcr多样性评价用于了解治疗过程中t细胞多样性的变化。监测最初存在于产品中并且在血液或肿瘤病变中扩增并变得占主导地位的cart特异性tcr序列，这可能表明在肿瘤清除中起重要作用的反应性t细胞克隆的存在和性质。这种性质的数据可以用于鉴定通过“表位扩散”机制优先扩增和根除肿瘤细胞的t细胞克隆，这些机制涉及针对无关抗原决定簇(例如与新抗原相关的抗原表位)的反应性。
在确定已经历完全应答(cr)的受试者中支持mrd所需的用于bcr测序的样品类型和时机包括输注前肿瘤活组织检查、输注后肿瘤活组织检查(第7-14天)、复发肿瘤活组织检查、纵向pbmc(如适用mth3、mth6、mth12、mth18、mth24)。
在确定已经历完全应答(cr)的受试者中支持mrd所需的用于tcr测序的样品类型和时机包括输注前肿瘤活组织检查、输注后肿瘤活组织检查(第7-14天)、复发肿瘤活组织检查、产品cart细胞、血液单采的t细胞、纵向pbmc(dy14、dy28、mth3、mth6和mth12)。
实施例5：
该研究检查了utomilumab对抗cd19cart细胞的作用。在这项研究中，将细胞与工具抗体一起孵育，该工具抗体先前已显示出刺激或激活cart细胞；在存在或不存在utomilumab的情况下。几种细胞因子、趋化因子和效应子分子(分析物)的产生或水平用于评价潜在的作用。抗cd19cart细胞是由健康受试者(a、b、c、d和e)的外周血单个核细胞产生的。将r10培养基中的抗cd19cart细胞(1x106个细胞/ml)在37℃和5％co2孵育过夜。96孔板包被有工具抗体(0.33μg/ml)、utomilumab(滴定浓度是0至100μg/ml，3倍稀释)或不结合4-1bb的对照抗体(滴定浓度是0至100μg/ml，3倍稀释)在4℃过夜。使用r10培养基(具有10％fbs的rpmi1640)将包被的板洗涤两次并添加1×105个抗cd19cart细胞。使用r10培养基将每个孔的最终总体积调节至200μl。在37℃和5％co2下孵育过夜后，收集上清液并使用milliplexmap人cd8+t细胞磁珠组预混的17重-免疫学多重测定法进行分析。通过将在存在utomilumab的情况下的分析物输出结果除以在存在相应浓度的对照抗体的情况下的输出结果来计算峰值倍数变化。表8显示了每种分析物在滴定浓度间的峰值倍数差异。
结果显示，在存在utomilumab的情况下，抗cd19cart细胞(受工具抗体刺激)的几种细胞因子、趋化因子和效应子分子的水平或产生增加(表8)。与存在对照抗体的情况相比，il-2的水平或产生增加1.9-25.9倍，除了受试者e中观察到il-2产生的非特异性增加(图14)。在仅与utomilumab或仅与对照抗体一起孵育的细胞中，il-2产生低于定量极限，在每种情况下均不包含工具抗体(一式三份的数据)。这显示单独的utomilumab不刺激抗cd19cart细胞产生il-2。
本说明书中提到的所有出版物、专利、专利申请、在引用的数据库登录号下的序列以及参考文献(包括处方信息)均通过引用并入本文，程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入一样。但是，本文引用参考文献不应被理解为承认这种参考文献是本发明的现有技术。在通过引用并入的参考文献中提供的任何定义或术语与本文提供的术语和讨论不同的程度上，以本术语和定义为准。
表8.抗cd19car-t细胞的分析物产生的峰值倍数变化
序列和seqid号
本公开内容包括许多多肽序列。为了方便起见，下表9将每个序列与其相应的描述和seqidno对应。
表9.seqid号
序列表
<110>辉瑞大药厂
吉里德科学公司
<120>组合施用嵌合抗原受体免疫疗法与4-1bb激动剂的方法
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