一种用于预防和/或治疗心肌病和肾病的药物组合物及其制备方法和应用

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于预防和/或治疗心肌病和肾病的药物组合物及其制备方法和应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

近年来，由于肥胖和不均衡饮食等问题，糖尿病、高血压、冠心病发病率持续上升，发病年轻化趋势十分明显。这些疾病的并发症很多，危害极大，主要包括心肌病、脑梗死等心脑血管疾病以及肾病、视网膜病变和周围神经病变等。心肌病和肾病是糖尿病、高血压及冠心病的重要并发症，可使患者的生存质量降低，经济负担加重，最终导致死亡。因此，延缓心肾重构和功能减退、改善其生存质量并减轻其经济负担，是我国一个重大民生和社会问题，具有重大社会意义和经济效益。已知糖尿病所致心肾重构的病理机制涉及微血管损伤、间质纤维化、细胞凋亡等环节，而其发病和病程进展中关键的调控靶点尚未明确。因此，进一步阐明心肾重构的发生机制并寻找有效的干预措施是当前心血管病领域一个亟待解决的重大课题。既往研究证实，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem，ras)异常在心肾重构中起着重要作用。寻找ras新成员是科学研究的难点，也是心肌重构和心力衰竭靶向治疗的迫切需求。

传统的ras包括肾素、血管紧张素原、血管紧张素转化酶(ace)、血管紧张素ⅰ(angi)、血管紧张素ⅱ(angii)、ang-ii1型受体(at1r)和醛固酮，angii和醛固酮在糖尿病性心肌病发病中起到关键作用。近年来学者们开始探索ras新成员在在心肌重构和心力衰竭中的作用和机制，这些新成员包括：血管紧张素转化酶2(ace2)、血管紧张素(1–7)[ang-(1–7)]、mas受体(masr)、at2受体(at2r)、血管紧张素(1–9)[ang-(1–9)]、血管紧张素(1–5)[ang-(1–5)]、血管紧张素ⅲ(angiii)、血管紧张素ⅳ(angiv)等。

近年来国内外研究报道，angii、ang-(1–7)、at1r、at2r和masr参与心肌细胞损伤和保护。尽管angiv被认为具有和angii相反的生物学作用，angiv的药理、制剂和转化医学等研究领域仍然鲜有报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种用于预防和/或治疗心肌病和肾病的药物组合物及其制备方法和应用。本发明研究发现，angiv可应用于心肌病和肾病的治疗，并进一步制成纳米颗粒药物制剂，经试验证明，其能够明显改善糖尿病小鼠左室收缩和舒张功能，减轻糖尿病小鼠心肌纤维化，并减轻尿蛋白，提高肾肌酐清除率，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供angiv多肽在制备预防和/或治疗心肌病和肾病药物中的应用。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗心肌病和肾病及相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

其中，所述心肌病为糖尿病性心肌病，所述肾病为糖尿病性肾病。

根据本发明，不仅公开了angiv多肽在制备预防和/或治疗心肌病和肾病药物中的应用，而且还公开了，施用angiv多肽与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，angiv多肽还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的第二个方面，供一种药物组合物，所述药物组合物其活性成分由angiv多肽与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

本发明的第三个方面，提供一种纳米颗粒，其包含上述angiv多肽或上述药物组合物。

如上所述的纳米颗粒为壳聚糖纳米颗粒，壳聚糖包载上述angiv多肽或上述药物组合物。所述纳米颗粒粒径控制为150～450nm。

本发明的第四个方面，提供上述纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括：

s1、将壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph，得溶液i；

s2、将angiv多肽加入三聚磷酸钠(tpp)水溶液中溶解，将angiv多肽和三聚磷酸钠混合溶液滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。

本发明的第五个方面，提供上述angiv多肽、药物组合物和/或纳米颗粒在制备具有如下任意一种或多种功能的药物中的应用：

1)改善糖尿病患者左室收缩和舒张功能；

2)降低糖尿病患者心脏间质沉积；

3)降低糖尿病患者血管周围胶原沉积；

4)减轻糖尿病患者心肌纤维化；

5)减轻糖尿病性患者肾病尿蛋白；

6)提高肾肌酐清除率。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次报道了angiv多肽具有治疗糖尿病性心肌病和肾病的作用，并进一步将其与壳聚糖制备得到纳米颗粒，通过优化制备工艺，最终其包封率可达88.2％；纳米颗粒粒径集中在150～450nm之间。

经试验验证，上述技术方案制得纳米颗粒制剂可明显改善糖尿病小鼠左室收缩和舒张功能，减轻糖尿病小鼠心肌纤维化，并减轻尿蛋白，提高肾肌酐清除率，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中angiv壳聚糖纳米颗粒粒度分布图；

图2为本发明实施例中angiv壳聚糖纳米颗粒灌胃给药改善糖尿病小鼠的左室收缩和舒张功能。a：超声心动图结果示意图；b-e：依次为定量分析左室射血分数(lvef)、缩短分数(fs)、二尖瓣舒张早期与晚期血流速度比值(e/a)和二尖瓣瓣环舒张早期与晚期峰值速度比值(e’/a’)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；

图3为本发明实施例中angiv壳聚糖纳米颗粒灌胃给药改善糖尿病小鼠的左室心肌纤维化。a：masson染色结果示意图；b：定量分析胶原容积分数(cvf)和血管周围胶原面积/管腔面积的比值。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；

图4为本发明实施例中angiv壳聚糖纳米颗粒灌胃给药对糖尿病小鼠尿蛋白定量和肌酐清除率的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

目前，基于angiv研发的药物制剂在糖尿病性心肌病和肾病中的应用尚未见报道。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供angiv多肽在制备预防和/或治疗心肌病和肾病药物中的应用。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗心肌病和肾病相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

本发明的又一具体实施方式中，所述心肌病为糖尿病性心肌病，所述肾病为糖尿病性肾病。

根据本发明，不仅公开了angiv多肽在制备预防和/或治疗心肌病和肾病药物中的应用，而且还公开了，施用angiv多肽与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，angiv多肽还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的又一具体实施方式中，供一种药物组合物，所述药物组合物其活性成分由angiv多肽与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

其他非药物活性成分包括但不限于药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种纳米颗粒，其包含上述angiv多肽或上述药物组合物。

如上所述的纳米颗粒为壳聚糖纳米颗粒，壳聚糖包载上述angiv多肽或上述药物组合物。所述纳米颗粒粒径控制为150～450nm。

本发明的又一具体实施方式中，壳聚糖分子量范围200～2000kda，更进一步优选为250～1200kda，最优选为600kda，脱乙酰度大于90％。

angiv作为一种小分子多肽，口服给药生物利用度低，静脉、皮下或肌肉注射给药存在半衰期短、给药不方便等缺点。壳聚糖可以附着到黏膜的表面，并能打开上皮细胞的紧密联结，因此，壳聚糖可作为大分子药物的促进剂以提高其生物利用度。为了改善angiv口服生物利用度低的缺点，并达到缓释、长效的目的，本发明采用离子交联法将其制备成壳聚糖纳米颗粒。在试验过程中发现，不同壳聚糖分子量、壳聚糖溶液ph等都会影响对angiv的包封效果，其中利用壳聚糖分子量范围为250～1200kda，脱乙酰度大于90％，壳聚糖溶液ph值在4.5～6.0范围内，对angiv的包封率高达88.2％；当壳聚糖分子量小于250kda或大于1200kda时，包封率会逐渐下降。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括：

s1、将壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph，得溶液i；

s2、将angiv多肽加入三聚磷酸钠(tpp)水溶液中溶解，将angiv多肽和三聚磷酸钠混合溶液滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。

本发明的又一具体实施方式中，壳聚糖分子量范围200～2000kda，更进一步优选为250～1200kda，最优选为600kda，脱乙酰度大于90％。

本发明的又一具体实施方式中，步骤s1中，调节ph值至4.5～6.0，优选的，调节ph值至5.5。

本发明的又一具体实施方式中，步骤s2中，三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:10～30，优选为1:30；通过优化三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比，同时配合其他参数条件，从而制备得到具有良好粒径大小和形态的纳米颗粒。

本发明的又一具体实施方式中，纳米颗粒粒径为150～450nm。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述angiv多肽、药物组合物和/或纳米颗粒在制备具有如下任意一种或多种功能的药物中的应用：

1)改善糖尿病患者左室收缩和舒张功能；

2)降低糖尿病患者心脏间质沉积；

3)降低糖尿病患者血管周围胶原沉积；

4)减轻糖尿病患者心肌纤维化；

5)减轻糖尿病性患者肾病尿蛋白；

6)提高肾肌酐清除率。

本发明的又一具体实施方式中，所述患者包括人和非人哺乳动物，如大鼠、小鼠、兔、猴、猩猩等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1一种用于治疗和/或预防心肌病和肾病的药物组合物

所述药物组合物为包载angiv多肽的壳聚糖纳米颗粒。

所述包载angiv多肽的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将30mg分子量为600kda壳聚糖溶于8ml10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph至5.5，得溶液i；

(2)取浓度为1.5μmol/dlangiv多肽溶液2ml，0.5mg/ml三聚磷酸钠(tpp)水溶液2ml混合搅拌(1000转/分钟)均匀，将angiv多肽和tpp混合溶液以1滴/3～5秒的速度滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。将混悬液于4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次3分钟，冷冻干燥即得。

实施例2一种用于治疗和/或预防心肌病和肾病的药物组合物

所述药物组合物为包载angiv多肽的壳聚糖纳米颗粒。

所述包载angiv多肽的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将10mg，分子量为250kda壳聚糖溶于8ml10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph至5.5，得溶液i；

(2)取浓度为1.5μmol/dlangiv多肽溶液2ml，0.5mg/mltpp水溶液2ml混合搅拌(1000转/分钟)均匀，将angiv多肽和tpp混合溶液以1滴/3～5秒的速度滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。将混悬液于4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次3分钟，冷冻干燥即得。

实施例3一种用于治疗和/或预防心肌病和肾病的药物组合物

所述药物组合物为包载angiv多肽的壳聚糖纳米颗粒。

所述包载angiv多肽的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将20mg分子量为1200kda壳聚糖溶于8ml10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph至5.5，得溶液i；

(2)取浓度为1.5μmol/dlangiv多肽溶液2ml，0.5mg/mltpp水溶液2ml混合搅拌(1000转/分钟)均匀，将angiv多肽和tpp混合溶液以1滴/3～5秒的速度滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。将混悬液于4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次3分钟，冷冻干燥即得。

试验例1angiv壳聚糖纳米粒制备工艺优化

将angiv壳聚糖纳米颗粒混悬液滴到铜网上，2％磷钨酸钠染色。利用光散射测定仪测定纳米粒制剂的粒径范围，结果显示，angiv壳聚糖纳米颗粒的粒径小于600nm，集中于150～450nm间。如图1所示。

表1为不同因素对包载angiv多肽的壳聚糖纳米颗粒的物理性质以及载药性能的影响。

试验例2angiv壳聚糖纳米颗粒对糖尿病性小鼠心脏和肾脏的影响研究

(一)实验方法

(1)动物分组干预：选择8周龄雄性c57bl/6小鼠，全部普通饮食喂养。先将c57小鼠分为以下各组干预：正常对照组、糖尿病模型组、小剂量angiv组、中剂量angiv组及大剂量angiv组。腹腔注射链脲佐菌素(stz)建立糖尿病动物模型。将stz按1％的浓度溶于0.1mol/l的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(ph4.2～4.5)，糖尿病组小鼠给予腹腔注射stz溶液(55mg/kg·day)连续5天，以诱导其产生糖尿病。正常对照组小鼠给予平行注射相同剂量的空白溶媒。stz注射2个月后开始给予angiv干预4个月，利用皮下埋置渗透泵持续泵入给药；小剂量angiv组剂量0.72mg/kg·day，中剂量angiv组剂量1.44mg/kg·day，大剂量angiv组剂量2.88mg/kg·day。注射stz后第6个月末将小鼠安乐死，取出心脏和肾脏，检测纤维化等组织病理学改变。测量24h尿蛋白定量及肌酐清除率。

(2)心脏超声检测

由对研究内容不知情的技术人员应用vevo2100型超高分辨率小动物超声仪进行心脏超声检测。给予小鼠2％异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定于37℃恒温加热板上，左胸前脱毛后进行超声检测，记录以下参数：左室内径、左室舒张末期容积(lvedv)、左室收缩末期容积(lvesv)、左室射血分数(lvef)和缩短分数(fs)。脉冲波多普勒测量二尖瓣舒张早期(e)和晚期(a)血流速度及其比值；组织多普勒测量二尖瓣瓣环舒张早期(e')和晚期(a')峰值速度及其比值。

(3)统计学分析

采用spssv21.0软件进行数据分析。连续型变量用平均值±标准误或中位数[四分位数间距]表示，如果服从正态分布，采用方差分析进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，进一步采用bonferroni法进行两两比较。如果不服从正态分布，组间比较采用kruskal-wallis秩和检验，如果组间差异有统计学意义，进一步采用dwass-steel-critchlow-fligner法进行多重比较。分类变量根据其无序或有序的性质，采用卡方检验或kruskal-wallis秩和检验。双侧p＜0.05时认为差异有统计学意义。

(二)实验结果

小鼠超声心动图检测结果显示，angiv壳聚糖纳米颗粒灌胃给药可改善糖尿病小鼠的左室收缩和舒张功能。在stz注射后2个月结束时，正常小鼠和糖尿病小鼠之间的lvef、fs、e/a和e'/a'相似。在4个月和6个月结束时，糖尿病小鼠中的lvef、fs、e/a和e'/a'与正常小鼠相比显著降低。angiv壳聚糖纳米颗粒干预2个月和4个月可以剂量依赖性地逆转左心室功能。如图2所示。

与正常心脏相比，糖尿病心脏显示出显著的心肌紊乱。然而，这些心肌形态学异常在angiv壳聚糖纳米颗粒干预后得到了剂量依赖性的缓解。angiv剂量依赖性地降低糖尿病心脏间质和血管周围胶原沉积。这些结果表明，angiv能剂量依赖性地减轻糖尿病小鼠的心肌纤维化。如图3所示。

如图4所示，angiv壳聚糖纳米颗粒灌胃给药可剂量依赖性地降低糖尿病肾病小鼠24h尿蛋白水平，并剂量依赖性地升高肾肌酐清除率。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。