含缩宫素的药物组合物及其冻干粉、缩宫素的纯化方法与流程

1.本发明涉及药物领域，具体涉及一种含缩宫素的药物组合物及其冻干粉、缩宫素的纯化方法。


背景技术：

2.缩宫素，又称为催产素，英文名为oxytocin，结构式：
[0003][0004]
分子式为c
43
h
66
n
12
o
12
s2，分子量为1007.19。
[0005]
缩宫素是一种由9个氨基酸残基组成的、具有生物活性的多肽产品。临床主要用于促进分娩和引产，也可用于防治和治疗产后出血。
[0006]
作用机理：缩宫素与子宫平滑肌上的特异性受体结合发挥作用，当缩宫素与受体在体外结合后，刺激g蛋白的异源亚基将gtp水解成gdp，并通过释放亚基刺激磷脂酶c，磷脂酶转化为甘油二酯和肌醇三磷酸(ip3)。甘油二酯可刺激蛋白激酶c活化，进而使其底物磷酸化，引发特定细胞的一些反应，ip3会刺激ca
2+
通过钙通道进入胞浆的流量增加，而增加的ca
2+
可与钙调蛋白结合，刺激肌球蛋白轻链激酶(mlck)产生子宫收缩。
[0007]
由于缩宫素是一类多肽药物，其对酸碱度的变化十分敏感，ph的改变会对其结构产生影响，从而影响其药效。缩宫素在ph＝3～5之间的稳定性最高，在强酸下会破坏其多肽链，在中性或者碱性条件下，分子内的二硫键不稳定，断裂后会发生分子间的聚合反应，形成聚合物等杂质，从而失去药物活性。
[0008]
现有技术中用对硝基苯基酯分步法使用铁氰化钾氧化制备缩宫素，条件较为复杂并且需要在液氨中反应，且无法保证液氨蒸发后缩宫素继续被空气氧化生成聚合物杂质的可能性。在这个基础上的改进，排除空气除氧后并没有有效的解决反应条件复杂的问题，并且不能有效抑制聚合物杂质的产生。
[0009]
目前针对缩宫素纯化过程，现有相关方法主要有重结晶法和制备液相色谱法。重结晶法是通过乙醇、丙酮、异丙醇溶剂等对缩宫素粗品溶液进行重结晶，该法，操作较为复杂，需要多个不同温度的析晶，并且需要较长的析晶时间，终产品的纯度不高；制备液相色谱法得到的终产品同样存在纯度不高、稳定性差的缺陷。并且现有技术并未很好解决纯化后的缩宫素不稳定，难以存放的问题。因此，开发出一种可以有效降低缩宫素中聚合物杂质的含量，提高缩宫素纯化纯度，且纯化后易于储存的缩宫素纯化方法极具意义。


技术实现要素：

[0010]
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的缩宫素不稳定、聚合物杂质含量高且现有的缩宫素纯化方法操作复杂，所得的缩宫素纯度低的缺陷而提供一种纯度高(尤其是聚合物杂质含量低)且稳定性好的缩宫素及其纯化方法。该纯化方法操作简单、易于在工业上应用。
[0011]
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0012]
本发明提供了一种含缩宫素的药物组合物，其包含缩宫素、酸和溶剂；所述酸在所述缩宫素药物组合物中的含量为1～6％，所述百分比为所述酸的体积含量占所述缩宫素药物组合物的总体积含量的百分比，例如1％表示1ml酸占100ml缩宫素药物组合物的体积含量百分比；所述缩宫素的纯度为99.5％～99.9％。所述纯度可由本领域常规测试方法测得，例如使用高效液相色谱仪，测得所述缩宫素在220nm处的紫外吸收图谱中峰的面积比。
[0013]
本发明中，所述酸在所述缩宫素药物组合物中的含量较佳地为1.5～4％，更佳地为2～3％，所述百分比为所述酸的体积含量占所述缩宫素药物组合物的总体积含量的百分比。
[0014]
本发明中，所述药物组合物中聚合物杂质含量较佳地为0.05～0.25％，更佳地为0.063％。所述含量可由本领域常规测试方法测得，例如使用高效液相色谱仪，测得所述药物组合物中聚合物杂质在220nm处的紫外吸收图谱中峰的面积比。
[0015]
本发明中，所述酸可为本领域常规的无机酸和/或有机酸，较佳地为一元酸。所述一元酸可为本领域常规的一元酸，较佳地为醋酸、盐酸和三氟乙酸中的一种或多种，更佳地为醋酸。
[0016]
所述溶剂可为本领域常规溶剂，较佳地为水、乙腈和甲醇中的一种或多种，更佳地为纯水或纯乙腈。所述溶剂的用量为本领域中制备药物组合物的常用量即可。
[0017]
本发明还提供了一种冻干粉，其采用下述方法制得：将如上所述的药物组合物经冻干后制得；所述冻干粉中包含缩宫素和酸。
[0018]
本发明还提供了一种缩宫素的纯化方法，其包括下述步骤：将缩宫素溶液在酸性流动相下经梯度洗脱即可；
[0019]
所述酸性流动相中酸的浓度为1～6％，所述百分比为所述酸的体积含量占所述流动相总体积含量的百分比。
[0020]
本发明中，所述酸性流动相可包括流动相a和流动相b；所述流动相a较佳地包括酸和水；所述流动相b较佳地包括酸和乙腈，更佳地为乙腈。
[0021]
其中，所述流动相a和所述流动相b中的酸可为本领域常规的无机酸和/或有机酸，较佳地为一元酸。所述一元酸的浓度较佳地为1.5～4％，更佳地为2～3％，所述百分比为所述酸的体积含量占所述流动相a或所述流动相b的总体积含量的百分比。所述一元酸可为本领域常规，较佳地为醋酸、盐酸和三氟乙酸中的一种或多种，更佳地为醋酸。所述流动相a中的水较佳地为纯水；所述流动相b中的乙腈较佳地为纯乙腈。
[0022]
本发明中，所述梯度洗脱的洗脱梯度可为本领域常规洗脱梯度，较佳地为下述洗脱梯度：
[0023]
[0024][0025]
，上表中，流动相的百分比例均为体积百分数；
[0026]
更佳地为下述洗脱梯度：
[0027][0028]
，上表中，流动相的百分比例均为体积百分数。
[0029]
本发明中，所述缩宫素溶液的纯度为99.5％～99.9％。所述纯度可由本领域常规测试方法测得，例如使用高效液相色谱仪，测得所述缩宫素在220nm处的紫外吸收图谱中峰的面积比。
[0030]
所述缩宫素溶液可由缩宫素粗品溶液经一纯脱盐、二纯精纯可得。
[0031]
其中，所述一纯脱盐去除的盐可包括盐类杂质；所述盐类杂质可为本领域常规盐类杂质，例如三氟乙酸盐和/或醋酸盐。
[0032]
所述一纯脱盐的流动相可包括流动相a和流动相b；所述流动相a和流动相b可为本领域常规洗脱盐类杂质的流动相，其中所述流动相a较佳地为水，更佳地为纯水；所述流动相b较佳地为乙腈或甲醇，更佳地为纯乙腈。
[0033]
所述一纯脱盐的洗脱梯度可为本领域常规洗脱梯度，较佳地为下述洗脱梯度：
[0034]
[0035][0036]
，表中，流动相的百分比例均为体积百分数，
[0037]
更佳地为下述洗脱梯度：
[0038][0039]
，表中，流动相的百分比例均为体积百分数。
[0040]
所述二纯精纯的流动相可包括流动相a和流动相b；所述流动相a可包括酸和水；所述流动相b可包括酸和乙腈。
[0041]
其中，所述流动相a和所述流动相b中的酸可为本领域常规的无机酸和/或有机酸，较佳地为一元酸。所述一元酸的浓度较佳地为0.005～0.04％，更佳地为0.02～0.03％，例如0.02％，所述百分比为所述酸的体积含量占所述流动相a或所述流动相b的总体积含量的百分比。所述一元酸可为本领域常规一元酸，较佳地为醋酸、盐酸和三氟乙酸中的一种或多种，更佳地为醋酸。
[0042]
所述流动相a中的水较佳地为纯水。所述流动相b中的乙腈较佳地为纯乙腈。
[0043]
所述二纯精纯的洗脱梯度可为本领域常规洗脱梯度，较佳地为下述洗脱梯度：
[0044][0045]
，上表中，流动相的百分比例均为体积百分数，
[0046]
更佳地为下述洗脱梯度：
[0047][0048][0049]
，上表中，流动相的百分比例均为体积百分数。
[0050]
所述缩宫素粗品溶液可通过本领域常规制备方法得到，较佳地通过两步法制备得到；所述两步法包括如下步骤：
[0051]
s1、缩宫素树脂中间体与裂解液反应得还原型缩宫素中间体；
[0052]
s2、还原型缩宫素中间体与溶剂混合得到缩宫素粗品溶液。
[0053]
步骤s1中，所述缩宫素树脂中间体与所述裂解液的混合比例较佳地为每1g树脂添加7～15ml裂解液，更佳地为每1g树脂添加10ml裂解液。
[0054]
其中，所述裂解液可为本领域常规的树脂裂解液，较佳地为tfa(三氟乙酸)、tis(三异丙基硅烷)和h2o的混合液。所述tfa、所述tis和所述h2o的体积比较佳地为tfa：tis：h2o＝(85～90)：(7.5～10)：(2～3)，更佳地为tfa：tis：h2o＝90：7.5：2.5。
[0055]
步骤s1中，所述缩宫素树脂中间体可为本领域常规的缩宫素树脂中间体，较佳地为固相合成的缩宫素树脂中间体。
[0056]
步骤s1中，所述缩宫素树脂中间体与裂解液反应的反应条件可为本领域常规，较佳地为室温下搅拌。所述搅拌的时间可为本领域常规，较佳地为1.5h。所述搅拌的速率可为本领域常规，较佳地为90r/min。所述搅拌的设备可为本领域常规，例如磁力搅拌器。
[0057]
步骤s1中，所述缩宫素树脂中间体与裂解液反应后较佳地还包括过滤、浓缩、离心和干燥步骤。所述过滤、所述浓缩、所述离心和所述干燥步骤的操作条件可为本领域常规操作条件。
[0058]
步骤s2中，所述溶解液与所述还原型缩宫素中间体的混合比例较佳地为每1g还原型缩宫素中间体添加7～15ml溶解液，更佳地为每1g还原型缩宫素中间体添加10ml溶解液。
[0059]
步骤s2中，所述溶剂可为本领域常规的溶剂，较佳地包括溶解液、水、双氧水、氢氧化钠溶液和乙腈。
[0060]
其中，所述溶解液可为本领域常规溶解液，较佳地包括冰醋酸和水。所述冰醋酸和所述水的体积比较佳地为冰醋酸：水＝(0.8～1)：(1～1.2)，更佳地为冰醋酸：水＝1：1。
[0061]
所述水的体积较佳地为加水后溶液稀释到0.7～1.5mg/ml，更佳地为加水后溶液稀释到1mg/ml。
[0062]
所述双氧水的浓度较佳地为20～30％，更佳地为30％，所述百分比为质量百分比。所述双氧水的用量较佳地为每1g固体加入0.4～0.6ml，更佳地为每1g固体加入0.5ml。
[0063]
所述氢氧化钠溶液的浓度较佳地为3～5m，更佳地为4m，“m”代表摩尔浓度即mol/l。所述氢氧化钠溶液的用量较佳地为调节溶液ph为7.5～8.5时氢氧化钠溶液的用量，更佳地为调节溶液ph至8时氢氧化钠溶液的用量。
[0064]
所述乙腈的浓度较佳地为5～7％，更佳地为6％，所述百分比为体积百分比；所述乙腈的用量较佳地为可配制成5～7％的乙腈水溶液，更佳地为可配制成6％的乙腈水溶液。
[0065]
步骤s2中，所述混合可通过本领域常规操作实现，例如搅拌。
[0066]
本发明中，上样流速和洗脱流速可根据仪器选择合适的流速，较佳地为80～120ml/min，例如100ml/min。
[0067]
本发明还提供了一种由上述纯化方法制得的缩宫素。
[0068]
本发明还提供了一种由上述纯化方法制得的缩宫素在制备含缩宫素的药物组合物或冻干粉中的应用。
[0069]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0070]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0071]
本发明的积极进步效果在于：
[0072]
(1)制得的缩宫素药物组合物及冻干粉的纯度高、聚合物杂质含量低，可稳定保存。
[0073]
(2)本发明提供的缩宫素的纯化方法，采用酸性流动相，极大的抑制了缩宫素溶液中难以除去的聚合物杂质的产生，保证了纯化纯度，有效的提高了缩宫素溶液的稳定性。该纯化方法操作简单、易于在工业上应用。
[0074]
具体地：纯化后的缩宫素浓缩液的纯度由98％以下提高到99.5％以上，聚合物杂质含量由0.6～1.5％降低到0.05～0.16％，缩宫素浓缩液低温(5℃)保存24h的纯度由95％以下提高到99.5％以上。
附图说明
[0075]
图1为缩宫素结构图；
[0076]
图2为两种缩宫素聚合物结构图；
[0077]
图3为实施例1的三纯浓缩液的hplc图谱；
[0078]
图4为实施例2的三纯浓缩液的hplc图谱；
[0079]
图5为实施例3的三纯浓缩液的hplc图谱；
[0080]
图6为实施例4的三纯浓缩液的hplc图谱；
[0081]
图7为对比例1的三纯浓缩液的hplc图谱；
[0082]
图8为对比例1三纯浓缩液与5℃存放24h后的对比例1三纯浓缩液的hplc对比图谱；
[0083]
图9为实施例2的三纯浓缩液与5℃存放24h后的实施例2的三纯浓缩液的hplc对比图谱。
具体实施方式
[0084]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0085]
下述各实施例中使用的反相填料柱均为kromasil(10μm，c18填料)。
[0086]
下述各实施例中的hplc测试纯度方法的条件如下表所示：
[0087][0088]
实施例1
[0089]
通过两步法制备一纯脱盐过程中的上样液(缩宫素粗品溶液)，步骤如下：
[0090]
步骤s1：将固相合成的缩宫素树脂中间体以及通过tfa：tis：h2o(tfa：三氟乙酸，tis：三异丙基硅烷)＝90：7.5：2.5的比例配成的裂解液，按照每1g树脂添加10ml裂解液的比例混合，并于室温搅拌1.5h，搅拌的速率为90r/min过滤除去固体树脂，滤液在常温下浓缩到一半体积，加入浓缩液的3倍体积的冷的甲基叔丁基醚析出，离心倒去上清液，离心速率为3000r/min，重复3次，干燥得到白色固体，即还原型缩宫素中间体；
[0091]
合成固相合成的缩宫素树脂中间体的实验步骤如下述：
[0092]
使用市售rink amide mbha resin树脂，用n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)作为溶剂，用1
‑
羟基苯并三唑(hobt)和1,3
‑
二异丙基碳二亚胺(dic)作为缩合剂，用哌啶为脱保护试剂，依次连接上氨基酸fmoc
‑
gly
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
pro
‑
oh、fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
tyr(trt)
‑
oh和fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh得到h
‑
cys(trt)
‑
tyr(tbu)
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
asn(trt)
‑
cys(trt)
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
rink amide mbha resin树脂，即本发明中的固相合成的缩宫素树脂。其中，rink amide mbha resin树脂、dmf、hobt和dic的浓度和用量均为本领域常规浓度和用量。各种氨基酸的浓度和用量均为本领域常规浓度和用量。rink amide mbha resin树脂、dmf、hobt、dic以及实验中用到的各种氨基酸均为市售可得。
[0093]
步骤s2：冰醋酸和水1：1的比例配置溶解液，加入10ml溶解液溶解1g上述还原型缩宫素中间体，待完全溶解后，加纯水稀释至1mg/ml，搅拌状态下缓慢加入0.5ml质量浓度为30％的双氧水，室温搅拌10分钟，搅拌的速率为90r/min后加入4m氢氧化钠溶液调节溶液ph至8，再加入适量的乙腈配制成6％的乙腈水溶液，即得缩宫素粗品溶液。
[0094]
缩宫素粗品溶液纯化方法具体包括如下三步：
[0095]
(1)一纯脱盐：流动相a为水，流动相b为乙腈，流动相c为上样液(12l浓度为1mg/ml
的缩宫素粗品溶液)。分三次上样
‑
洗脱，每次上样量为4l，根据下表中的方法进行洗脱纯化。根据紫外吸收色谱图(210nm处)收集40
‑
45min的洗脱液，将三次上样纯化后的收集液进行hplc纯度测试，将纯度大于60％的溶液混合待后续二纯使用。
[0096]
一纯上样方法
[0097][0098]
一纯洗脱梯度
[0099][0100][0101]
(2)二纯精纯：流动相a为0.02％醋酸/水，流动相b为0.02％醋酸/乙腈，流动相c为上样液(一纯收集的合并液并用纯水稀释4倍得体积为3l)。分三次上样
‑
洗脱，每次上样量为1l，通过下表方法进行上样和洗脱。根据紫外吸收色谱图(210nm处)收集40
‑
60min的洗脱液，将三次上样纯化后的收集液进行hplc纯度测试，将纯度大于99.5％的溶液混合待后续三纯使用。
[0102]
二纯上样方法
[0103][0104]
二纯洗脱梯度
[0105][0106]
(3)三纯浓缩：流动相a为1.5％醋酸/水，流动相b为1.5％醋酸/乙腈，流动相c为添加1.5％醋酸的上样液(二纯收集的合并液再用等量的3％醋酸/水稀释，总体积为12l)。分三次上样
‑
洗脱，所有上样液依次按下表方法上样和洗脱浓缩，根据紫外吸收色谱图(210nm处)收集9
‑
12min的洗脱液，将收集液进行hplc纯度测试，将纯度大于99.5％的溶液混合待后续冻干，混合液纯度为99.898％。
[0107]
三纯上样方法
[0108][0109]
三纯洗脱梯度
[0110][0111]
冻干：将三纯收集液常温旋蒸除去溶液中的乙腈，并进行冻干，得冻干粉6.3g，冻干粉纯度为99.736％，其中聚合物杂质含量为0.141％。
[0112]
实施例2
[0113]
取12l浓度为1mg/ml的缩宫素粗品作为上样液。按实施例1进行相同的一纯和二纯，其中三纯浓缩：流动相a为3％醋酸/水，流动相b为乙腈，流动相c为上样液，上样液为二纯合格洗脱液，体积为6l。分三次上样
‑
洗脱，所有上样液依次按下表方法上样和洗脱浓缩，根据紫外吸收色谱图(210nm处)收集9
‑
12min的洗脱液，将收集液进行hplc纯度测试，将纯度大于99.5％的溶液混合待后续冻干，混合液纯度为99.950％。
[0114]
三纯上样方法
[0115][0116]
三纯洗脱梯度
[0117][0118]
冻干：将三纯收集液常温旋蒸除去溶液中的乙腈，并进行冻干得冻干粉7.0g，冻干粉纯度为99.940％，其中聚合物杂质含量为0.063％。
[0119]
实施例3
[0120]
取15l浓度为1mg/ml的缩宫素粗品作为上样液。按实施例1进行相同的一纯和二纯，其中三纯浓缩：流动相a为1.0％醋酸/水，流动相b为1.0％醋酸/乙腈，流动相c为添加1.0％醋酸的上样液(二纯收集的合并液再用等量的2％醋酸/水稀释，总体积为14l)。分三次上样
‑
洗脱，所有上样液依次按下表方法上样和洗脱浓缩，根据紫外吸收色谱图(210nm处)收集9
‑
12min的洗脱液，将收集液进行hplc纯度测试，将纯度大于99.5％的溶液混合待后续冻干，混合液纯度为99.679％。
[0121]
三纯上样方法
[0122][0123]
三纯洗脱梯度
[0124][0125]
冻干：将三纯收集液常温旋蒸除去溶液中的乙腈，并进行冻干，得冻干粉6.8g，冻干粉纯度为99.564％，其中聚合物杂质含量为0.152％。
[0126]
实施例4
[0127]
取15l浓度为1mg/ml的缩宫素粗品作为上样液。按实施例1进行相同的一纯和二纯，其中三纯浓缩：流动相a为3.0％醋酸/水，流动相b为3.0％醋酸/乙腈，流动相c为添加3.0％醋酸的上样液(二纯收集的合并液再用等量的6％醋酸/水稀释，总体积为14.5l)。分三次上样
‑
洗脱，所有上样液依次按下表方法上样和洗脱浓缩，根据紫外吸收色谱图(210nm处)收集9
‑
12min的洗脱液，将收集液进行hplc纯度测试，将纯度大于99.5％的溶液混合待后续冻干，混合液纯度为99.785％。
[0128]
三纯上样方法
[0129][0130]
三纯洗脱梯度
[0131][0132][0133]
冻干：将三纯收集液常温旋蒸除去溶液中的乙腈，并进行冻干，得冻干粉7.0g，冻干粉纯度为99.678％，其中聚合物杂质含量为0.102％。
[0134]
对比例1
[0135]
取13l浓度为1mg/ml的缩宫素粗品作为上样液。按实施例1进行相同的一纯和二纯，其中三纯浓缩：流动相a为0.02％醋酸/水，流动相b为0.02％醋酸/乙腈，流动相c为添加0.02％醋酸的上样液(二纯收集的合并液再用等量的0.04％醋酸/水稀释，总体积为12l)。分三次上样
‑
洗脱，所有上样液依次按下表方法上样和洗脱浓缩，根据紫外吸收色谱图(210nm处)收集9
‑
12min的洗脱液，将收集液进行hplc纯度测试，将纯度大于99.5％的溶液混合待后续冻干，混合液纯度为98.5％。
[0136]
三纯上样方法
[0137][0138]
三纯洗脱梯度
[0139][0140]
冻干：将三纯收集液常温旋蒸除去溶液中的乙腈，并进行冻干，得冻干粉3.1g，冻干粉纯度为97.5％，其中聚合物杂质含量为1.3％。
[0141]
实施例1～4、对比例1的实验条件及效果数据如下表所示：
[0142][0143]
由上表数据可知，经过本发明的纯化方法得到的缩宫素浓缩液的纯度可由97.5％提高到99.94％、聚合物杂质含量可由1.3％降低到0.063％，缩宫素浓缩液低温(5℃)保存24h的纯度由94％提高到99.7％。
[0144]
可见，采用本发明的缩宫素纯化方法，极大的抑制了缩宫素溶液中难以除去的聚合物杂质的产生，保证了纯化纯度，有效的提高了缩宫素溶液的稳定性。