6种小分子药物在抑制犬细小病毒中的应用的制作方法

本发明涉及已知化合物的新用途，特别是closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine在抑制犬细小病毒中的应用。

背景技术：

犬细小病毒(canineparvovirus,cpv)是一类结构简单的单链dna病毒，为细小病毒科成员，无包膜，成二十面体。病毒基因组全长约为5300nt，含有2个orf，5’端主要编码早期转录的调节蛋白(ns1和ns2)，3’端编码晚期转录的结构蛋白，即病毒衣壳蛋白(vp1和vp2)。vp2蛋白是衣壳蛋白的主要成分，可以与宿主细胞膜上的转铁蛋白受体(tfr)结合，从而介导细小病毒的感染。cpv是犬急性胃肠炎、白细胞减少和心肌炎的主要病原之一，广泛存在于肉食动物中。感染cpv的典型临床症状包括呕吐、发烧、腹泻，特别是6周至6个月的幼犬易感。

cpv病毒在世界范围内广泛分布，在20世纪70年代后期出现cpv-2后，cpv-2及其变种已在五大洲的多个国家有过报道。由于没有特定的抗cpv药物，除了通过疫苗预防，剩下的唯一的治疗选择是支持疗法和基于症状的护理。cpv基因组替代率与rna病毒相似，仅仅几年，最早的cpv-2型即被三个主要亚种cpv-2a，cpv-2b和cpv-2c取代。尽管已经广泛使用灭活或减毒活疫苗进行预防，但是变异毒株的屡屡出现引起了人们对现有疫苗效果的关注和担忧，与此同时，母源抗体也显示出对疫苗的削弱作用。

因此，亟待开发预防和治疗cpv病毒的新药物。

技术实现要素：

发明人发现，6种小分子药物closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine(化学结构式如图1所示)对犬细小病毒(cpv)复制具有抑制作用。通过体外实验测定了该药物的50％细胞毒性(50％cytotoxicityconcentrations,cc50)及50％抗病毒效应(50％antiviralefficacy,ec50)浓度，并进一步利用间接免疫荧光试验(indirectimmunofluorescenceassay,ifa)和westernblot试验验证了这6种小分子药物体外抑制cpv复制的效果。

一方面，本发明提供closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine在制备抑制犬细小病毒复制的药物方面的用途，其特征在于，所述药物的活性成分包含closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和/或cladribine。

在本发明所述用途的一些实施例中，所述药物为单一活性成分药物，其活性成分为closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine中的一种。

在本发明所述用途的另一些实施例中，所述药物为复方药物，其活性成分包含closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine中的两种或两种以上。在一些实施例中，还可以包含其它抗病毒成分。

在本发明所述用途的一些实施例中，所述药物还包含药学上可接受的载体。

在本发明所述用途的一些实施例中，所述药物的剂型为片剂、悬液或干混悬剂。

另一方面，本发明提供一种抑制犬细小病毒复制的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包含closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和/或cladribine。

在本发明所述药物的一些实施例中，所述药物为单一活性成分药物，其活性成分为closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine中的一种。

在本发明所述药物的另一些实施例中，所述药物为复方药物，其活性成分包含closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine中的两种或两种以上。在一些实施例中，还可以包含其它抗病毒成分。

在本发明所述药物的一些实施例中，所述药物还包含药学上可接受的液体的或固体的载体成分。

在本发明所述药物的一些实施例中，所述药物的剂型为片剂、悬液或干混悬剂。

在法律允许的情况下，本发明请求保护一种治疗犬细小病毒感染的方法，其特征在于，包括向感染个体施用有效剂量的上述任一药物，按时施用预定时间之后，使所述感染个体的血清中犬细小病毒水平显著降低或降低至不可检测的水平。

closantelsodium，中文名：氯氰碘柳胺钠，cas号：61438-64-0，分子式：c22h13cl2i2n2o2.na，其结构式见图1a，是一种革兰氏阳性的抗菌活性抑制剂。

closantel，中文名：氯氰碘柳胺，cas号：57808-65-8，分子式：c22h14cl2i2n2o2，其结构式见图1b，是一种革兰氏阳性的抗菌活性抑制剂。

gemcitabinehcl，中文名：盐酸吉西他滨，cas号：122111-03-9，分子式：c9h11f2n3o4.hcl，其结构式见图1c，是一种dna和核酸合成抑制剂。

gemcitabine，中文名：吉西他滨，cas号：95058-81-4，分子式：c9h11f2n3o4，其结构式见图1e，是一种dna和核酸合成抑制剂。

cladribine，中文名：克拉屈滨，cas号：4291-63-8，分子式：c10h12cln5o3，其结构式见图1d，是一种腺苷脱氨酶抑制剂。

trifluridine，中文名：三氟胸苷，cas号：70-00-8，分子式：c10h11f3n2o5，其结构式见图1f，是一种抗疱疹病毒药。

发明人发现closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine能够抑制cpv毒株复制，并测定了其对f81细胞中cpv抑制保护效果，结果显示，6种小分子药物能够很好的保护cpv感染后的细胞。如图2所示，当药物终浓度为10μm时，closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine对f81细胞的抑制保护率分别为80.64±7.87，69.76±6.06，64.18±0.97，57.11±5.45，56.1±2.09和50.92±1.58％，明显高于对照药物cidofovir(中文名：西多福韦，cas号：113852-37-2，分子式：c8h14n3o6p，广谱抗dna病毒药物)的-1.28±1.03％的保护率。

进一步地测定了closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine对cpv毒株sd6(newcpv-2a)的50％效应浓度(ec50)及50％细胞毒性浓度(cc50)，6种小分子药物抑制毒株sd6对f81细胞感染的ec50，cc50结果如图3和图4所示。

发明人进一步进行了免疫荧光试验(ifa)，结果表明，当药物终浓度为5μm时，检测vp2表达的荧光信号即低于未加药物的对照组，当药物终浓度为10μm或20μm时，几乎未能检测到荧光信号，证明6种小分子药物能够成功抑制cpv在f81细胞中的复制(图5)。

此外，westernblot结果表明，6种小分子药物能够抑制不同基因型病毒vp2蛋白的表达，并且随着药物浓度的增加，不同基因型vp2蛋白表达量均逐渐降低，进一步验证了该药物抑制cpv复制的效果(图6)。

综上，本发明筛选出了有效抗犬细小病毒(cpv)的候选药物closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine，由于其为成熟的在用临床药物，将为临床用药提供参考，将其开发为抗cpv药物，具有较大的应用前景。

附图说明

图1.小分子药物closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine的结构式。

图2.小分子药物体外抑制cpv复制的实验结果；横坐标为药物名称，纵坐标为cpe抑制百分比。closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine对f81细胞的抑制百分比分别为80.64±7.87，69.76±6.06，64.18±0.97，57.11±5.45，56.1±2.09和50.92±1.58％。对照药物cidofovir对f81细胞的抑制百分比为-1.28±1.03％。

图3.小分子药物对f81细胞的cc50及ec50测定结果；a，b，c分别是closantelsodium，closantel和gemcitabinehcl的cc50及ec50测定结果。

图4.小分子药物对f81细胞的cc50及ec50测定结果；d，e，f分别cladribine，gemcitabine和trifluridine的cc50及ec50测定结果。

图5.小分子药物抑制病毒vp2蛋白表达的免疫荧光法检测结果。对照fitc是对照组的fitc荧光信号(显示病毒数量)，对照dapi是对照组的dapi荧光信号(显示细胞数量)，对照合并是对照组的fitc荧光信号和dapi荧光信号的合并图。closantelsodium，closantel，gemcitabinehcl，cladribine，gemcitabine和trifluridine的图片均为fitc荧光信号和dapi荧光信号的合并图。5μm，10μm和20μm表示药物在实验体系中的终浓度。

图6.小分子药物对不同基因型cpv毒株的抑制实验结果(westernblot实验)。dmso表示对照组，5，10，20分别表示药物终浓度为5μm，10μm和20μm的处理组。vp2是检测的目标蛋白，β-actin作为内参。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

实验试剂

生长培养基(gm)：dmem(gibco,usa)加10％胎牛血清(gibco,usa)，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

维持培养基(mm)：dmem(gibco,usa)加2％胎牛血清(gibco,usa)和100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

closantel：购自selleck(usa)，药品参数：s4106(浓度：10mm)。

closantelsodium：购自selleck(usa)，药品参数：s4105(浓度：10mm)。

gemcitabinehcl：购自selleck(usa)，药品参数：s1149(浓度：10mm)。

trifluridine：购自selleck(usa)，药品参数：s1778(浓度：10mm)。

gemcitabine：购自selleck(usa)，药品参数：s1714(浓度：10mm)。

cladribine：购自selleck(usa)，药品参数：s1199(浓度：10mm)。

cidofovir：购自selleck(usa)，药品参数：s1516(浓度：10mm)。

抗vp2单克隆抗体，购自ingenasa，西班牙，货号：m.15.cpv.i5f8。

fitc标记的羊抗鼠igg(h+l)的二抗(1：200稀释)购自thermoscientific，usa，货号：a16079。

β-actin单克隆抗体(ac-15)，购自thermoscientific，usa，货号：ma1-91399。

hrp标记的羊抗鼠igg购自thermoscientific，usa，货号：31430。

cellcountingkit，购自transgenbiotech，china，目录号：fc101-01。

哺乳动物总蛋白提取试剂盒(mammaliantotalproteinextractionkit)，transgenbiotech，china，目录号：de101-01。

supersignal^tmwestpicoplus化学发光底物检测试剂盒，购自thermoscientific，usa，货号：34579。

dmso(二甲基亚砜)：cas号67-68-5，sigma-aldrich，d2650。

4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(dapi)：cas号28718-90-3，thermoscientific，d3571。

20×tbs-tween20：购自thermoscientific，货号28360。

pbs购自gibco^tm，usa，货号：20012050。

细胞与病毒

f81细胞购自atcc(美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)。f81细胞在生长培养基(gm)中培养，gm由dmem(gibco,usa)、10％胎牛血清(gibco,usa)和100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素组成。维持培养基(mm)由dmem(gibco,usa)、2％胎牛血清(gibco,usa)和100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素组成。

newcpv-2a型毒株sd6及newcpv-2b型毒株sd3由北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室分离并保存。毒株sd6和毒株sd3的vp2蛋白编码基因与bj14-7(genbank:kt162031,newcpv-2a)及bj14-1(genbank:kt162022,newcpv-2b)相应vp2蛋白编码基因的核苷酸序列同源性高达99.9％和99.3％。记载了毒株sd6和毒株sd3的非专利文献为：hongzhuanzhou,xiasu,lululin,jinzhang,qiqi,fangfangguo,fuzhouxu,bingyang.inhibitoryeffectsofantiviraldrugcandidatesoncanineparvovirusinf81cells.viruses.2019aug；11(8):742.doi:10.3390/v11080742.pmid:31412574.

申请人声明，自申请日起二十年内，可以提供newcpv-2a型毒株sd6及newcpv-2b毒株sd3给公众用于研究目的的实验。

若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1.6种小分子药物对f81细胞中cpv抑制保护效果的测定

f81细胞购在使用前，将4μl小分子药物(closantel/closantelsodium/gemcitabinehcl/trifluridine/gemcitabine/cladribine)(10mm)以及4μl对照药物cidofovir(10mm)分别加到156μl维持培养基(mm)中，制备得到250μm药物储备溶液。

药物处理组：使用各药物储备溶液分别对f81细胞进行处理。每个处理组向86μlf81细胞(每孔25,000个细胞)中加入4μl250μm药物储备溶液，每种药物的终浓度为10μm，持续处理1h后，用10μlcpv(newcpv-2a型毒株sd6)以0.076的moi(multiplicityofinfection，感染复数)感染经过药物处理的f81细胞。在感染后40小时检测细胞活力。

阳性对照：向f81细胞中加入dmso至终浓度为0.1％(体积分数)。在加入dmso后40小时检测细胞活力。

阴性对照：向f81细胞中加入dmso至终浓度为0.1％(体积分数)，1h后用cpv(newcpv-2a型毒株sd6)以0.076的moi感染f81细胞。在感染后40小时检测细胞活力。

用cellcountingkit(transgenbiotech，china，fc101-01)按照试剂盒使用说明书检测细胞活力。没有cpv感染的孔作为100％抑制保护的阳性(细胞)对照孔，以感染cpv(newcpv-2a型毒株sd6)的孔作为0％抑制保护的阴性(病毒)对照孔。使用以下公式计算抑制百分比：cpe抑制百分比＝(药物处理细胞的od450-阴性对照的od450)/(阳性对照的od450-阴性对照的od450)*100，试验重复3次。

结果如图2所示：

抑制保护试验结果显示，6种小分子药物能够很好的保护cpv感染后的细胞。根据试验定义没有cpv感染的孔作为100％抑制保护阳性对照，而感染cpv的孔(未加任何药物)作为0％抑制保护阴性对照，经过公式计算，closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine的抑制保护率(即cpe抑制百分比)分别为80.64±7.87，69.76±6.06，64.18±0.97，57.11±5.45，56.1±2.09和50.92±1.58％，而广谱抗dna病毒药物cidofovir的抑制保护率(即cpe抑制百分比)仅为-1.28±1.03％，二者差异极显著(p<0.0001)，如图2所示。

实施例2.6种小分子药物50％效应浓度(50％antiviralefficacy,ec50)及50％细胞毒性浓度(50％cytotoxicityconcentrations,cc50)的测定

利用剂量反应试验测定药物的ec50和cc50。具体如下：

ec50测定步骤为：将86μlf81细胞(每孔25,000个细胞)用4μl倍比稀释的药物(closantel/closantelsodium/gemcitabinehcl/trifluridine/gemcitabine/cladribine)(最终浓度范围为0.3125-20μm)预处理1h，然后用10μlcpv(newcpv-2a型毒株sd6)(moi＝0.076)感染经过药物处理后的细胞。

cc50测定步骤为：将96μlf81细胞(每孔25,000个细胞)与4μl倍比稀释的药物(最终浓度范围为0.3125-80μm)混合。

ec50和cc50测定均进行3次重复。孵育40小时后，用cellcountingkit(transgenbiotech，china，fc101-01)按照试剂盒使用说明书测定细胞活力，进而确定6种小分子药物对cpv感染的抑制效率及各自对f81细胞的毒性，并通过graphpadprism软件中的剂量反应非线性回归分析方法计算ec50和cc50值。

结果如图3和图4所示：

closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine抑制毒株sd6(newcpv-2a)对f81细胞感染的半数抗病毒效应浓度(ec50)分别为7.77μm，6.01μm，0.68μm，9.35μm，0.62μm和0.32μm。

closantel，closantelsodium，gemcitabinehcl，trifluridine，gemcitabine和cladribine对f81细胞半数毒性浓度(cc50)分别为13.69μm，19.08μm，141.6μm，>160μm，40.03μm和40.21μm。

实施例3.免疫荧光试验(immunofluorescenceassay,ifa)检测6种小分子药物对病毒vp2蛋白表达的抑制

药物处理组：将96孔板中的f81细胞86μl(每孔25,000个细胞)用4μl倍比稀释的药物(closantel/closantelsodium/gemcitabinehcl/trifluridine/gemcitabine/cladribine)(药物最终浓度分别为5μm，10μm和20μm)预处理1小时，处理后的细胞用10μlcpv(newcpv-2a型毒株sd6)(moi＝0.076)感染。感染后约30小时进行免疫荧光试验。

对照组：向96孔板中的f81细胞中加入dmso至终浓度为0.1％(体积分数)，30小时后进行免疫荧光试验。

免疫荧光试验：

固定：弃96孔板中的培养液，用1×pbs(gibco^tm，usa，货号：20012050)洗3次，2-3min/次。用80％丙酮(丙酮与水的体积比为4:1)固定细胞，每孔加入100μl80％丙酮，室温孵育10min。用1×pbs洗3次，2-3min/次。

封闭：在室温下加入3％bsa(100ml1×pbs中加入3gbsa)封闭，室温1小时。1×pbs洗10min。

一抗：用小鼠抗vp2单克隆抗体(ingenasa，西班牙，m.15.cpv.i5f8)(1：100稀释，用1×pbs稀释)孵育40分钟。弃抗体液，用1×pbs洗3次，10min/次。

二抗：用fitc标记的羊抗鼠igg(h+l)的二抗(invitrogen，usa，a16079)(1：200稀释，用1×pbs稀释)孵育40分钟。弃抗体液，用1×pbs洗3次，10min/次。

染色：用4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(dapi，1μg/ml)染色，避光于室温反应10min。弃染色液，用1×pbs洗3次，10min/次。

用incellanalyzer2500hs细胞成像分析系统(operetta，perkinelmer，usa)以20x放大率检查细胞，并通过imagej图像处理软件分析。

结果如图5所示，未加任何药物的对照组，使用抗vp2的单克隆抗体检测发现，视野中有大量vp2蛋白的表达(图5的对照fitc)。在加入小分子药物(closantel/closantelsodium/gemcitabinehcl/trifluridine/gemcitabine/cladribine)的处理组中，随着药物浓度的增加，均可检测到vp2蛋白信号减少，在药物终浓度为5μm浓度时与对照组相比即显示差异，在药物终浓度为10μm及20μm浓度时，检测到的荧光信号逐渐减少。证明6种小分子药物能够成功抑制cpv在f81细胞中的复制(图5)。

实施例4.6种小分子药物对不同基因型cpv毒株的抑制实验

药物处理组：将f81细胞以每孔7.5×10⁵个细胞接种于6孔板中，并用不同浓度的药物(closantel/closantelsodium/gemcitabinehcl/trifluridine/gemcitabine/cladribine)(药物最终浓度分别为5μm，10μm和20μm)预处理1小时，每种药物处理后的细胞分别用不同基因型的cpv(newcpv-2a型毒株sd6及newcpv-2b型毒株sd3)感染(moi＝0.076)，孵育40小时后提取细胞总蛋白并进行westernblot试验。

对照组：向f81细胞中加入dmso至终浓度为0.1％(体积分数)，孵育40小时后提取细胞总蛋白并进行westernblot试验。

蛋白提取及westernblot试验：

收集细胞并用哺乳动物总蛋白提取试剂盒proteinext(transgenbiotech，china，de101-01)按照试剂盒说明书进行细胞裂解。等量的细胞裂解物经sds-page蛋白电泳后转移至pvdf膜(millipore，usa)。在室温下用含5％脱脂奶的tbs-tween20(100mltbs-tween20中加入5g脱脂奶粉)封闭1小时后，使用抗vp2单克隆抗体(ingenasa，西班牙，m.15.cpv.i5f8)和β-actin单克隆抗体(ac-15)(thermoscientific，usa，ma1-91399)，分别按照1：800和1：4000稀释(用tbs-tween20稀释)，并在4℃孵育过夜。tbs-tween20洗涤3次，10min/次。使用hrp标记的羊抗鼠igg(thermoscientific，usa，货号：31430)(用tbs-tween20按照1：6000稀释)在37℃下孵育1小时。tbs-tween20洗涤3次，10min/次。使用supersignal^tmwestpicoplus化学发光底物检测试剂盒(thermoscientific，usa，34579)按照试剂盒说明书检测条带，并通过化学发光装置(proteinsimple，usa)成像。

westernblot结果如图6所示，6种小分子药物均能够抑制毒株sd6(newcpv-2a)及毒株sd3(newcpv-2b)这两种不同基因型cpv病毒的vp2蛋白表达，与不加药物的对照组相比，差异明显。并且随着药物浓度的增加，两种基因型病毒的vp2蛋白表达量均逐渐降低，在药物终浓度为10μm及20μm浓度时，条带较弱，证明以上6种小分子药物对不同基因型的cpv毒株均能很好地抑制病毒的复制(图6)。