脑胶质瘤靶向小檗碱与叶酸修饰的脂质材料的制备与应用

1.本发明涉及一类脑胶质瘤靶向小檗碱与叶酸修饰的脂质材料的制备与在药物传递系统中的应用，其具有延长体内循环和脑胶质瘤靶向药物传递的功能，能实现线粒体靶向消除多药耐药（mdr），是一类能在肿瘤细胞内断键的智能化脂质体。本发明包括该材料的制备，及其作为药物载体在药物传递中的应用，属于医药技术和化学合成领域。


背景技术：

2.我国脑肿瘤的发病率逐渐增加，其具有发展快、预后差、易复发的特点，严重危害人类生命，尤以脑胶质瘤为甚。脑胶质瘤（glioma）约占所有颅内肿瘤的51%，是中枢神经系统（central nervous system，cns）最为常见的原发性恶性肿瘤之一。其2年总体生存率仅为3%
‑
5%，中位生存时间约为14个月，并且由于其高恶性、复发率与致残率，是人类健康的一大威胁。通常用于脑胶质瘤的治疗措施主要有手术治疗、放疗和化疗。由于脑胶质瘤恶性程度高，呈浸润性生长，与正常脑组织边界很难区分，手术不易全部切除，且脑部手术技术要求高、创伤严重、易感染，术后对患者进行放射治疗虽有一定疗效，但同样无法根除同时还易损伤中枢神经；实践证明，化疗是肿瘤诸多治疗环节中至关重要的一环，其成败对病人的生活质量和预后影响重大。然而化疗，因无组织及器官特异性，药物呈全身分布，且由于脑特有的解剖结构，使得脑药浓度底，疗效差，毒副作用大。而脑肿瘤化疗疗效的关键在于化疗药物能否透过血脑屏障（blood
‑
brain barrier, bbb）并选择性转运到肿瘤部位。血脑屏障作为血液与中枢神经系统（central nerve system, cns）之间的调节界面，对维持中枢神经系统内的环境恒定有至关重要的作用。由脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及它们之间的基底膜组成的血脑屏障（bbb）在保护中枢神经系统的同时，也限制了许多物质从血液中进入脑部，几乎所有大分子和98％的小分子药物都不能透过血脑屏障进入中枢神经系统，使得对中枢神经系统有效的药物很难进入病灶部位并达到有效的治疗浓度，因而无法达到预期的治疗效果，抗肿瘤药物同样也很难透过bbb，因此如何提高药物的bbb透过率，选择性地将化疗药物转运到肿瘤部位，从而提高其疗效、降低其副作用并消除多药耐药(mdr)仍是一个需要解决的关键问题。
3.纳米载体已广泛应用于化疗给药，在脑胶质瘤靶向给药和治疗胶质瘤方面显示出巨大的临床潜力。依托于纳米载体，包括聚合物nps，胶束，脂质体，蛋白质纳米笼和无机nps等，利用成熟的内源性血脑屏障运输路线将物资运送入脑，已被广泛报道用于脑胶质瘤的治疗当中，基于纳米载体的“特洛伊木马”方法，是很有前途的非侵入性策略，用以穿透血脑屏障提高治疗效果。其包括载体介导的胞吞转运(cmt), 受体介导的胞吞转运(rmt), 吸附介导的细胞转运（amt）和细胞介导。低密度脂蛋白(ldl)受体家族(ldlrs)在血脑屏障上高表达，其对载脂蛋白b(apob)和载脂蛋e（apoe）片段以及angiopep
‑
2 (ang, tffyggsrgkrnnfkteey)等多肽具有高的亲和力。吐温80 (tween 80, t
‑
80)，一种非离子水溶性表面活性剂。大量研究表明，吐温80覆盖的纳米颗粒能够在给药后载药穿过血脑屏障，从而将药物输送到大脑。其主要机制被认为是血浆中的载脂蛋白（如载脂蛋白e (apoe)或
载脂蛋白b (apob)）被吸附在tween80上，然后通过低密度脂蛋白(ldl)受体介导的内吞作用将纳米载体运输到大脑。
4.叶酸受体(fr)是一种38kda的糖基磷脂酰肌醇糖蛋白，是癌症治疗中研究最多的靶点之一，与正常组织相比，许多癌细胞的叶酸受体数量显著上调，在某些情况下可上调两个数量级。此外，正常细胞可运输较少的叶酸通过其膜，但不会运输任何类型的叶酸缀合物。而恶性细胞可通过叶酸受体运输叶酸缀合物。叶酸(fa)是一种低分子维生素，合成嘌呤和嘧啶时其作为重要的前体物资，其与叶酸受体具有很高的亲和力，此外，研究表明在卵巢癌、肺癌、脑癌、头颈部癌、肾细胞癌和乳腺癌中fr过度表达。叶酸配体不仅廉价、无毒、无免疫原性，而且因其易于与载体结合、保持高亲和力而被广泛应用，其可与血脑屏障过表达的叶酸受体结合，通过受体介导的胞饮作用促进药物对血脑屏障的渗透。此外，fr在胶质瘤上的过表达，也使其成为肿瘤靶向的良好候选。
5.常规药物治疗在脑胶质瘤过程中可能诱导多药耐药(mdr)，结果使化疗药物呈全身分布而更少药物的保留在肿瘤组织，进而破坏正常组织，从而造成严重的副作用。而线粒体在细胞凋亡和肿瘤抗凋亡过程中起中枢调控作用，是理想的抗肿瘤靶点。以线粒体为导向的智能脂质体运输被认为是一种消除多药耐药（mdr）的很有前途的策略。小檗碱（berberine, bbr）是一种异喹啉类生物碱，具有多种显著的药理作用，包括抗菌、抗病毒、抗糖尿病、抗炎和抗癌。值得注意的是，bbr可以选择性地聚集到癌细胞的线粒体中，这与bbr的亲脂结构和离域正电荷有关。此外，bbr作用于线粒体亦可诱导癌细胞凋亡，这被认为与bbr可消除线粒体膜电位，上调ros水平，诱导线粒体膜通透性的变化有关。然而，带正电的纳米粒子通常表现出较差的血浆稳定性，可迅速从血液循环中清除，并可引起严重的细胞毒性。


技术实现要素：

6.本研究的目的是提出一类吐温80包覆的小檗碱与叶酸共修饰的脂质体用户脑胶质瘤的治疗。
7.脂质体表面以吐温80包覆，能够通过与低密度脂蛋白受体结合后通过受体介导的内吞有效穿过血脑屏障，从而将药物输送到大脑，增加脑内化疗药物浓度。在此基础上，脂质体以叶酸修饰用于提升脂质体的脑胶质瘤靶向，利用叶酸与脑胶质瘤细胞强的特异性结合，实现更强的脑肿瘤靶向性，进一步增加药物在肿瘤组织的浓度，发挥出更高效的抗脑胶质瘤作用，同时降低药物在外周器官的分布，减少药物的毒副作用。而聚乙二醇长链的引入稳定脂质体的同时实现脂质体的体内长循环，并在酸性肿瘤细胞细胞器(核内体、溶酶体)的ph下智能化触发酸敏感腙键的水解断裂，暴露出小檗碱，利用正电荷与高负电位的肿瘤线粒体结合，实现线粒体靶向，消除肿瘤的多药耐药(mdr)问题。该材料可用于制备一种极具潜力的多重靶向能力的多功能智能脂质体，可为脑胶质瘤的靶向治疗提供新的思路与方法，拥有广阔的应用前景。
8.本发明提供通式（i）所示结构或其药学上可接受的盐或水合物，脂质材料（i）特征在于：以酸敏感键为连接基团，一端连接聚乙二醇（peg）和具有脑胶质瘤靶向的叶酸，另外一端连接胆固醇
‑
多缩乙二醇缀合物：
其中，所用peg的分子量等于但并不仅限于200、400、600、800、1000、1500、2000、3350、4000等；所用多缩乙二醇等于但不限于三甘醇、四甘醇、六甘醇、八甘醇等，即n=3、4、6、8；所用酸敏感键等于但并不仅限于腙键、亚胺键、肟键、半缩醛（酮）等。
9.通式（i）所示化合物的具体制备方法以fa
‑
peg3350
‑
hz
‑
chol为例：chol为例：chol为例：
本发明提供通式（ii）所示结构或其药学上可接受的盐或水合物，脂质材料（ii）特征在于：以多缩乙二醇为骨架，一端连接胆固醇，另外一端连接具有线粒体靶向功能的小檗碱：其中，所用多缩乙二醇为等于但并不仅三甘醇、四甘醇、六甘醇、八甘醇等，即a\b=3、4、6、8。
10.通式（ii）所示化合物的具体制备方法以bbr
‑
chol为例：
本发明所述的新型脂质材料可以作为配体用于制备脑胶质瘤靶向的脂质体。
11.所述脂质体其特征在于包含磷脂、胆固醇、吐温80、fa
‑
peg3350
‑
hz
‑
chol、bbr
‑
chol及活性剂。
12.所述脂质体主要由膜材与活性剂组成，其膜材为磷脂双分子层，由大豆磷脂，胆固醇以及脂质体配体组成，其中，各组分配比关系如下：胆固醇和磷脂的摩尔比为1~2:1~5，脂质体配体的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的1~20%。本发明所述的活性剂优选治疗剂或显影剂，如本领域所知的，活性剂的剂量可以依据包含在甾体中的活性剂来调整，其中按重量百分数计算，活性剂占总脂质的0.1％~50％。
13.所述的脂质体中的磷脂包括所有类型的磷脂，包括但不限于大豆磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油；优选卵磷脂。
14.本发明所述的脑胶质瘤靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：（一）将磷脂、胆固醇、紫杉醇溶解在氯仿/甲醇混合溶剂(v/v = 2:1)中，然后在37℃真空下旋转蒸发除去有机溶剂，形成完整的脂质膜层。
15.（二）真空保存过夜，除去残余溶剂。
16.（三）加入吐温80，在20℃下缓冲液中水化0.5 h，然后用探头式超声仪在80 w下间歇超声，在冰水浴中超声80 s，得到微乳状脂质体溶液。
具体实施方式
17.以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
18.所述的新型脂质材料具体由以下步骤制备：实施例1 化合物2的制备化合物1（19.88 g，51.40mmol）置于反应瓶，氩气置换3次，溶于65 ml混合溶剂（52 ml无水二氯甲烷+13 ml无水吡啶），室温搅拌下依次加入丁二酸酐（3.30 g，33.60 mmol），dmap（632.0 mg, 5.170mmol），加毕，室温搅拌反应16 h，tlc监测原料反应完毕，停止反应，
5.36 (dt, j = 3.3, 1.6 hz, 1h), 4.62 (dtt, j = 11.4, 8.0, 4.1 hz, 1h), 4.31
ꢀ–ꢀ
4.21 (m, 4h), 3.73
ꢀ–ꢀ
3.62 (m, 12h), 2.72
ꢀ–ꢀ
2.56 (m, 8h), 0.70
‑
2.40 (remaining cholesterol protons), 0.67 (s, 3h)。
22.实施例5化合物6的制备化合物5（4.936 g，6.47 mmol）称入反应瓶中，氩气置换三次，以50 ml无水二氯甲烷溶清，于
‑
5℃搅拌，在氩气保护下依次加入氯甲酸异丁酯（ibcf，1.325 g，9.70 mmol）和n
‑
甲基吗啉（nmm，1.309 g，12.94 mmol），加毕，继续活化30 min。将化合物肼基甲酸叔丁酯（1.282 g，9.70 mmol）以5.0 ml无水二氯甲烷溶清并加入上述反应液中，移至室温反应2 h，tlc监测反应完毕。减压浓缩除去反应体系中的溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 4：1），得白色泡沫状固体3.271 g，收率57.34%。1h nmr (400 mhz, chloroform
‑
d) δ 5.40
ꢀ–ꢀ
5.32 (m, 1h), 4.61 (dtd, j = 11.4, 8.5, 7.9, 4.0 hz, 1h), 4.25 (t, j = 4.8 hz, 4h), 3.75
ꢀ–ꢀ
3.60 (m, 12h), 2.73 (t, j = 6.6 hz, 2h), 2.62 (dq, j = 11.9, 6.2 hz, 4h), 2.52 (t, j = 6.7 hz, 2h), 0.70
‑
2.40 (remaining cholesterol protons), 1.46 (s, 9h) 0.67 (s, 3h)。
23.实施例6化合物7的制备将化合物6（100 mg, 0.11 mmol）用10 ml二氯甲烷溶清，室温下加入三氟乙酸（2.0 ml，20% v/v），室温反应15分钟。tlc监测反应完全，向反应液加入适量饱和碳酸氢钠溶液调至溶液ph=10，用二氯甲烷萃取（10 ml
ꢀ×ꢀ
2），收集二氯甲烷层并用无水硫酸钠干燥，30℃减压浓缩除去溶剂，得到淡棕色色透明油状产物81 mg，收率为91.76%。产品无需纯化直接进行下一步。1h nmr (400 mhz, chloroform
‑
d) δ 7.45 (s, 1h), 5.35 (m, 1h), 4.60 (dtd, j = 11.6, 8.4, 4.2 hz, 1h), 4.24 (td, j = 4.9, 2.0 hz, 4h), 3.67 (d, j = 14.2 hz, 12h), 2.71 (t, j = 6.7 hz, 2h), 2.62 (dq, j = 11.6, 6.1 hz, 4h), 2.44 (t, j = 6.7 hz, 2h), 0.70
‑
2.40 (remaining cholesterol protons), 0.67 (s, 3h)。
24.实施例7化合物9的制备将化合物8（500.0 mg，3.05 mmol）置于反应瓶中，氩气置换3次，用混合溶剂（12 ml无水二氯甲烷+2 ml n,n
‑
二甲基甲酰胺）溶清后移至
‑
5℃搅拌，在氩气保护下加入二环己基碳二亚胺（dcc，1254.9 mg，6.09mmol），4
‑
二甲氨基吡啶(dmap，74.5 mg，0.61 mmol)，在该温度下继续活化30 min。将聚乙二醇（peg3350, 10.216 g，3.05 mmol）用45 ml无水二氯甲烷溶解，溶清后将上述已活化完毕的溶液缓慢滴加到聚乙二醇溶液中，滴加完毕，移至室温反应16 h。tlc监测反应完全，过滤除去不溶物并收集滤液分别用水溶液（100 ml
ꢀ×ꢀ
3）、1n hcl（100 ml
ꢀ×ꢀ
1）、饱和氯化钠溶液（50 ml
ꢀ×ꢀ
1）洗涤，收集二氯甲烷层，有机层用
ml
ꢀ×ꢀ
1）饱和氯化钠水溶液（50 ml
ꢀ×ꢀ
1）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，氯仿/甲醇重结晶得白色固体粉末12.23 g收率87.43%。直接进行下一步反应。mp: 129
‑
132 ℃（文献mp：130
‑
132 ℃）。
28.实施例11化合物12的制备将化合物11（5.000 g, 9.24 mmol）溶于30 ml二氧六环中，加入二缩三乙二醇（teg,6.948 g, 46.26 mmol），回流6小时，tlc监测原料反应完全。减压除去溶剂，残留物用50 ml二氯甲烷溶解后，依次用饱和碳酸氢化钠水溶液洗涤（50 ml
ꢀ×ꢀ
2），饱和氯化钠水溶液洗涤（50 ml
ꢀ×ꢀ
1），有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（石油醚/乙酸乙酯=5/1），得到无色油状物3.066 g，收率63.91%。1h
‑
nmr (400 mhz, cdcl3, ppm) δ: 0.67 (s, 3h), 0.86 (d, 6h, j=4.4 hz), 0.91 (d, 3h, j = 4.4 hz), 1.00 (s, 3h), 0.86
‑
2.38 (remaining cholesterol protons), 3.16
‑
3.21 (m, 1h), 3.62
‑
3.63 (m, 2h), 3.65 (s, 4h), 3.68 (d, 4h, j=2.4 hz), 3.73
‑
3.74 (m, 2h), 5.34 (s, 1h)。
29.实施例12化合物13的制备将化合物4
‑
(叔丁氧羰基)苯甲酸（641.8 mg，2.89 mmol）用10 ml无水二氯甲烷，在氩气保护下分别加入1
‑
（3
‑
二甲氨基丙基）
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（edci，831.4 mg，4.337 mmol）、4
‑
二甲氨基吡啶（dmap，529.9 mg，4.337 mmol）和n,n
‑
二异丙基乙胺（dipea，747.4 mg，5.78 mmol），加毕后，于0 ℃下活化30 min。将化合物12（1.0 g，1.93 mmol）用5 ml无水二氯甲烷溶解，溶清后缓慢滴加入上述活化液中，滴加完毕，移至室温搅拌5 h。tlc监测反应完全，减压浓缩除去反应溶剂，残留物用20 ml二氯甲烷溶解，分别用1mol/l 盐酸水溶液（30 ml
×ꢀ
2）、饱和氯化钠溶液（20 ml）洗涤，收集二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（石油醚/乙酸乙酯=10/1），得淡黄色油状物1168.4 mg，收率为83.82%。
30.实施例13化合物14的制备将化合物13（2.0 g, 2.77 mmol）用1 ml二氯甲烷溶清，冰水浴下依次滴加入以1 ml二氯甲烷溶清的三乙基硅烷（0.804g ，6.92mmol）溶液，三氟乙酸10ml, 室温反应2小时。tlc监测反应完全，减压浓缩除去反应溶剂，残留物用20 ml二氯甲烷溶解，并依次用水（20ml
ꢀ×ꢀ
1）、饱和氯化钠水溶液（20 ml
ꢀ×ꢀ
1）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得透明油状物1.74g，直接用于下一步反应，收率为94.18%。
31.实施例14化合物15的制备将化合物14（1.0 g，1.50 mmol）置于反应瓶中，氩气置换3次，用15 ml无水二氯甲烷溶清后移至
‑
5℃搅拌，在氩气保护下加入二环己基碳二亚胺（dcc，618.0 mg，3.00mmol），4
‑
二甲氨基吡啶(dmap，36.7 mg，0.30 mmol)，在该温度下继续活化30 min。将四甘醇（728.4 mg，3.75 mmol）用5 ml无水二氯甲烷溶解，溶清后将上述已活化完毕的溶液缓慢滴加到四甘醇溶液中，滴加完毕，移至室温反应4 h。tlc监测反应完全，过滤除去不溶物并收
集滤液分别1n hcl（20 ml
ꢀ×ꢀ
2）、饱和氯化钠溶液（15 ml
ꢀ×ꢀ
1）洗涤，收集二氯甲烷层，有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷/甲醇=80/1），得透明油状物546.4 mg，收率为43.20%。1h nmr (400 mhz, dmso
‑
d6) δ 8.08 (s, 4h), 5.25 (d, j = 4.8 hz, 1h), 4.55 (t, j = 5.5 hz, 1h), 4.41 (dd, j = 5.9, 3.5 hz, 4h), 3.79
ꢀ–ꢀ
3.71 (m, 4h), 3.58 (dd, j = 6.2, 3.6 hz, 4h), 3.54
ꢀ–ꢀ
3.42 (m, 14h), 3.37 (t, j = 5.2 hz, 2h), 3.05 (ddt, j = 11.3, 9.0, 4.4 hz, 1h), 0.62 (s, 3h)。
32.实施例15化合物16的制备将化合物15（380.0 mg，0.451 mmol）与四溴化碳（448.7 mg， 1.353mmol）置于反应瓶中，用5 ml二氯甲烷溶清后移至0℃搅拌，三苯基膦（354.9 mg， 1.353mmol）以6 ml 二氯甲烷溶清后滴加入上述溶液，滴毕，将反应液移至室温反应4 h，tlc监测反应完全，减压浓缩除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（石油醚/乙酸乙酯=2/1），得透明油状物345.9 mg，收率为83.19%。1h nmr (400 mhz, dmso
‑
d6) δ 8.02 (s, 4h), 7.58 (m, 2h), 5.20 (s, 1h), 4.37 (dt, j = 7.2, 3.9 hz, 4h), 3.73 (dd, j = 5.9, 3.3 hz, 4h), 3.66 (t, j = 5.8 hz, 2h), 3.55 (d, j = 5.1 hz, 4h), 3.51 (d, j = 5.5 hz, 10h), 3.43 (s, 4h), 3.01 (s, 1h), 0.70
‑
2.40 (remaining cholesterol protons), 0.59 (s, 3h)。
33.实施例16化合物17的制备将化合物16（300.0 mg，0.33 mmol）与小檗红碱（35.0 mg， 0.11mmol）置于反应瓶中，以3ml dmf溶解，氩气置换3次，将反应液移至80℃反应18 h，停止反应，减压浓缩除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷/甲醇=30/1），得黄色固体粉末55.0 mg，收率为44.38%。1h nmr (400 mhz, dmso
‑
d6) δ 9.72 (s, 1h), 8.89 (s, 1h), 8.16 (d, j = 9.2 hz, 1h), 8.04
ꢀ–ꢀ
7.90 (m, 5h), 7.73 (s, 1h), 7.00 (s, 1h), 6.14 (s, 2h), 5.28
ꢀ–ꢀ
5.13 (m, 1h), 4.90 (t, j = 6.4 hz, 2h), 4.38 (dt, j = 9.6, 4.6 hz, 4h), 4.30 (t, j = 4.6 hz, 2h), 4.03 (s, 3h), 3.72 (dt, j = 26.3, 4.5 hz, 6h), 3.56 (ddd, j = 21.7, 8.5, 5.5 hz, 11h), 3.45 (s, 4h), 3.17 (t, j = 6.4 hz, 3h), 3.07
ꢀ–ꢀ
2.94 (m, 1h), 0.70
‑
2.40 (remaining cholesterol protons), 0.59 (s, 3h)。
34.所述的乳腺癌靶向脂质体的具体制备方法：实施例17薄膜水化法作为最为经典脂质体制作方法，具有操作简单，应用广泛的特点。遂本课题采用薄膜水化法制备tween80包覆的bbr与fa共修饰载紫杉醇的脂质体。我们前期对脂质体配方进行了筛选。
35.根据对紫杉醇脂质体的制备摸索，最终我们选取最优化处方：脂质摩尔比65:35（胆固醇：大豆磷脂），水化液为ph7.4的磷酸盐缓冲液（pbs）（0.02m），紫杉醇：脂质材料比为1:30。我们用上述处方分别制备了ptx
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fa
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lip（叶酸修饰的长循环酸敏感脂质体）、ptx
‑
bbr
‑
lip（小檗碱修饰脂质体）、ptx
‑
fa+bbr
‑
lip（叶酸和小檗碱共修饰脂质体）、ptx
‑
tween80
‑
fa+bbr
‑
lip（tween80包覆的bbr与fa共修饰的脂质体）以及对照组ptx
‑
lip。
36.将所有脂质材料溶解在氯仿/甲醇混合溶剂(v/v = 2:1)中，然后在37℃真空下旋转蒸发除去有机溶剂，形成完整的脂质膜层。真空保存过夜后，在37℃下pbs (ph 7.4)中水化0.5 h，然后冰水浴中用探头式超声仪在80 w下间歇超声80 s，得到微乳状脂质体溶液，4℃下10000rpmin离心5 min，除去未载脂质材料，即制得脂质体。而在溶剂蒸发前，将ptx加入上述脂质有机溶液(脂质:紫杉醇= 22:1，质量比)制备ptx脂质体。用高效液相色谱法测定ptx的包封效率(ee)。同样，在溶剂蒸发前加入适量cfpe，制备cfpe标记脂质体。表1：不同配体修饰的载ptx脂质体的粒径、电位及包封率
37.初步靶向性研究
38.实施例18为了验证细胞水平上tween80包覆的bbr与fa共修饰的脂质体的透过血脑屏障并靶向进入肿瘤细胞的能力，将bend.3细胞和c6细胞复苏后，用10%胎牛血清，1%双抗的dmem培养基，37 ℃，5% co2的环境下培养两周，每隔一天换液一次。取对数生长期的细胞按3
×
105接种于12孔板内，37℃、5% co2培养24 h，培养结束后于避光条件下分别加入含有脂性荧光物质cfpe的五种脂质体，设3个复孔，保证cfpe在培养液中的浓度为2
ꢀµ
g/ml，继续孵育4 h。孵育结束后，弃去培养基，冷pbs清洗三遍，胰酶消化，离心，再pbs清洗一遍，加入300 ulpbs重悬细胞，置于流式细胞仪(bd facs celesta, bd, usa)上，选择fitc通道，测定细胞平均荧光强度。进而研究不同配体修饰的各组脂质体在bend.3细胞和c6细胞摄取情况。结果表明我们设计的吐温80包覆的小檗碱与叶酸共修饰脂质体可有效穿透bbb并将药物运送至脑胶质瘤细胞。
39.实施例19为了对线粒体靶向进行了更为直观的研究，我们采用激光共聚焦扫描显微镜(clsm)观察c6细胞中bbr和各组载药脂质体的线粒体定位。取对数生长期的c6细胞以5
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105细胞/孔的密度接种于含盖玻片的6孔板上，37℃、5% co2培养24 h，培养结束后于避光条件下分别加入cfpe标记的五种脂质体，保证cfpe浓度为2 μg/ml，继续孵育4 h。孵育结束后，在避光条件下用2 ml冷pbs洗涤3次，1 ml的150 nm线粒体定位试剂mito
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tracker red染色20 min，染色完成后弃去含染料培养液，冷pbs清洗3次，4%多聚甲醛室温下固定30分钟，再冷pbs清洗3次，然后细胞核以dapi染色(5μg / ml) 5 min，染色完成后冷pbs清洗3次，封片处理，最后, 样本成像用激光扫描共焦显微镜进行测量(lsm800、卡尔蔡司ag、德国)。结果显示小檗碱具有显著的线粒体靶向能力。
40.实施例20
进一步在荷c6脑胶质瘤小鼠模型考察了tween80
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lip的肿瘤靶向能力。建立荷c6原位脑胶质瘤小鼠模型两周后，按照500
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g did/kg的剂量经尾静脉注射，向模型小鼠给予载did的脂质体did
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lip、did
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lip、did
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bbr
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lip、did
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lip和did
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lip。在给药后1 h、4 h、8 h、12和24 h将各组小鼠麻醉后置于小动物活体成像仪中观察。结果显示而did
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lip在荷c6脑胶质瘤小鼠脑内的荧光信号强度显著强于其他各组脂质体，具有最强的脑胶质瘤靶向能力。