胡椒碱及其衍生物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体是指一种胡椒碱衍生物及相应的组分物、应用。

背景技术：

多发性硬化症(multiplesclerosis，ms)是一种慢性、自身免疫性疾病，通过破坏脑、脊髓以及视神经的神经纤维保护层髓磷脂，影响正常的神经传递而导致身体残疾。由于该病具有极高的复发率和致残率、呈慢性病程和倾向于年轻人罹患，已成为常见的、重要的神经系统疾病之一。由于该病的发病高峰在30岁左右，因此，严重危害青壮年人口的生产力和生活质量，也给国家和政府造成极大负担，制约社会和经济发展。

目前临床上对该病无特效治疗方法，缺乏令人满意的治疗药物。急性期主要给予糖皮质激素，复发-缓解期主要治疗药物包括：常用的一线药物为β-干扰素和口服特立氟胺，针对一线药物治疗效果不佳的患者，选用二线药物如米托蒽醌和单克隆抗体那他珠单抗。重度患者还可以考虑自体干细胞移植。西医的激素疗法虽然能够缓解急性期症状，但毒副作用明显，故不推荐长期使用；免疫调节剂干扰素ifn-β-1a和1b，那他珠单抗和阿仑单抗等不仅费用昂贵，且长期使用针对单一靶点药物容易出现耐受。且上述药物均需经静脉、或注射给药，不能有效改善多发性硬化症反复发作和髓鞘脱失的根本问题。因此，积极研制能够有效控制多发性硬化症的复发、改善髓鞘脱失的口服药物具有十分重要的意义。

二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotatedehydrogenase,dhodh)是嘧啶从头合成途径的关键限速酶，抑制dhodh会导致细胞中嘧啶核苷酸从头合成途径受阻，从而影响免疫细胞和癌细胞的过度增殖。因此，dhodh被认为是自身免疫性疾病和癌症等的理想治疗靶点。

例如，来福米特、特立氟胺以及布喹那能够有效结合并抑制dhodh活性，来福米特用于治疗类风湿性关节炎，特立氟胺用于治疗多发性硬化症，布喹那用于肿瘤的治疗。其中，来福米特和特立氟胺在临床上取得了较好的治疗效果。但是现有的这些药物由于治疗窗较窄和毒副作用较大等诸多的毒副作用，限制了此类药物的临床应用。比如，布喹那存在较严重的骨髓抑制作用，长期服用来福米特伴随着严重的腹泻、脱发、呕吐、丙氨酸氨基转移酶水平升高等副反应，特立氟胺是致畸物，且有肝毒性。因此，发现结构新颖、高效低毒的dhodh抑制剂仍然是针对上述相关疾病治疗中所亟待解决的关键性问题。

胡椒属胡椒目，胡椒科、胡椒属木质攀援藤本，《唐本草》、《本草纲目》中记载，胡椒具有主下气、温中、去痰、除脏腑中风冷、暖肠胃、除寒湿反胃、虚胀冷积、阴毒、牙齿浮热痛等功效，具有较高的药用价值。胡椒碱(piperine)属于桂皮酰胺生物碱类，是胡椒科植物荜茇、黑胡椒、白胡椒中提取物中的主要有效成分。文献中报道可以治疗癫痫、癌症、慢性支气管炎、哮喘、风湿、白癜风、肥胖症，高脂血症和肠胃疾病等功效。胡椒碱衍生物包括伊来西胺、次胡椒酰胺等，其中伊来西胺已经在临床用于治疗抗癫痫一线药物使用。

因此，需要治疗由dhodh介导的疾病的组合物、化合物和系统。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服上述现有技术的缺点，提供一种胡椒碱及其衍生物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种胡椒碱及其衍生物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，所述的胡椒碱衍生物具有如通式(1)所示的结构式：

其中，r1为c2-c6烯基；r2为或者-(ch2)nnr4r5，n为0、1、2或3，r4和r5各自独立的为氢、c1-3烷基、取代或未取代的五元环或六元环烷基环系，或者r4和r5与所连接的氮原子一起形成取代或未取代的c4-c7杂环烷基环系，取代基可以是c1-c3烷烃、烯烃、卤素、氰基、羧基中的一个或多个基团。

较佳地，所述的胡椒碱及其衍生物选自以下化合物：

较佳地，所述的自身免疫性疾病包括多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、免疫排斥反应、癌症、eae等。

本发明还提供了一种药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，所述的药物组合物包括胡椒碱、其衍生物、或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，所述的胡椒碱衍生物具有如通式(ⅰ)所示的结构式：

其中，r1为c2-c6烯基；r2为或者-(ch2)nnr4r5，n为0、1、2或3，r4和r5各自独立的为氢、c1-3烷基、取代或未取代的五元环或六元环烷基环系，或者r4和r5与所连接的氮原子一起形成取代或未取代的c4-c7杂环烷基环系，取代基可以是c1-c3烷烃、烯烃、卤素、氰基、羧基中的一个或多个基团。

较佳地，所述的胡椒碱及其衍生物选自以下化合物：

较佳地，所述的自身免疫性疾病包括多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、免疫排斥反应、癌症、eae等。在制备治疗多发性硬化症药物中的应用，生物碱胡椒碱及其衍生物将dhodh作为作用靶点。

本发明还提供了一种dhodh抑制剂，所述的dhodh抑制剂为胡椒碱或其衍生物，所述的胡椒碱衍生物具有如通式(ⅰ)所示的结构式：

其中，r1为c2-c6烯基；r2为或者-(ch2)nnr4r5，n为0、1、2或3，r4和r5各自独立的为氢、c1-3烷基、取代或未取代的五元环或六元环烷基环系，或者r4和r5与所连接的氮原子一起形成取代或未取代的c4-c7杂环烷基环系，取代基可以是c1-c3烷烃、烯烃、卤素、氰基、羧基中的一个或多个基团。

较佳地，所述的胡椒碱及其衍生物选自以下化合物：

胡椒碱及其衍生物与dhodh相关，通过对二氢乳清酸脱氢酶的活性测试，显示出突出的抑制活性，胡椒碱及其衍生物能够与dhodh的活性口袋结合，dhodh的调控影响个体的自身免疫性疾病，对治疗自身免疫性疾病十分有价值。

附图说明

图1显示胡椒碱对dhodh活性的量效曲线，胡椒碱对dhodh活性具有较强的抑制作用。

图2显示胡椒碱提高dhodh蛋白热稳定性。

图3显示胡椒碱与dhodh有较强的亲和能力。

图4显示通过x-ray解析出的胡椒碱与dhodh结相互作用示意图，小分子由棒状表示。

图5显示出胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠的发病的治疗效果。

图6显示出胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠治疗后体重的影响。

图7显示出eae小鼠经过胡椒碱及其类似物伊来西安治疗后脾脏中cd4+和cd8+t淋巴细胞的变化。

图8a和8b分别显示出胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠的血脑屏障和髓鞘有明显的修复作用。

图9显示胡椒碱及其类似物伊来西安对小鼠没有明显的毒副作用。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。

本发明提供的胡椒碱及其衍生物，涉及用于治疗自身免疫性疾病，具体地，用于治疗诸如多发性硬化症的化合物，诸如胡椒碱及其类似物。本文中描述的胡椒碱及其类似物能结合并抑制dhodh的活性。

材料和方法

动物、饲料和化合物

本发明中使用的试剂：

实验所用多肽：mog35-55，由上海强耀生物科技有限公司合成，其具体序列为：met-glu-val-gly-trp-tyr-arg-ser-pro-phe-ser-arg-val-val-his-leu-tyr-arg-asn-gly-lys，纯度为95％，合成冻干粉后保存于-20℃。实验所用8-10周大c57bl/6小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司。实验所用弗氏佐剂(completefreund’sadjuvant，cfa,3-diethylthiatricabocyanineiodide(dbt)和cy5.5-bsa染料购于北京博蕾德生物科技有限公司。

所采用的化合物胡椒碱购自上海诗丹德生物科技有限公司，胡椒碱类似物来源于上海陶素生化科技有限公司。

胡椒碱及其类似物伊来西安的结构式如下：

实施例1

胡椒碱对dhodh抑制活性测定

将纯化后的dhodh蛋白用活性测试溶液稀释至10nm，活性测试溶液为50mmhepesph8.0，150mmkcl，0.1％tritonx-100。加入辅酶q0及dcip，使其终浓度分别为100μm和120μm。混匀后排枪加入96孔板，化合物ic50测试浓度为：100μm、30μm、10μm、3μm、1μm、0.3μm、0.1μm、0.03μm、0.01μm，加入不同浓度化合物后室温孵育5min后，加入底物dho启动反应，dho终浓度为500μm。使用bioteck酶标仪检测600nm的吸光值，每30s读取一次，持续6min。计算酶促反应初速度v0，抑制剂的活性测试则在上述反应体系中加入不同浓度的抑制剂，计算酶促反应初速度vi，化合物的抑制率则由公式(1-vi/v0)×100％计算。在化合物ic50的计算中，至少测试8个浓度下的抑制率，ic50值使用origin8.0计算，结果如图1所示。

实施例2

胡椒碱对dhodh热稳定性测定

测试实验在96孔荧光板中进行，将syproorange染料(5000x，invitrogen,ny,usa)在反应液中按1：1000稀释，反应液为：25mmhepes,150mmnacl，ph7.5。然后加入蛋白至其最终浓度为5μm，再向混合液中加入化合物或dmso孵育10min后，按每孔40μl的体积加入96孔板中进行pcr实验。具体程序设定为：加热温度从25℃至79.6℃，每18s上升0.3℃，每隔30s测定其荧光信号值，荧光信号测定设定为ex/em:492/610nm。最后实验数据通过excel软件拟合后，得出tm值，结果如图2所示。

实施例3

胡椒碱对dhodh亲和性(kd)测定

化合物和蛋白溶解在滴定反应液中：50mmhepes,300mmnacl,10％glycerol,0.1％triton。最终化合物浓度为250μm，蛋白浓度为25μm，反应在25℃环境中采用itc200(microcal,gehealthcare,pa,usa)进行。滴定过程中，进样器转速1000rpm，第一滴反应时间为0.8s，化合物体积0.4μl，第二滴至第十滴反应时间4s，每滴体积为2μl，每次滴定间歇120s。选取最后10滴的吸收曲线作为化合物滴定蛋白时的稀释热空白对照。最后实验数据通过origin8.0软件拟合，得出结合常数kd、焓变和熵变等，结果如图3所示。

实施例4

胡椒碱与dhdoh复合物晶体。

结晶时，在蛋白浓度25mg/ml，池液：50mmhepesph7.7、400mmnacl、30％glycerol、1mmedta、10mmudao和20.8mmddao；沉淀剂：100mm乙酸钠(ph4.8)、2.4m硫酸铵，结晶温度为20℃条件下得到了块状的黄色晶体。得到晶体后，在上海光源bl17u1现在进行晶体衍射。然后用hkl2000，ccp4i，coot-0.8.4精修，最后，所有图像使用pymol渲染而得。结果如图4所示。

实施例5

胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠药效研究

将购买的8-10周大c57bl/6雌性小鼠，在实验室适应性饲养一周后开始进行实验。先将mog35-55多肽乳化剂制备成功后，放置冰上备用。根据小鼠体重腹腔注射适量麻醉剂阿弗丁进行麻醉，待小鼠完全处于昏迷状态后，在小鼠背部脊椎左右两侧(靠近后肢部位)处皮下分别注射50μl乳化制剂，每只小鼠共注射100μl，注射后会明显感觉有鼓起小包。然后每只小鼠再腹腔注射稀释后的ptx溶液100μl，将小鼠放回笼中待其自然苏醒。一次免疫可能由于免疫的力度不够而导致小鼠发病率较低，所以一般进行两次免疫，在初次免疫2天后采用同样的方法进行二次免疫即可。二次免疫约10天后，小鼠开始发病，可以观察到小鼠的运动能力发生了变化主要表现为行走时后肢无力，尾巴难以抬起。此时根据发病轻重程度对小鼠进行随机分组，分组后尽量保证各组平均打分水平接近，每组8只，实验共设3组分别为：造模组、胡椒碱给药组、伊来西安给药组。所有化合物均用0.5％cmc-na制成均匀混悬液后通过灌胃方式给药，其中正常组和造模组给予等体积cmc-na，给药治疗总时间为20天。结果如图5所示。

实施例6

胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠体重的影响。

从开始给药开始，每天对小鼠进行体重测定直至给药结束。结果如图6所示。

实施例7

胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠cd4+和cd8+t细胞影响。

将新提取的小鼠脾细胞在1000rpm/min速率离心10min，去掉上清液，加入流式洗液(1×pbs，2％bsa，1mmedta，ph8.0)洗涤细胞三次。对细胞计数后用500μl流式洗液根据抗体说明书加入适量流式抗体fitc-cd4+和apc-cd8+，避光条件下在4℃下孵育2小时。加入流式洗液漂洗三次将残余抗体洗净后，用300μl漂洗液悬浮细胞，上机检测。利用bdfacscalibur流式细胞仪和flowjo软件分析细胞表面蛋白表达情况。结果如图7所示。

实施例8

胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠血脑屏障的影响。

将cy5.5-bsa染料粉末用生理盐水溶解性3mg/kg母液后放在冰上备用，待小鼠给药结束后，用固定器将小鼠固定，然后将小鼠尾巴浸泡在50℃温水中，待尾静脉充分舒张后用酒精棉球对小鼠注射部位进行擦拭，直到尾静脉充分暴露。用胰岛素注射器吸取200μl配制好的cy5.5-bsa母液，然后左手稍微向下拉直小鼠尾巴，右手顺着尾静脉轻轻进针，确认进入尾静脉后，慢慢推针，将染料沿着尾静脉全部推进小鼠体内。然后用酒精棉球轻轻压着针头，慢慢出针即可。尾静脉注射6小时后，用电动脱毛仪对小鼠进行全身脱毛，腹腔注射适量阿弗丁麻醉小鼠。待小鼠完全麻醉后，将其放入小动物活体成像系统中(ivisluminaserieⅲ，pe)，设定激发、发射波长分别为为ex675/em720nm，检测其荧光信号强度。结果如图8a所示。

实施例9

胡椒碱及其类似物伊来西安对eae小鼠髓鞘的影响

髓鞘损伤主要利用尾静脉注射荧光染料3,3-diethylthiatricabocyanineiodide(dbt)后，测定染料荧光信号强度。dbt在体内能够特异性聚集在髓鞘损伤位置，当髓鞘破坏严重时，检测到的荧光信号减弱，因此dbt荧光信号强度可用来定性反应髓鞘的破坏程度。具体实验操作如下所述：将dbt染料粉末用dmso溶解成10mg/ml母液后，加入生理盐水稀释成1mg/ml以待用。小鼠给药结束后，通过尾静脉注射200μldbt稀释液，待小鼠吸收约5min后(由于dbt在体内代谢较快，会影响效果，所以最后在尾静脉注射后10min内完成测定)。通过腹腔注射阿弗丁对小鼠进行麻醉，待小鼠完全昏迷后，将小鼠放入小动物活体成像系统中(ivisluminaserieⅲ，pe)，设定激发、发射波长分别为ex745/em800nm，检测其荧光信号强度。结果如图8b所示。

实施例10

胡椒碱及其类似物伊来西安的毒性研究

小鼠处死后将器官取出，用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。将石蜡切片用蒸馏水润洗1min后，切片放在二甲苯中脱蜡5min。然后分别加入95％和70％乙醇，各自浸润3min。用蒸馏水冲洗后，加入适量苏木精染液染色10min，然后用自来水冲洗2min。通过镜检观察，直至细胞核及核内染色质清晰为止，用自来水冲洗5min后，再用去离子水润洗20s，放入伊红染液中染色2min，若着色困难，可在染液中加入少许冰醋酸，使其易着色。伊红染色结束后依次70％、85％、95％乙醇各自脱水3min。二甲苯透明二次，每次5min。封片保存。结果如图9所示。

统计分析结果如表1所示

数值表达为平均值±平均值的标准差(sem)。通过学生t检验计算统计学差异。统计显著地*p<0.05、**p<0.01或***p<0.001示出。由表1结果可知，胡椒碱及其类似物的结构以及对dhodh的抑制活性。

表1

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。