PD-1信号抑制剂的并用疗法

pd-1信号抑制剂的并用疗法
1.本技术是申请日为2016年12月5日的中国专利申请201680081286.8“pd-1信号抑制剂的并用疗法”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及pd-1(programmedcelldeath-1，程序性细胞死亡-1)信号抑制剂的并用疗法。


背景技术：

3.近年来的临床试验的结果表明，抗pd-1抗体治疗是在各种癌症中较以往的标准治疗更有效[非专利文献1～3]。在晚期肺癌患者的pd-1抗体治疗的奏效率与以往的抗癌剂相比显著地提高而达到20～30％。然而，事实上仍有约半数左右的患者显示出无应答性。目前几乎尚未知晓为何这些患者对pd-1抗体治疗无应答。
[0004]
现有技术文献
[0005]
非专利文献
[0006]
非专利文献1：bramerj，reckampk，etal：nivolumabversusdocetaxelinadvancednonsquamousnon-small-celllungcancer.nengljmed，373：1627-1639，2015.
[0007]
非专利文献2：hamanishij，mandaim，ikedat，etal：safetyandantitumoractivityofanti-pd-1antibody，nivoluimab，inpatientswithplatinum-resistantovariancancer.jclinoncol，33：4015-4022，2015.
[0008]
非专利文献3：motzerrj，escudierb，mcdermottdf，etal：nivolumab，373：1803-1813，2015.。


技术实现要素：

[0009]
发明所要解决的课题
[0010]
本发明的目的在于提供抗pd-1抗体治疗的新颖的治疗战略。
[0011]
用于解决课题的手段
[0012]
抗pd-1抗体治疗不同于以往的具有直接的癌细胞杀伤作用的抗癌剂，是通过使抗肿瘤免疫活化而抑制癌增殖。若存在如支持抗肿瘤免疫的试剂，则通过并用可提高抗肿瘤效果，而期待也可适用于无应答患者。
[0013]
本发明人发现，若将pd-1信号抑制抗体与ros(reactiveoxygenspecies)发生剂或线粒体膜电位控制剂(解偶联剂)并用，则抗肿瘤效果协同性地提高。若单独使用ros发生剂、或线粒体膜电位控制剂，则在活体内未发挥出抗肿瘤效果。根据以上的结果认为，ros发生剂、或线粒体膜电位控制剂具有通过与pd-1信号抑制抗体并用，支持抗肿瘤免疫，而协同性地抑制癌增殖的效果。
[0014]
本发明的要旨如下所述。
[0015]
(1)药物组合物，其包含选自下述(i)～(iii)的至少1种物质，且在 给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的任一时期进行给予：
[0016]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0017]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0018]
(iii)氨基酸。
[0019]
(2)(1)所述的药物组合物，其中，pd-1信号抑制剂为抗体。
[0020]
(3)(1)或(2)所述的药物组合物，其中，抗体为选自下述的至少1 种抗体：抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和抗pd-l2抗体。
[0021]
(4)(1)～(3)中任一项所述的药物组合物，其中，ros发生剂为选 自下述的至少1种化合物：氢过氧化叔丁基、羰基氰对三氟甲氧基苯 腙、2，4-二硝基苯酚、2，3-二甲氧基-1，4-萘醌和它们的类似物。
[0022]
(5)(1)～(3)中任一项所述的药物组合物，其中，显示解偶联作用 的物质为选自下述的至少1种化合物：羰基氰对三氟甲氧基苯腙、2，4
‑ꢀ
二硝基苯酚、羰基氰间氯苯腙、水杨酸、4，4
′‑
[戊烷-1，5-二基双(氧基)] 二苯甲脒)、2-(2-(2，6-二氯苯基氨基)苯基)乙酸、4-羟基-2-甲基-n-(2
‑ꢀ
吡啶基)-2h-1，2-苯并噻嗪-3-甲酰胺-1，1-二氧化物、2-{1-[(4-氯苯基) 羰基]-5-甲氧基-2-甲基-1h-吲哚-3-基}乙酸、n-(4-硝基-2-苯氧基苯基) 甲磺酰胺、4-羟基-2-甲基-n-(5-甲基-2-噻唑基)-2h-1，2-苯并噻嗪-3-甲 酰胺-1，1-二氧化物、氯硝柳胺乙醇胺盐、4-甲氧基-8-(3-甲基丁-2-烯 氧基)喹啉-2-羧酸3-甲基丁-2-烯酯和它们的类似物。
[0023]
(6)(1)～(3)中任一项所述的药物组合物，其中，控制ros发生剂 或显示解偶联作用的物质的下游信号的物质为控制 mtor(mammalian target of rapamycin)、ampk(adenosinemonophosphate activated protein kinase)、sirt(sirtuin)1、 pgc-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gammacoactivator-1α)/转录因子复合物(包含pgc-1α的转录因子复合物)和 foxo1中的任一种或其以上的物质。
[0024]
(7)(6)中所述的药物组合物，其中，控制mtor的物质为选自下 述的至少1种化合物：4，6-二-4-吗啉基-n-(4-硝基苯基)-1，3，5-三嗪-2
‑ꢀ
胺、磷脂酸和它们的类似物。
[0025]
(8)(6)中所述的药物组合物，其中，控制ampk的物质为选自下 述的至少1种化合物：6，7-二氢-4-羟基-3-(2
′‑
羟基[1，1
′‑
联苯]-4-基)-6
‑ꢀ
氧代-噻吩并[2，3-b]吡啶-5-甲腈、5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β，-d-呋喃核 糖苷、n，n-二甲双胍、6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基) 吡唑并[1，5-a]嘧啶和它们的类似物。
[0026]
(9)(6)中所述的药物组合物，其中，控制sirt1的物质为选自下 述的至少1种化合物：反式-3，5，4
′‑
三羟基芪、n-(2-(3-(哌嗪-1-基甲基) 咪唑并[2，1-b]噻唑-6-基)苯基)喹喔啉-2-甲酰胺、n-苄基-3，5-二乙氧羰 基-4-苯基-1，4-二氢吡啶、2-氨基-n-环戊基-1-(3-甲氧基丙基)-1h-吡咯 并[2，3-b]喹喔啉-3-甲酰胺、烟酰胺单核苷酸和它们的类似物。
[0027]
(10)(6)中所述的药物组合物，其中，控制pgc-1α/转录因子复合 物(包含pgc-1α的转录因子复合物)的物质为选自下述的至少1种化 合物：2-(4-{2-[(4-氯苯甲酰基)氨基]乙基}苯氧基)-2-甲基丙酸、9-顺 式，12-顺式-十八碳二烯酸)、2-[4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基]-2-甲基丙酸
ꢀ‑
d6 1-甲基乙酯、(十一烷硫基)-乙酸、4-甲基-5-(2-吡嗪基)-3-二硫杂环 戊烯硫酮、n，n-二甲基甲酰胺、3-[4-(2，4-双(三氟甲基)苄氧基)-3-甲氧 基苯
基]-2-氰基-n-(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)丙烯酰胺和它们的 类似物。
[0028]
(11)(6)中所述的药物组合物，其中，控制foxo1的物质为选自下 述的至少1种化合物：5-氨基-7-(环己基氨基)-1-乙基-6-氟-4-氧代-1，4
‑ꢀ
二氢喹啉-3-羧酸、2-环戊基-n-{2，4-二氯-3-[(异喹啉-5-基氧基)甲基] 苯基}-n-甲基乙酰胺及其类似物。
[0029]
(12)(1)～(3)中任一项所述的药物组合物，其中，氨基酸为选自下 述的至少1种化合物：色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨 酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨 酸、丝氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和它们的类似物。
[0030]
(13)(1)～(12)中任一项所述的药物组合物，其被用作抗癌剂、感 染症治疗剂或它们的组合。
[0031]
(14)(1)～(13)中任一项所述的药物组合物，其分别给予pd-1信号 抑制剂与选自下述(i)～(iii)的至少1种物质：
[0032]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0033]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0034]
(iii)氨基酸。
[0035]
(15)(1)～(13)中任一项所述的药物组合物，其为包含pd-1信号抑 制剂与选自下述(i)～(iii)的至少1种物质的调配剂：
[0036]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0037]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0038]
(iii)氨基酸。
[0039]
(16)pd-1信号抑制活性增强剂，其包含选自下述(i)～(iii)的至少1 种物质：
[0040]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0041]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0042]
(iii)氨基酸。
[0043]
(17)癌症、感染症或它们的组合的治疗方法，其包括下述的步 骤：在给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的任一时期，以药物 上有效的量对受验者或受验动物给予选自下述(i)～(iii)的至少1种物 质：
[0044]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0045]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0046]
(iii)氨基酸。
[0047]
(18)选自下述(i)～(iii)的至少1种物质的应用，其是用于治疗癌 症、感染症或它们的组合，且在给予pd-1信号抑制剂之前、之后或 同时的任一时期，给予选自下述(i)～(iii)的至少1种物质：
[0048]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0049]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0050]
(iii)氨基酸。
[0051]
(19)选自下述(i)～(iii)的至少1种物质的应用，其是用于在治疗癌 症、感染症或它们的组合的方法中应用，且给予选自下述(i)～(iii)的至 少1种物质：
[0052]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0053]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0054]
(iii)氨基酸。
[0055]
发明效果
[0056]
通过将ros发生剂或控制其下游信号的物质和/或显示解偶联作 用的物质或控制其下游信号的物质与pd-1信号抑制剂并用，协同性 地提高抗肿瘤效果。
[0057]
本说明书包含作为本技术的优先权基础的日本专利申请、特愿 2015-238511和特愿2016-119695的说明书和/或附图中所记载的内 容。
[0058]
附图简述
[0059]
[图1]由pd-1抑制与化学试剂所引起的线粒体活化的假设图。 a)pd-1抑制将肿瘤反应性t细胞的线粒体活化。b)ros诱导剂或解 偶联剂使细胞的ros增加。c)细胞的ros将ampk与mtor活化， 其结果，除了t-bet的表达以外，pgc-1a也被活化。d)与pgc-1a 结合的nrf(neutrophil releasing factor)或ppars(peroxisomeproliferator activated receptors)的活化引起线粒体中的正反馈活化。
[0060]
[图2]由pd-1抑制所引起的tr(tumor-reactive)ctl(cytotoxict lymphocyte)的活体内检测与其线粒体的活性。α～d)是实验步骤的 概要图。将利用cell trace标记的cd45.1
+
cd8
+
t细胞移植至cd45.2
+ cd8-/-小鼠。对小鼠接种mc38，并利用pd-l1抗体进行治疗。对所 属淋巴结的cd8
+
cd45.1
+
t细胞设门并进行分析(a)。显示该门内的 细胞的cd62l与cell trace的强度(b)(左)。对高分裂细胞的频率进行 组间比较。数据是显示4～5只小鼠的平均值
±
标准误差。*p＜0.05，单 向方差分析(one-way analysis of variance)(右)(b)。在(a)中所示的门内 的细胞中，对cell trace和担载有mlama4肽或无关系肽的 mhc(major histocompatibility complex)四聚物的阳性率以进行了 pd-l1抗体治疗的组进行分析(c)。利用与线粒体的活性相关的试剂将 进行了pd-l1抗体治疗的所属淋巴结细胞进行染色。显示(a)的门中 的代表性facs(fluorescence-activated cell sorting)数据(上图)(d)。对 各线粒体染色试剂的荧光强度的中央值分析为高分裂(高)与低分裂 (低)并加以比较。数据是显示5只小鼠的平均值
±
标准误差。*p＜0.05， ****p＜0.0001，单向方差分析(下图)(d)。数据是显示三个独立的实 验中的代表性者(α～d)。e、f)向mc38带癌野生型小鼠每4天给予3 次pd-l1抗体。利用xfe96分析器对自治疗或未治疗小鼠分离的所 属淋巴结的cd8
+
t细胞的氧消耗量(ocr)进行计测。在第二次治疗 的2天后混合3只小鼠的细胞并进行分析(e)。对定义为(寡霉素 (oligomycin)给予后的最终计测值)-(寡霉素给予后的最低计测值)的atp(adenosine triphosphate)转化率进行计测(f)。数据是显示3孔的 平均值
±
标准误差。****p＜0.0001，2标本的学生t检验分布。数据 是显示两个独立的实验中的代表性数据。
[0061]
[图3]pd-l1抗体治疗与活性氧发生剂luperox的协同效果。a) 对小鼠接种mc38 3週，每7天给予氢过氧化叔丁基溶液(luperox)。 显示肿瘤的体积。数据是显示5只小鼠的平均值
±
标准误差。b)是并 用治疗的步骤的概要图。c)对小鼠接种mc38 7天后给予pd-l1抗 体与luperox。显示肿瘤的体积与存活曲线。数据是显示5只小鼠的 平均值
±
标准误差。*p＜0.05，**p＜0.01，2标本的t检验分布(抗pd-l1 相对于抗pd-l1+luperox)。数据是显示两个独立的实验中的代表性 者。
[0062]
[图4]解偶联剂的协同效果与ros相关。a)如图3b所示，在相 同的步骤中向mc38带
癌小鼠给予fccp或dnp与pd-l1抗体。显 示肿瘤的体积与存活曲线。数据是显示5～6只小鼠的平均值
±
标准误 差。*p＜0.05，**p＜0.01，2标本的t检验分布(抗pd-l1相对于抗 pd-l1+fccp或dnp)。b)在与(a)相同的步骤中向mc38带癌小鼠仅 给予fccp或dnp。显示肿瘤的体积。数据是显示5只小鼠的平均 值
±
标准误差。c)向mc38带癌小鼠给予ros清除剂(mntbap)、 pd-l1抗体及fccp(左)或dnp(右)。数据是显示4～5只小鼠的平均 值
±
标准误差。*p＜0.05，**p＜0.01，2标本的t检验分布(并用治疗 相对于并用治疗+mntbap)。dnp并用治疗中的对照igg组的小鼠(右) 是与图4b共用。数据是显示两个独立的实验中的代表性者。
[0063]
[图5]通过同时并用dnp与luperox而增进抗肿瘤效果。在与 图3b同样的步骤中，向mc38带癌小鼠给予dnp或luperox、或其 两者与抗pd-l1抗体。显示肿瘤的体积。数据是显示5～6只小鼠的 平均值
±
标准误差。数据是显示两个独立的实验中的代表性数据。
[0064]
[图6]由fccp给予所引起的效应cd8
+
t细胞的增加。a)如图3b所示，在相同的步骤中向mc38带癌小鼠给予pd-l1抗体与fccp。 在第14天利用抗cd8、cd62l、cd44抗体将所属淋巴结的细胞进 行染色，对cd8
+
t细胞设门。基于cd62l与cd44的强度，对p1～p3 的细胞组进行定义(上图)。计算各组中的p1～p3的细胞的绝对数。数 据是显示5只小鼠的平均值
±
标准误差。*p＜0.05，单向方差分析(下 图)。b)利用各线粒体染料将给予了pd-l1抗体与fccp的小鼠的所 属淋巴结cd8
+
t细胞进行染色。p1～p3的代表性facs分布图(上段 图)。各组中的利用各线粒体染料进行染色的p3细胞组的代表性 facs分布图(中段图)。将利用各染料进行染色的p1～p3的mfi(meanfluorescence intensity)在给予组间进行比较。颜色是与p1～p3细胞组 对应。数据是显示5只小鼠的平均值
±
标准误差(下段图)。*p＜0.05， **p＜0.01，单向方差分析。c)在肿瘤给予后第11天将经酶处理的癌 组织的细胞利用抗cd8、cd45、cd62l、cd44抗体进行染色。对 cd45
+
cd8
+
t细胞设门，并对该cd62l与cd44的表型进行分析(左 图)。对cd45
+
t细胞中的cd8
+
t细胞的频率与cd45
+
cd8
+
t细胞 的绝对数进行组间比较(右图)。数据是显示5只小鼠的平均值
±
标准 误差。*p＜0.05，**p＜0.01，单向方差分析。facs数据是显示各组 的5只小鼠数据中的代表性者。数据是显示两个独立的实验中的代表 性者。
[0065]
[图7]由解偶联剂与pd-l1抗体的并用所引起的协同效果是与 mtor和ampk的途径相关。a)在dnp或fccp的并用治疗时，混 合5只小鼠的所属淋巴结细胞，将cd8
+
t细胞分离。通过蛋白质印 迹法对ampk与acc(acetyl-coa carboxylase)、mtor、s6k的磷 酸化和sirt1与4ebp1(4e-binding protein 1)的表达进行分析。b)在 与图3b同样的步骤中，向mc38带癌小鼠将ampk活性剂(a76966) 与mtor活性剂(mhy1485)、或其两者与pd-l1小鼠抗体一并给予。 显示肿瘤的体积与存活曲线。数据是显示5只小鼠的平均值
±
标准误 差。*p＜0.05，**p＜0.01，2标本的t检验分布(抗pd-l1抗体相对于 并用治疗)。星号的各颜色是与相同的颜色所示的组一致。c)向mc38 带癌小鼠给予sirt1活性剂(白藜芦醇)与pd-l1抗体。显示肿瘤的体 积与存活曲线。数据是显示5只小鼠的平均值
±
标准误差。*p＜0.05， **p＜0.01，2标本的t检验分布(抗pd-l1抗体相对于并用治疗)。
[0066]
[图8]mtor与ampk的不同活化状态是与cd8
+
t细胞的分化 阶段相对应。向mc38带癌小鼠给予dnp与抗pd-l1抗体。在第1 次治疗的次日，将所属淋巴结的细胞利用针对cd8、cd62l、cd44、 p-mtor和p-ampk的抗体进行染色。如图6a所示，对p1～p3设门， 并对p-ampk
与p-mtor的荧光强度进行比较。数据是显示两个独 立的实验中的代表性者。
[0067]
[图9]pd-l1抗体治疗与ampk抑制剂的协同效果。在与图3b同样的步骤中，向mc38带癌小鼠给予化合物c与抗pd-l1抗体。 显示肿瘤的体积。
[0068]
[图10]pd-l1抗体治疗与ampk抑制剂的协同效果。在与图3b同样的步骤中，向renca(renal cancer)带癌小鼠给予化合物c与抗 pd-l1抗体。显示肿瘤的体积。
[0069]
[图11]pd-l1抗体治疗与pgc-1α/转录因子复合物活性剂的协同 效果。在与图3b同样的步骤中，向mc38带癌小鼠给予nrf2活化 剂(oltipraz，奥替普拉)或ppars活化剂(bezafibrate，苯扎贝特)与抗 pd-l1抗体。显示肿瘤的体积。数据是显示5只小鼠的平均值
±
标准 误差。*p＜0.05，双尾学生t检验(pd-l1抗体相对于各并用疗法)。 图11a：使用fccp、mtor激活剂或ampk激活剂与pd-l1抗体的 联合治疗增加了pgc-1α蛋白和mrna的表达水平。图11b：奥替 普拉和苯扎贝特均增强了pd-l1抗体的肿瘤生长抑制作用，并提高 了带癌小鼠的存活率。
[0070]
[图12]luperox和fccp几乎不影响活体内的肿瘤细胞。a)肿瘤 组织是在自第2次的fccp或luperox单独给予起1天后进行回收。 在酶消化后，肿瘤细胞是通过可去除肿瘤细胞以外之细胞的细胞分离 试剂盒而加以筛选。所分离的肿瘤细胞进一步通过aria进行纯化， 并用于以下的实验。b)肿瘤细胞是利用将pd-l1、i型mhc、 cd155(tigit的配体)和vista作为靶的抗体、或将线粒体质量、膜 电位或超氧化物染色的色素进行染色。c)线粒体能量代谢或凋亡相 关基因的表达水平是使用rt
2 profiler pcr试剂盒进行研究。所表示 的基因名是在82个基因中与未处理的肿瘤细胞相比显著地增加2倍 以上者。
[0071]
[图13]线粒体活化相关试剂的抗肿瘤协同效果。a)并用治疗时 间表的模式图。b)对小鼠进行pd-l1抗体与巴拉刈(paraquat)的并用 治疗。数据是显示5～6只鼠之值的平均值
±
标准误差。数据是2次独 立的实验的代表。
[0072]
[图14]线粒体活化相关试剂在不同的肿瘤或小鼠的系统中也发 挥功能。向移植了纤维肉瘤metha的balb/c小鼠，依据图3的时 间表给予pd-l1抗体与fccp、luperox、parawuat或奥替普拉。显 示肿瘤的尺寸。数据是显示5只鼠之值的平均值
±
标准误差。*p＜0.05， 双尾学生t检验(pd-l1抗体相对于各自的并用治疗)。
[0073]
[图15]t-bet与ifn-γ产生是在fccp或苯扎贝特与pd-l1抗体 的并用治疗组中增加。a)利用流式细胞仪，对源自利用pd-l1抗体 与fccp进行并用治疗的小鼠的所属淋巴结的cd8阳性细胞中的 t-bet与eomes表达进行分析。显示代表性facs数据(上图)。算出源 自利用pd-l1抗体与fccp或苯扎贝特进行并用治疗的小鼠的所属 淋巴结中的t-bet与eomes阳性t细胞的频率与数量(下图)。b)将进 行了酶消化的肿瘤组织在37℃下培养6小时，并进行源自利用pd-l1 抗体与fccp或苯扎贝特进行并用治疗的小鼠的cd8阳性细胞中的 ifn-γ的细胞内染色。显示代表性facs数据(左图)与cd8阳性细胞 内的ifn-γ的频率(右图)。数据是显示5只鼠之值的平均值
±
标准误差。 *p＜0.05，**p＜0.01是利用单向方差分析所获得者。
[0074]
[图16]pd-l1抗体治疗与foxo1抑制剂：as1842856的协同效 果。对balb/c小鼠接种5
×
105的metha，在7天后给予抗pd-l1抗 体(80μg)与foxo1抑制剂(2mg/kg)。给予时间表依据图3。显示肿瘤 的体积。
[0075]
[图17]血中代谢物(氨基酸)的变化。通过gc-ms分析，对5只 pd-1-/-小鼠与野生型
小鼠的血清中所含的氨基酸的量进行鉴定。图显 示将野生型的值设为1时的pd-1-/-小鼠的值。n＝5，*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，t-检验(t-test).
[0076]
[图18]aminoleban的组成。
[0077]
[图19]pd-l1抗体治疗与aminoleban的协同效果。在对balb/c 小鼠接种5
×
105的纤维肉瘤metha 7天后，给予抗pd-l1抗体(60μg) 与aminoleban(400μl/mouse)。给予时间表依据图3。
具体实施方式
[0078]
以下，对本发明详细地进行说明。
[0079]
本发明提供药物组合物，其包含选自下述(i)～(iii)的至少1种物 质，且在给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的任一时期进行给 予：
[0080]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0081]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0082]
(iii)氨基酸。
[0083]
作为ros发生剂，可例示：氢过氧化叔丁基(luperox)、羰基氰 对三氟甲氧基苯腙(fccp)、2，4-二硝基苯酚(dnp)、2，3-二甲氧基-1，4
‑ꢀ
萘醌(dmnq)、2-甲基萘-1，4-二酮(甲萘醌)、1，1
′‑
二甲基-4，4
′‑
联吡啶鎓 二氯化物(巴拉刈)和它们的类似物。
[0084]
在ros发生剂的下游存在mtor、atm(ataxia telangiectasiamutated protein，血管扩张性失调症变异蛋白质)、ampk(amp-activated protein kinase)等信号转导(图1)，本发明的药物 组合物可含有控制这些中的任一种的物质。控制是包括激活与失活 (不活化)的概念。
[0085]
ros下游信号的mtor将细胞的糖酵解进行活化，引起细胞分 裂所需的蛋白质、脂质、核酸的扩增(同化作用的促进)。由此，认为 进一步强化通过pd-1信号抑制而增强的t细胞受体信号。若利用解 偶联物质的下游信号使ampk活化，则引起线粒体的生物合成，能 量的产生所需的氧化磷酸化在线粒体内进行活化。由此，认为进一步 强化通过pd-1信号抑制而增强的t细胞受体信号。
[0086]
作为控制mtor的物质，可例示：4，6-二吗啉代-n-(4-硝基苯 基)-1，3，5-三嗪-2-胺、4，6-二-4-吗啉基-n-(4-硝基苯基)-1，3，5-三嗪-2-胺 (mhy1485)、磷脂酸(pa)和它们的类似物，这些物质将mtor激活。
[0087]
ampk也称为能量传感器，因能量消耗而atp量减少，若amp 量增加则进行活化。ampk的作用是抑制能量的消耗，向积蓄能量的 方向控制代谢。因此，若ampk进行活化，则会抑制生物合成(同化 作用的抑制)，自线粒体的atp产生变得活跃(异化作用的促进)
1、2、3
。 在ampk信号的下游存在pgc-1a与转录因子的复合物，由此，活化 线粒体的生物合成或氧化磷酸化代谢4。若将ampk活化，则可见糖 尿病的改善，因此一部分的ampk活化剂被用作糖尿病治疗药。作 为控制ampk的物质，可例示：6，7-二氢-4-羟基-3-(2
′‑
羟基[1，1
′‑
联 苯]-4-基)-6-氧代-噻吩并[2，3-b]吡啶-5-甲腈(a769662)、5-氨基咪唑-4
‑ꢀ
甲酰胺1-β，-d-呋喃核糖苷(aicar)、n，n-二甲双胍(metformin)和它们 的类似物，这些物质将ampk激活。作为将ampk失活的物质(ampk 的抑制剂)，可例示：6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡 唑并[1，5-a]嘧啶(化合物c)和它们的类似物。
metab.3：160-6，2009.puigserver p et al.nature.423：550-5， 2003.
[0095]
作为控制foxo1的物质，可例示：5-氨基-7-(环己基氨基)-1-乙基
ꢀ‑
6-氟-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸、2-环戊基-n-{2，4-二氯-3-[(异喹啉
ꢀ‑
5-基氧基)甲基]苯基}-n-甲基乙酰胺和它们的类似物。
[0096]
作为氨基酸，可例示：色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精 氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、 脯氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和它们的类似物。氨基酸可为1种 也可为2种以上的组合。氨基酸可为l-氨基酸、d-氨基酸或dl-氨 基酸的任一者。若抑制pd-1，则氨基酸等代谢物的同化作用(细胞增 殖)变得剧烈而被消耗。若向其中导入成为细胞等之骨架的氨基酸， 则认为细胞增殖进一步发展。若补充氯基酸而细胞增殖变快，则 mtor向活化的方向进行。例如有作为氨基酸制剂的aminoleban将mtor活化的报道(tamanna n，mahmood n.int sch res notices. 2014：235619，2014)。在后述实施例中，由于aminoleban可见与pd-l1 抗体治疗的协同效果，所以认为优选aminoleban中所含的氨基酸中 的1种或2种以上的组合。
[0097]
上述(i)～(iii)的物质也可为盐的形态。盐只要是药物上可接受的盐 即可，作为此种盐，可列举：钠盐、钾盐、锂盐之类的碱金属盐、钙 盐、镁盐之类的碱土金属盐、铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐 等金属盐；铵盐之类的无机盐、叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、 葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、 二乙基胺盐、三乙基胺盐、二环己基胺盐、n，n
′‑
二苄基乙二胺盐、 氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙基胺盐、哌 嗪盐、四甲基铵盐、三(羟基甲基)氨基甲烷盐之类的有机盐等胺盐； 氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐之类的氢卤酸盐、硝酸盐、 过氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、 乙磺酸盐之类的低级烷烃磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐之类的芳 基磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒 石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨 酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐之类的氨基酸盐等。这些盐 可通过公知的方法进行制造。
[0098]
另外，上述(i)～(iii)的物质及其盐也可与水、甲醇、乙醇、乙腈等 溶剂而生成溶剂合物。另外，溶剂合物可为单独者也可为多种的混合 物。
[0099]
在本说明书中，“类似物”是指无需较大的结构变化，显示略微追 加变更侧链等所得的同等效果的物质，是包含药品中的先导化合物的 衍生物、针对活性代谢物的前体药物、针对前体药物的活性代谢物等 的概念。作为前体药物，可例示：活性化合物的氨基经酰化、烷基化、 磷酸化的化合物(例如，活性化合物的氨基经二十烷酰化、丙氨酰化、 戊基氨基羰基化、(5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基羰基 化、四氢呋喃化、吡咯烷基甲基化、特戊酰氧基甲基化、叔丁基化的 化合物等)、活性化合物的羟基经酰化、烷基化、磷酸化、硼酸化的 化合物(例如，活性化合物的羟基经乙酰化、棕榈酰化、丙酰化、特 戊酰化、琥珀酰化、富马酰化、丙氨酰化、二甲基氨基甲基羰基化的 化合物等)、活性化合物的羧基经酯化、酰胺化的化合物(例如，活性 化合物的羧基经乙酯化、苯酯化、羧基甲酯化、二甲基氨基甲酯化、 特戊酰氧基甲酯化、乙氧基羰氧基乙酯化、酞酯化、(5-甲基-2-氧代
ꢀ‑
1，3-二氧杂环戊烷-4-基)甲酯化、环己氧基羰基乙酯化、甲基酰胺化 的化合物等)等。
[0100]
在本说明书中，“pd-1信号”是指pd-1所承担的信息转导机制， 作为其一，可例示
pd-1与作为其配体的pd-l1、pd-l2共同抑制t 细胞的活化的信息转导机制。pd-1(programmed cell death-1)是在活化 的t细胞或b细胞中表达的膜蛋白质，作为其配体的pd-l1与pd-l2 是在单核细胞或树突细胞等抗原呈递细胞、癌等各种细胞中表达。 pd-1、pd-l1和pd-l2是作为抑制t细胞的活化的抑制因子而发挥 作用。某种癌细胞或病毒感染细胞通过表达pd-1的配体，而抑制t 细胞的活化，逃避宿主的免疫监视。
[0101]
作为pd-1信号抑制剂，可列举与pd-1、pd-l1或pd-l2特异 性地结合的物质，作为此种物质，可为蛋白质、多肽、寡肽、核酸(包 含天然型核酸、人工核酸)、低分子有机化合物、无机化合物、细胞 提取物、源自动植物或土壤等的提取物等。物质可为天然物也可为合 成物。优选的pd-1信号抑制剂为抗体，更优选为抗pd-1抗体、抗 pd-l1抗体、抗pd-l2抗体等的抗体。抗体只要是可抑制pd-1信号 者即可，可为多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源 化抗体、人型抗体的任一种。这些抗体的制造方法为公知方法。抗体 可为源自人、小鼠、大鼠、兔、山羊、豚鼠等任一种生物的抗体。另 外，在本说明书中，抗体是指也包含fab、f(ab)
′2、scfv、双抗体、 vh、v
l
、sc(fv)2、双特异性sc(fv)2、微型抗体、scfv-fc单体、scfv-fc 二聚物等的低分子化所得物的概念。
[0102]
本发明的药物组合物可用作抗癌剂、感染症治疗剂或它们的组 合。
[0103]
在将本发明的药物组合物作为抗癌剂给予的情形下，作为成为对 象的癌或肿瘤，可例示：白血病、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金淋巴 瘤等)、多发性骨髓瘤、脑肿瘤、乳癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢 癌、食道癌、胃癌、阑尾癌、大肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺 癌、肾上腺癌、消化道间质肿瘤、间皮瘤、头颈部癌(咽喉癌等)、口 腔癌(口底癌等)、牙龈癌、舌癌、颊粘膜癌、唾液腺癌、鼻窦癌(上颌 窦癌、前额窦癌、筛窦癌、蝶窦癌等)、甲状腺癌、肾癌、肺癌、骨 肉瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤(睾丸癌)、肾细胞癌、膀胱癌、横纹肌肉 瘤、皮肤癌(基底细胞癌、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、恶 性黑色素瘤(melanoma，黑色素瘤)、日光性角化症、鲍文氏病(bowen
′
sdisease)、佩吉特氏病(paget
′
s disease)等)、肛门癌等，但并不限定于这 些。
[0104]
在将本发明的药物组合物作为感染症治疗剂给予的情形下，作为 成为对象的感染症，可例示：细菌感染症(由链球菌(a组β链球菌、 肺炎球菌等)、金黄色葡萄球菌(mssa(methicillin susceptiblestaphylococcus aureus)、mrsa(methicillin resistant staphylococcusaureus))、表皮葡萄球菌、肠球菌、李氏菌、脑脊髓膜炎球菌、淋菌、 病原性大肠杆菌(0157：h7等)、克雷伯氏菌(肺炎杆菌)、变形杆菌、 百日咳菌、绿脓杆菌、沙雷氏菌、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、不动杆 菌属、肠杆菌属、支原体、梭菌属等所引起的各种感染症、结核、霍 乱、鼠疫、白喉、痢疾、猩红热、碳疽、梅毒、破伤风、麻风病、军 团菌肺炎(legionellosis，退伍军人病)、钩端螺旋体症、莱姆病、兔热 病、q热等)、立克次体感染症(流行性斑疹伤寒(epidemic typhus)、恙 虫病(scrub typhus)、日本红斑热等)、衣原体感染症(沙眼、生殖器衣 原体感染症、鹦鹉病等)、真菌感染症(曲霉病、念珠菌病、隐球菌病、 发癣菌病、组织浆菌病、肺炎肺囊虫等)、寄生性原虫感染症(阿米巴 痢疾、疟疾、弓形虫病、利什曼体病、隐孢子虫属等)、寄生性蠕虫 感染症(棘球蚴病、日本血吸虫病、丝虫病、蛔虫病、阔节裂头绦虫 病等)、病毒感染症(流行性感冒、病毒性肝炎、病毒性髓膜炎、获得 性免疫缺乏综合征(aids，acquired immune deficiency syndrome)、 成人t细胞性白血病、埃博拉出血热、黄热病、感冒综合征、狂犬病、 巨细胞病毒感染症、严重急性呼吸系统综合征
(sars，severe acute respiratory syndrome)、进行性多灶性白质脑病、水痘、带状疱疹、 手足口病、登革热、传染性红斑、传染性单核细胞症、天花、风疹、 急性脊髓灰质炎(polio)、麻疹、咽结膜热(pool热)、马尔堡出血热、 汉坦病毒肾出血热、拉沙热、流行性腮腺炎、西尼罗热、疱疹性咽峡 炎、奇昆古尼亚热等)等，但并不限定于这些。
[0105]
本发明的药物组合物包含选自下述(i)～(iii)的至少1种物质，且 在给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的任一时期进行给予：
[0106]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0107]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0108]
(iii)氨基酸。
[0109]
在本发明的药物组合物中，可将pd-1信号抑制剂与选自上述 (i)～(iii)的至少1种物质进行并用或合剂化。
[0110]
在将pd-1信号抑制剂与选自上述(i)～(iii)的至少1种物质并用的 情形下，可分别给予pd-1信号抑制剂与选自上述(i)～(iii)的至少1种 物质。
[0111]
在将pd-1信号抑制剂与选自上述(i)～(iii)的至少1种物质进行合 剂化的情形下，可制成包含pd-1信号抑制剂与选自上述(i)～(iii)的至 少1种物质的调配剂。
[0112]
本发明的药物组合物是全身或局部地通过口服或胃肠外对受验 者或受验动物进行给予。
[0113]
pd-1信号抑制剂(例如，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2 抗体)是溶解于pbs(phosphate buffer solution)等缓冲液、生理盐水、 灭菌水等中，可根据需要利用过滤器等进行过滤灭菌，然后通过注射 或点滴对受验者或受验动物进行给予。另外，也可向该溶液中添加添 加剂(例如，着色剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、溶解助剂、稳 定剂、保存剂、抗氧化剂、缓冲剂、等渗剂等)等。作为给予途径， 可进行静脉、肌肉、腹腔、皮下、皮内给予等。
[0114]
pd-1信号抑制剂(例如，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2 抗体)在制剂中的含量根据制剂的种类而有所不同，通常为1～100重 量％，优选为50～100重量％。制剂可制剂化为单位给予制剂。
[0115]
pd-1信号抑制剂(例如，抗pd-l抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2 抗体)的给予量、给予次数和频率根据受验者或受验动物的症状、年 龄、体重、给予方法、给予形态等而有所不同，例如通常可向成人每 人以至少1次、可确认到所需效果的频率给予换算成有效成分的量为 0.1～100mg/kg体重、优选为1～10mg/kg体重。
[0116]
选自上述(i)～(iii)的至少1种物质可含有在包含pd-1信号抑制剂 的制剂中，也可单独或与赋形剂或载体混合，并制剂化为片剂、胶囊 剂、散剂、颗粒剂、液剂、糖浆、气溶胶、栓剂、注射剂等。赋形剂 或载体只要为本领域中常规地使用且药物上可接受者即可，其种类和 组成可适宜变更。例如，作为液状载体，可使用水、植物油等。作为 固体载体，使用乳糖、白糖、葡萄糖等糖类，马铃薯淀粉、玉米淀粉 等淀粉，结晶纤维素等纤维素衍生物等。也可添加硬脂酸镁等润滑剂、 明胶、羟丙基纤维素等粘合剂、羧甲基纤维素等崩解剂等。除此以外， 也可添加抗氧化剂、着色剂、矫味剂、保存剂等。
[0117]
选自上述(i)～(iii)的至少1种物质可通过口服、经鼻、直肠、经皮、 皮下、静脉内、肌内等各种途径进行给予。
[0118]
选自上述(i)～(iii)的至少1种物质在制剂中的含量根据制剂的种 类而有所不同，通常为1～100重量％，优选为50～100重量％。例如， 在液剂的情形下，选自上述(i)～(iii)的至少1种物质在制剂中的含量优 选为1～100重量％。在胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂的情形下，选自 上述(i)～(iii)的至少1种物质在制剂中的含量通常为约10～100重量％， 优选为50～100重量％，其余部分为载体。制剂可制剂化为单位给予 制剂。
[0119]
选自上述(i)～(iii)的至少1种物质的给予量、给予次数和频率根据 受验者或受验动物的症状、年龄、体重、给予方法、给予形态等而有 所不同，例如，通常可向成人每人以至少1次、可确认到所需效果的 频率给予换算成有效成分的量的0.005μg(或ml)～25000mg(或ml)/kg 体重左右。关于各药剂(物质)的给予量，将适当的范围、优选的范围 和更优选的范围示于下述的表中，但并不限定于这些值。
[0120]
(表)
[0121][0122]
pd-1信号抑制剂(例如，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2 抗体)与ros发生剂或控制其下游信号的物质之比率(质量)适当为1∶ 0.1～1∶100，优选为1∶1～1∶50。
[0123]
pd-1信号抑制剂(例如，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2 抗体)与显示解偶联作用的物质或控制其下游信号的物质之比率(质 量)适当为1∶0.01～1∶10，优选为1∶0.1～1∶1。
[0124]
pd-1信号抑制剂(例如，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2 抗体)与氨基酸之比率(质量)适当为1∶0.001～1∶100，优选为1∶0.01～1∶ 10。
[0125]
另外，本发明还提供一种癌症、感染症或它们的组合的治疗方法， 其包括下述的步骤：在给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的任 一时期，以药物上有效的量对受验者或受验动物给予选自上述(i)～(iii) 的至少1种物质。进一步，本发明提供选自上述(i)～(iii)的至少1种物 质的应用，其是用于治疗癌症、感染症或它们的组合，且在给予pd-1 信号抑制剂之前、之后或同时的任一时期，给予选自上述(i)～(iii)的至 少1种物质。进一步，本发明也提供选自上述(i)～(iii)的至少1种物质 的应用，其是用于在治疗癌症、感染症或它们的组合的方法中应用， 且在给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的任一时期，给予选自 上述(i)～(iii)的至少1种物质。
[0126]
另外，本发明提供增强pd-1信号抑制活性的药剂，其包含选自 上述(i)～(iii)的至少1种物质。
[0127]
本发明的药剂可用作与pd-1信号抑制剂的并用药或调配剂。关 于pd-1信号抑制剂与选自上述(i)～(iii)的至少1种物质的并用和合剂 化，已在上文中进行了说明。本发明的药剂除了作为药物的应用以外， 也可用作实验试剂。
[0128]
在研究某种物质是否为ros发生剂时，可在试管内对细胞(例如， 小鼠脾脏细胞)添加该物质，并对细胞内的ros的浓度进行测定。在 研究某种物质是否具有解偶联作用或控制其下游信号的作用时，可在 试管内对细胞(例如，小鼠脾脏细胞)添加该物质，在细胞内染色后利 用流式细胞仪(flow cytometer)测定细胞内的线粒体的质子梯度，或 使用seahorse直接进行测定。
[0129]
实施例
[0130]
以下，通过实施例更详细地说明本发明。
[0131]
[实施例1]
[0132]
[要旨]
[0133]
通过利用pd-1抑制的癌免疫治疗，癌症患者的存活率显著地提 高。但是，对于某些的患者无应答。认为pd-1抑制与其他并用剂的 并用疗法会改善免疫治疗效果。本发明人使用小鼠癌症治疗模型，发 现所属淋巴结中所出现的癌反应性细胞毒性t细胞(tumor-reactivecytotoxic t lymphocytes：tr ctls)具有较大的线粒体体积与较高的膜 电位，并且具有较高的活性氧(ros)产生。另外，证明通过ros发生 剂或利用解偶联剂的源自线粒体的ros，cd8
+
cd44
+
cd62l-t细胞 在所属淋巴结与肿瘤内增加，由pd-1抑制所引起的抗肿瘤效果增强。 进一步明确，包含白藜芦醇、直接使mtor、ampk、sirt等新陈 代谢传感器活化的试剂会增强pd-1抑制治疗效果，而长期抑制肿瘤。 重要的是这些并用治疗药单独使用时未显示出抗肿瘤效果。
[0134]
[序言]
[0135]
通过pd-1抑制的免疫疗法给癌症治疗带来了革命性冲击。作为 其特征，可列举对各种癌肿瘤具有较高的效果、长期持续抗肿瘤效果、 并且副作用较少
9、10、11
。作为活化t细胞的表面受体而表达的pd-1 在免疫应答中是作为抑制因子而发挥作用。pd-1与2个作为配体的 pd-l1或pd-l2结合，将itsm(immunoreceptor tyrosine-based switchimotif)中的酪氨酸残基磷酸化，而补充作为酪氨酸磷酸酶的shp-2。 利用shp-2，使通过t细胞受体的活化而磷酸化的zap70等活化信号 转导分子脱磷酸化，从而抑制t细胞的活化
12、13
。在动物实验中pd-1 缺损小鼠患上自身免疫疾病，由此确认到通过pd-1的免疫抑制功能 14、15、16
。如此得知，pd-1是作为免疫检测点而发挥作用，发生自身 免疫耐受。
[0136]
本发明人查明pd-1的基本作用，明确利用pd-1的特性可辅助 针对癌症或感染症的免疫应答
17、18
。实际上，在2010年发表针对恶 性黑色素瘤的临床试验的结果后
19
，迄今为止已进行了针对各种癌肿 瘤的通过pd-1抑制疗法的临床试验，其大部分显示出令人惊讶的效 果
20
。目前，对于pd-1抑制疗法，日本正下达应用于恶性黑色素瘤 或非小细胞肺癌、肾细胞癌的医疗保险的许可。pd-1抑制疗法不仅 与迄今为止的免疫疗法相比显著地提高癌症患者的存活率，而且与实 际上所使用的标准的化学疗法相比也显著地提高癌症患者的存活率。 然而，令人遗憾的是，30～50％左右的患者仍对pd-1抑制疗法无应答。 为了克服该无应答例，业界将pd-1抑制疗法与作为其他免疫检测点 因子的lag3或tim3、癌症疫苗、放射线治疗、低用量的化学疗法等 加以并用
21
。但是，迄今为止尚无通过并用疗法确认到显
著的协同效 果的报道。
[0137]
本发明人已在2002年在动物模型中确立了pd-1抑制疗法的癌症 治疗效果
17
，但尚未查明通过pd-1抑制疗法的杀肿瘤效果或免疫耐 受状态的解除是因何种机理而发生的。例如，在利用检测点抑制剂所 进行的免疫疗法中，主要是癌特异性突变抗原成为靶
22、23
，但尚不明 确效应t细胞被活化的部位是肿瘤部位还是所属淋巴结。另外，在通 过pd-1抗体治疗而根除肿瘤时，也不明确何种信号使效应t细胞向 肿瘤部位移行。另外，也几乎未知识别肿瘤反应性细胞毒杀性t细胞 与肿瘤非反应性t细胞的方法、或pd-1信号的阻断如何影响肿瘤反 应性细胞毒杀性t细胞的活化、分化状态。进一步，对于通过pd-1 抑制疗法进行治疗的癌症患者而言，通过pd-1信号的阻断而活化的 免疫监视机制为何持续数年仍为谜团
24、25
。
[0138]
为了确立使pd-1抑制疗法更有效的新颖的治疗战略，必须解答 出上述若干问题。因此，业界专注于效应功能所需的代谢重编程，并 对肿瘤反应性细胞毒杀性t细胞进行分析
1、2、3、26、27
。颇有意味的是， 在pd-1抑制疗法下自所属淋巴结提取的肿瘤特异性细胞毒杀性效应 t细胞显示出更大的线粒体的质量、更高的膜电位、和较高的线粒体 的活性氧种(ros)。这些结果显示通过阻断pd-1信号而增加线粒体 的活性，与迄今为止所报道的活体中的报道一致
28、29
。
[0139]
基于这些结果，本发明人建立了效应t细胞中的线粒体的功能刺 激使pd-1阻断疗法中的抗肿瘤效果的增强的假说。实际上将作为能 量代谢传感器的腺苷酸活化蛋白激酶(ampk，amp-activated proteinkinase)或sirt1、雷帕霉素机制性靶蛋白(mtor，mechanistic target ofrapamycin)活化的药剂显示出与pd-1阻断疗法的协同性抗肿瘤效果。 这些见解或许会开辟用于开发针对对于pd-1抑制疗法的效果较弱的 患者的并用疗法的道路。
[0140]
[结果]
[0141]
由pd-1阻断所引起的dln(draining lymph node)中的肿瘤反应性cd8阳性t细胞的线粒体活性的增大。
[0142]
随着t细胞的活化，必须迅速地供给急剧的细胞增殖所需的因 子。因此，本发明人决定在所属淋巴结中研究通过pd-1抑制诱导的 肿瘤反应性cd8阳性t细胞的代谢变化。作为pd-1抑制疗法的机制 查明中的1个问题，可列举如下方面：由于通过pd-1阻断发生具有 与各种肿瘤抗原反应的多样化的t细胞受体库的ctl，所以难以进 行肿瘤反应性细胞毒杀性t细胞(tr ctls)的全面鉴定
30、31
。为了解 决该问题，将利用cell trace标记的cd45.1阳性cd8阳性t细胞移 植至cd45.2阳性cd8 ko小鼠。推测其后肿瘤反应性cd8阳性t 细胞会选择性地活跃地增殖，并对所属淋巴结中的经标记的t细胞的 增殖进行研究(图2a)。在mc38带癌小鼠中，所移植的cd45.1阳性 cd8阳性t细胞分成活跃地分裂的细胞组(高分裂组)与分裂较少的细 胞组(低分裂组)(图2b)。带癌小鼠中的cd45.1阳性cd8阳性t细胞 的高分裂组的绝对数或比率与给予对照抗体igg的组相比，在利用 pd-l1抗体进行治疗的组中增加(图2b)。值得指出的是，pd-l1抗体 在非带癌小鼠中在上述增殖方面未见差异。由此表明，剧烈地发生分 裂的cd8阳性t细胞实际上因肿瘤抗原而活化可能性较高(图2b)。 进一步，在所属淋巴结中的cd45.1阳性cd8阳性t细胞中，在因 pd-l1抑制而造成的高分裂组的组分中，检测到作为mc38的变异抗 原决定基的mlama4肽/mhc四聚物阳性细胞组(图2c)
22
。因此，
认 为在活跃地增殖的细胞组中包含大量tr ctls。
[0143]
其次，本发明人对于所属淋巴结中较强地增殖的tr ctl的代谢 功能进行了研究。认为线粒体的代谢不仅对t细胞的活化较重要，而 且对持续的t细胞的增殖或记忆t细胞的形成也重要，因此本发明 人专注于trctls中的线粒体的功能
26、32
。cd8阳性t细胞中的高 分裂组与低分裂组相比，线粒体的质量较大，膜电位较高，线粒体的 活性氧种(ros)的产生较多
33
，由此表明通过pd-1阻断在tr ctls 中线粒体不断活化(图2d)。与上述结果一致，作为线粒体的呼吸的指 标的ocr(oxygen consumption rate，氧消耗速度)与atp的基本使用 量在利用pd-l1抗体进行治疗的小鼠的所属淋巴结中的cd8阳性t 细胞中显著地增高(图2e-f)
34
。由这些结果证明，在pd-1阻断治疗中 伴随tr ctls的增殖，线粒体的代谢速度上升。
[0144]
ros是为了增强由pd-1阻断所引起的抗肿瘤活性而必需。
[0145]
如上述所示，ros因pd-l1抗体治疗而显著地增加。ros是在 线粒体的电气转导系统(etc)的复合物i、复合物ii、复合物iii中发 生
35
。并且，线粒体的ros也作为用于t细胞的抗原性的扩张的信 号转导因子而发挥功能
26、32
。另一方面，已知外因性的ros或其发 生源会直接损伤肿瘤细胞，考虑作为癌症治疗药候补
36
。考虑这些的 两者，本发明人决定首先试验ros发生剂单独是否具有杀肿瘤效果。 虽然向mc38带癌小鼠给予作为ros的前体物质的氢过氧化叔丁基 溶液(luperox)，但未确认到抗肿瘤效果(图3a)。进一步，确认到没有 通过luperox单独进行活体内处理的肿瘤细胞的免疫控制表面标记物 和转录分布图的显著变化(图12)。然而，若与pd-l1抗体并用，则显 著地强化抗肿瘤效果，带癌小鼠的存活率延长(图3b、c)。根据这些 数据暗示到，luperox是并非通过对肿瘤细胞的直接作用而是经由t 细胞的活化来提高pd-l1抗体的抗肿瘤效果。作为直接的线粒体ros 发生剂的巴拉刈也增强pd-1抑制的效果(图13a、b)。作为对照，给 予作为使线粒体不稳定、抑制atp合成的药剂的寡霉素与羰基氰对 三氟甲氧基苯腙(fccp)、2，4-二硝基苯酚(dnp)
37
。于是出乎意料的是， 作为线粒体的解偶联剂的fccp与dnp增强pd-l1抗体治疗的效果， 与pd-l1单独给予组相比显著地提高小鼠模型的存活率(图4a)。重要 的是得知，与leuperox同样，fccp与dnp也是若单剂给予则未显 示出抗肿瘤效果，且不具有对肿瘤细胞的直接作用而提高pd-l1抗 体的抗肿瘤效果(图4b)。进一步，在自单独给予fccp的小鼠采集的 肿瘤细胞的表型分析、转录分布图分析中未显示出显著差异，该情况 显示，解偶联剂增强杀伤肿瘤的杀伤性t细胞的功能而非直接杀伤肿 瘤(图12)。由于认为线粒体的解偶联(uncoupling)有通过在降低线粒 体膜电位时减少ros，而进行保护免受氧化性损伤的作用，所以fccp 与dnp的抗肿瘤效果中的协同效果出乎意料
37
。起初有解偶联剂会 减少或增加线粒体的ros发生是相反的报道
38、39
。本发明人确认到 pd-l1抗体与解偶联剂的并用疗法的效果因mntbap(具有ros消除 效果的合成金属卟啉)的给予而受到抑制(图4c)。由此表明，解偶联 剂的协同效果是经由ros信号的效果。不可思议的是，通过pd-l1 抗体与dnp、luperox的3剂并用确认到较强的抗肿瘤效果(图5)。 这暗示解偶联剂在ros以外的任一途径中也提高pd-1抑制的效果的 可能性。
[0146]
解偶联剂促进di，n中的cd62l阴性cd44阳性效应t细胞的生成，增强在肿瘤部位的它们的聚集。
[0147]
那么，解偶联剂如何经由ros而提高pd-l1抗体的抗肿瘤免疫？为了解答该疑问，本
发明人首先对所属淋巴结与肿瘤部位的两者 中的cd8阳性t细胞的组分进行研究。如图6a所示，在所属淋巴结 中，关于效应cd8阳性t细胞(cd62l阴性cd44阳性：p3门)的绝 对数或比率，pd-l1抗体与fccp的并用疗法组与pd-l1抗体单独组 相比显著地增加。作为对照，幼稚t细胞(cd62l阳性cd44阴性： p1门)与中心记忆t细胞(cd62l阳性cd44阳性：p2门)虽然在单独 使用pd-l1抗体时增加，但即便添加fccp也无更多的增加(图6a)。 重要的要点为任何治疗组中的p3细胞组与p1或p2细胞组相比，每 个细胞的线粒体的质量、膜电位均较高，ros均较多；及关于膜电 位与ros产生，在与fccp的并用疗法中显著地增加(图6b)。由这 些现象暗示到：a)关于所使用的fccp的用量，并无线粒体的质量 的降低或膜电位的下落，无毒性(若为更高的用量则预测到毒性)；b) 由于增加的p3细胞组中确认到较高的线粒体ros产生，所以利用解 偶联剂的协同效果是经由ros的效果；c)适度的线粒体损伤的反馈 反而有可能增强线粒体活性(图6b)。
[0148]
值得指出的是，随着所属淋巴结中的此种变化，即使对于浸润于 肿瘤内的cd8阳性t细胞而言，p3细胞组也显著地增加(图6c)。由 这些结果表明下述的效果：pd-l1抗体与解偶联剂的并用疗法，在所 属淋巴结与作为其靶的肿瘤部位的两者中，增强效应cd8阳性t细 胞的尺寸或功能性。
[0149]
能量代谢传感器的ampk及mtor与解偶联剂的免疫增强效果相关。
[0150]
ampk与mtor虽然为相反的能量代谢传感器，但认为磷酸化 ampk与mtor的均衡性控制cd8阳性t细胞的分化
1、40、41、42、43、44
。由于可知由解偶联剂所引起的amp(adenosinemonophosphate)/atp比的增加将ampk活化
45
，所以本发明人对通 过pd-l1抗体与解偶联剂的并用疗法进行治疗的带癌小鼠的所属淋 巴结中的cd8阳性t细胞的ampk与mtor的磷酸化状态进行研究。 在自通过pd-l1抗体与dnp或fccp的并用疗法进行治疗的小鼠采 集的cd8阳性t细胞中，ampk与作为与其相关的蛋白的acc与 sirt1在并用疗法后的多个时刻进行活化(图7a)。但是，意料以外的 是，mtor与作为其相关蛋白的s6k与4ebp1也在并用疗法后进行 活化(图7a)。
[0151]
然而，该无法理解的结果是通过所属淋巴结中的cd8阳性t细 胞之中不均匀地混合存在有ampk/mtor均衡性不同的细胞而说 明。实际上在p2细胞组中p-ampk虽然较p-mtor上升，但在p3 细胞组中p-mtor高于p-ampk(图8)。基于这些结果，其次研究若 直接使mtor与ampk的任一者活化，是否可增强pd-1抑制疗法 的效果。如图7b所示，mtor活性剂与ampk活性剂均在早期(20 天以前)略微增强pd-1抑制疗法的效果，相对于此，若为mtor活 性剂与ampk活性剂的3剂并用，则会增强pd-l1抗体的效果，改 善存活率。这些结果显示，mtor与ampk的两者的活化是与pd-l1 抗体和解偶联剂的协同性杀肿瘤活性相关。
[0152]
根据pd-l1抗体和解偶联剂的并用疗法使sirt1增加的情况(图 7a)，研究作为nad(nicotinamide adenine dinucleotide)依赖性蛋白脱 乙酰化酶的sirt1的活化是否对pd-l1抗体治疗的效果有影响。报 道了利用被报道有可能具有肿瘤抑制效果的多酚的1种、白藜芦醇， 使sirt1进行活化
6、46
。进一步报道了低用量的白藜芦醇sirt1依赖 性地引起ampk活化与线粒体的生物合成6，进一步报道了在特定的 条件下还辅助mtor途径
47、48、49
。实际上，在pd-l1抗体与白藜芦 醇的并用疗法中，与pd-l1单独治疗相比，显著地确认到肿瘤尺寸 的减少与存活率的延长(图7c)。由该结果表明：pd-l1抗体与作为能 量代谢传感器的ampk或mtor、sirt1的活化的并用会增强活体 内的tr ctl的增殖或功能性。
[0153]
pgc-1α活性剂增强pd-1抗体的治疗效果
[0154]
pgc-1α是通过ampk或mtor进行调节的转录辅因子，是使 线粒体的生物合成或氧化磷酸化增强的因子
45、46
。在fccp、或mtor 活性剂、ampk活性剂与pd-l1抗体的并用治疗中，蛋白质与mrna 中的pgc-1α的表达不断增加，是与迄今为止的报道并不矛盾的结果 (图11a)
37、45、46
。在仅给予pd-l1抗体的情形下，蛋白质中的pgc-1α 的表达虽然增加，但mrna中的pgc-1α的表达减少。认为其原因 在于：pgc-1α的调节是与转录、翻译和蛋白质稳定性等较多阶段相 关
46、47
。pgc-1α是通过与nrfs或ppars等转录因子相关而发挥功 能
46
。本发明人对作为pgc-1α/nrf2的活性剂的奥替普拉与作为 pgc-1α/ppars活性剂的苯扎贝特是否会增强pd-l1抗体的抗肿瘤效 果进行实验
48、29
。结果奥替普拉与苯扎贝特均增强pd-l1抗体的肿 瘤成长抑制效果，改善带癌小鼠的存活率(图11b)。
[0155]
为了研究mc38以外的肿瘤中的pd-1抗体的并用治疗效果，将 作为小鼠的皮肤肉瘤细胞株的metha移植至balb/c小鼠的皮内， 对使用fccp或巴拉刈、奥替普拉的并用疗法进行试验。结果所有药 剂均显示出pd-l1抗体的抗肿瘤效果的增强(图14)。这显示线粒体活 性剂与pd-1抑制抗体的并用治疗对具有不同的基因背景的各种肿瘤 存在效果。
[0156]
与fccp或苯扎贝特的并用治疗增强ctl的t-bet表达。
[0157]
已知对于由pd-1抑制所引起的细胞因子分泌或肿瘤反应性ctl 的活化重要的转录因子t-bet是利用mtor并经由foxo1抑制而进 行活化。因此，本发明人对pd-l1抗体与fccp的并用治疗是否会 影响t-bet与eomes的表达进行了研究。与pd-l1抗体及fccp的并 用疗法使mtor活化的上述发现一致，fccp在cd8阳性细胞中虽 然会使t-bet的表达增加，但不会使eomes的表达增加(图15a)。非常 有趣的是，与foxo1逆向地控制t-bet及eomes的报道一致，使mtor 的下游的转录因子活化的苯扎贝特也会使t-bet增加，反而使eomes 减少(图15a)。进一步在并用治疗中作为杀伤性t细胞功能之一的干 扰素(ifn)-γ产生在肿瘤内增强(图15b)。这与对于th1型免疫重要的 t-bet的表达增强一致。这些结果暗示苯扎贝特或许将线粒体活化， 进一步发生正反馈，而使mtor活化。对以上的结果进行总结，解 偶联剂与pd-1抑制的协同效果的分子机制是经由ampk或mtor 与其下游的包含nrf2或ppars的转录因子或pgc-1a等偶联因子的 活化(图1)。
[0158]
[考察]
[0159]
本发明人显示利用pd-l1抗体进行活化的tr ctl等使线粒体活 化，增强ros的产生，进一步发生ros的药剂增强pd-1抑制的抗 肿瘤效果。意料以外的是判明，2个有名的作为线粒体的解偶联剂的 fccp与dnp也增强pd-l1抗体的抗肿瘤效果。根据ros清除剂会 抵消其协同效果的情况表明，解偶联剂的协同效果取决于ros的发 生。由于线粒体的解偶联剂存在抑制ros产生的作用，因此认为对 缺血性损伤或心力衰竭、胰岛素抗性、肥胖、老化等与氧化应激相关 的疾病的治疗有用，所以此次的结果是意料以外的
50
。根据解偶联剂 的单独给予不会对t细胞的增殖及肿瘤增生造成影响的情况得知，本 研究中使用的最低剂量下的解偶联剂反而具有弥补因pd-1阻断而诱 发的免疫学现象或免疫反应的作用。
[0160]
虽然作为天然多酚的白藜芦醇以心血管改善作用或抗衰老效果、 抗肿瘤效果而已知，但其显示出白藜芦醇诱导线粒体生物合成，而诱 导保护不生病的代谢功能的可能性。本发明人查明了低用量的白藜芦 醇会增强pd-1抑制治疗的效果。与解偶联剂同样地，白藜芦醇本身 与肿瘤增殖无关，或反而会使肿瘤增大。然而，通过与pd-l1抗体 并用，显著
地显示出肿瘤的抑制效果，使动物模型中的存活率提高。
[0161]
可是，这些药剂如何同样地发生与pd-1抑制疗法的协同效果？ 线粒体的能量代谢与经由mtor或ampk的细胞内代谢密切相关
5、6、49、51
。本发明人确认到ampk及其相关蛋白通过pd-l1抗体与解 偶联剂的并用疗法而进行活化。重要的是，ampk或sirt1的直接 活性剂均增强pd-l1抗体的抗肿瘤效果。
[0162]
本发明人证明了偶联剂与pd-1抑制的并用疗法不仅将ampk途 径活化，也将mtor途径活化，mtor的直接活性剂也增强pd-l1 抗体的效果。由于迄今为止认为mtor途径的活化与ampk的磷酸 化进行竞争，所以这些结果是意料以外的
1、41、42、43、52
。但是，在认为 所分离的cd8阳性t细胞由不仅根据不同的活化功能状态、也根据 生物化学反应或动态的变动而有所不同的不均匀细胞所构成的情形 下，可以说明本发明人的结果与迄今为止的报道并不矛盾。本发明人 认为mtor途径的活化发生由pd-l1抑制以及fccp或苯扎贝特刺 激所得的dln ctl中的t-bet的表达。t-bet在对于肿瘤消退所需的 成为终末分化效应ctl的供给源的记忆前体物质的分化中是重要的， 关于ctl的抗肿瘤效果也认为是重要的
55、56
。另一方面，认为高效 表达eomes的终末分化ctl因慢性的抗原识别而为免疫耐受的状 态
56、57
。在本发明人的实验结果中，通过fccp或苯扎贝特与pd-1 抗体治疗的并用，t-bet与ifn-γ的表达上升，eomes的表达反而降 低。该结果与通过并用疗法伴有线粒体的活化的效应记忆细胞组(p3 细胞组)增加的本发明人的结论并不矛盾。
[0163]
pgc-1α是调节与线粒体的生物合成或线粒体的氧化磷酸化相关 的一系列转录因子的分子。ampk或mtor的活化是使pgc-1α的 表达增加，并经由磷酸化进行活化。本发明人显示通过解偶联剂与 pd-1抗体的并用疗法pgc-1α的表达增加，或在肿瘤的治疗模型中 pgc-1α活性剂(苯扎贝特、奥替普拉)也与pd-l1抗体具有协同性增 强效果。由该结果表明，pgc-1α是引起线粒体的活化或扩大的重要 分子，且是诱导ampk或mtor活化的正反馈信号转导的重要分子。 进一步，解偶联剂或苯扎贝特通过与pd-l1抗体并用，而将位于mtor下游的作为重要的细胞因子调节因子的t-bet加以活化。
[0164]
将迄今为止的与机理相关的假说的整体情况汇总于图1。
[0165]
a)通过pd-1阻断，引起活化cd8阳性t细胞中的线粒体的扩 大或增殖。
[0166]
b)解偶联剂或ros发生剂使线粒体的体积增加，导致ros的 增加。认为或许ros通过某种途径将ampk与mtor进行活化
36
。
[0167]
c)ampk与mtor的活化是使pgc-1α的表达增加并使之活化。
[0168]
d)最终，pgc-1α与作为其结合转录因子的nrfs与ppars增加 使脂肪酸的氧化与氧化磷酸化活化的一系列转录因子的表达，另外， 引起导致ctl的活化或分化的线粒体的扩大。
[0169]
最近，虽然有报道称pd-1途径会抑制线粒体的活化与pgc-1α 的表达，但这些报道与本发明人的假说也不矛盾
63、64
。ros或解偶 联剂、ampk活性剂、mtor活性剂、pgc-1α活性剂等本发明人在 本研究中所使用的所有药剂在与pd-1抗体并用的情形下，虽然经由 线粒体的活化或扩大而导致cd8
+
t细胞的活化或分化，但在以单剂 给予的情形下并无同样效果。
[0170]
本发明人通过至今为止的结果而显示了可应用于对pd-1抗体治 疗无应答性的癌症患者的革新性并用疗法的有效性。自移植了对 pd-1治疗无应答性的肿瘤的小鼠所提取的ctl未引起线粒体的活 化，由此认为本发明人的研究也有助于与判定pd-1抗体治疗的有
效 性的生物标记物的研究。今后，重要的是研究根据线粒体的代谢变化 而发生变化的血清中代谢物量、或在pd-1抗体治疗前后收集的样品 中的cd8
+
t细胞的ocr活性、与线粒体的活化信号相关的rna的 表达是否可以成为与pd-1抗体治疗的应答性相关的生物标记物。另 外，由并用药所引起的pd-1抗体治疗的协同性增强效果有助于减少 被争论会危及社会保障制度的昂贵的pd-1抗体的给予量。
[0171]
目前，通过pd-1/pd-l1阻断的癌症治疗大致有2个问题。第1 个问题如上所述是pd-1抑制治疗不会对所有患者有效果。因此，进 行增强pd-1抑制疗法的抗肿瘤效果的可能性较高且可临床应用的药 物的开发。本发明人的结果针对对pd-1抑制疗法无效果的患者，提 供新颖的并用疗法的选项。另一个问题是与由pd-1抑制疗法单独或 并用疗法所发生的副作用相关，尤其可列举由药剂所特有的毒性或过 度的免疫应答所诱发的自身免疫性疾病
57
。伴随此种增强免疫治疗的 治疗介入，副作用也被增强的可能性很大。在pd-l1抗体与此次的 研究中所使用的药剂的并用治疗中，虽然未见特别明显的自身免疫反 应，但若考虑临床应用，则需要使用本发明人在以前所确立的自身免 疫疾病模型小鼠而评价该风险
14、15、16
。dnp在1930年代是用作膳食 增补剂(diet supplement)或提高代谢速度的药剂
58
。但是，由于因质子 驱动力的崩解所发生的效果，所以dnp会引发严重的健康伤害，而 被禁止使用
59
。fccp被广泛用于线粒体的活体能量学的研究，但 fccp也存在细胞毒性及一定程度的质膜去极化作用，所以未进行临 床应用
50
。在本研究中，5种药剂虽然显示出增强由pd-1抑制所引 起的抗肿瘤效果，但若考虑在代谢性疾病的治疗中较多地尝试或作为 日常的增补剂(supplement)服用，则作为sirt1活性剂的天然多酚的 白藜芦醇较为理想
5、51
。虽然报道了白藜芦醇单独的抗肿瘤效果，但 也存在其剂量依赖性，在抗肿瘤效果方面存在异议
60
。本试验中所使 用的剂量为最低剂量，至少在本发明人所进行的试验中，并无肿瘤增 生抑制效果(反而呈现其相反)。本发明人所鉴定的其他并用疗法为解 偶联剂或ros下游的信号的活性剂。若考虑脱靶的减少，则以mtor 与ampk、sirt1的下游作为靶的治疗法有增强抗肿瘤效果并且弱化 不期望的副作用的可能性。
[0172]
总之，本发明人对控制线粒体的能量代谢检测点，并增强pd-1 抑制治疗的效果的药剂进行了鉴定。对于经由pd-1的t细胞的控制、 或针对pd-1抑制疗法抗性的癌症患者、或感染疾病的并用疗法，本 研究的结果可谓开辟出了新的途径。值得关注的是，由于奥替普拉和 苯扎贝特已用作临床药物，所以可应用于与pd-1抗体的并用疗法的 临床研究。
[0173]
[步骤与材料]
[0174]
小鼠与细胞
[0175]
所有小鼠均在京都大学研究生院医学部动物实验设施中，在无病 原体的特别的spf(specific-pathogen free)环境下饲养，并在适当的实 验计划下使用。c57bl/6和balb/c(5-6周龄)是自日本查尔斯河实验 室(charles river laboratories japan)(横滨)获取。小鼠结肠腺癌mc38 细胞是由dr.jim allison(memorial sloan-kettering cancer center，newyork，ny)提供。纤维肉瘤metha是自生物医学研究细胞资源中心 (cell resource center for biomedical research)(仙台、日本)获得。这些 细胞是在包含10％热灭活fbs(fetal bovine serum)和1％抗真菌性抗 生素(invitrogen)的dmem(dulbecco modified eaglemedium)(invitrogen)中进行培养。该细胞系统在分枝杆菌属中不会被 感染。
biotec)，利用胶原 酶iv型(thermo fisher scientific)进行酶处理。使用每毫克的肿瘤细 胞数作为绝对数。使用小鼠癌细胞分离试剂盒(tumor cell isolation kit， mouse)(miltenyibiotec)自消化的肿瘤组织将肿瘤细胞分离。该试剂盒 通过排除淋巴细胞、红细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤相关的基 质细胞，将肿瘤细胞纯化。通过facsaria(bd bioscience)，进一步 将肿瘤细胞集团分离、纯化而使用。
[0189]
流式细胞仪分析
[0190]
使用识别所示抗原的以下的抗体：来自biolegend的 cd44(1m7)、cd45.2(104)、cd45.1(a20)、cd8(53-6.7)、 cd62l(mel-14)、t-bet(4b/o)和ifn-γ(xmg1.2)、i型 mhc(af6-88.5)、cd155(tx56)和vista(mih63)；来自ancam的 p-ampk(epr5683)；来自ebioscience的p-mtor(mrrby)、 eomes(danllmag)和pd-l1(m1h5)。所有流式细胞仪是利用facscanto ii(bd biosciences)进行，并利用flowjo软件(flowjo、llc) 进行分析。在细胞内磷酸化蛋白的评价中，利用0.5％tritonx对细 胞进行透过处理，在染色前利用1.5％pfa(paraformaldehyde)进行固 定。线粒体的质量、膜电位、线粒体的超氧化物和细胞的ros的测 定分别使用mitotracker green、mitotracker deep red、mitosox red 和cellrox green reagents进行(均为life technologies)。这些色素的 各自的最终浓度是设为0.125μm、0.125μm、5.0μm和0.625μm，并 在37℃5％co2加湿培养箱中培养30分钟。
[0191]
氧消耗率的测定
[0192]
氧消耗率是利用xf96细胞外流量分析仪(seahorse biosciences) 进行测定。将4
×
105的cd8
+
t细胞撒在规定的xf96板上。向模组中 依序添加xf cell mito stress测试试剂盒(seahorse bioscience)附有的 线粒体的氧化磷酸化的4种药剂。具体而言，基本性的ocr测定是 在依序添加寡霉素、fccp、鱼藤酮/抗霉素a后进行。atp转化率是 定义为(寡霉素添加前的最终值-寡霉素添加后的最小值)
34
。
[0193]
实时pcr(real-time rt-pcr)
[0194]
使用rneasy迷你试剂盒(qiagen)自cd8阳性t细胞或肿瘤细 胞将rna分离，并通过逆转录合成cdna。pgc-1a的实时pcr是 使用以下的引物而进行：正向actcggattgctccggccct(序列编 号1)与反向actgacggcctaactccaccca(序列编号2)。为了对 凋亡与线粒体的能量代谢相关基因的表达量进行分析，使用rt2 profiler pcr阵列基因表达试剂盒pamm-012z或 pamm-008z(qiagen)。本分析中所含的基因列表可在下述的网址查 看http://www.sabiosciences.com/apoptosis.php。
[0195]
蛋白质印迹(western blotting)
[0196]
利用小鼠cd8微珠(milteni biotec)对cd8
+
t细胞进行分离。在 进行pbs 2次洗净后，利用包含30mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl、 10％甘油、0.1％sds(sodium dodeeyl sulfonate)、1％triton-x-100、 0.05％na-doc、5mm edta(ethylenediamine tetraacetic acid)(ph8.0)、 蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor mixture)(roche molecularbiochemicals)、以及磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitors)(nacalaitesque)的溶解缓冲液使2
×
106的细胞可溶化。在利用dc蛋白分析 (bio-rad)进行的蛋白质浓度测定后，将蛋白质4μg置在4-20％梯度 mini-protean tgx gels(bio-rad)，电印迹到硝酸纤维素膜上，之 后在于tbs(tris buffered saline)中包含1％bsa的封闭缓冲液中进行 培养。一次抗体培养是在封闭缓冲液中在4℃下进行一晚。洗净后， 二次抗体培养是在封闭缓冲液中
在室温下进行40分钟。印迹是利用增强化学发光(enhancedchemiluminescence)(amershampharmacia)进行展开。使用识别以下蛋白质的一次抗体：phospho-mtor(p-mtor)(cat#5536)、phospho-ampkα(p-ampk)(#2535)、phospho-p70s6激酶(p-s6k)(#9205)、4e-bp1(#9644)、phospho-acetyl-coacarboxylase(磷酸乙酰辅酶a羧化酶)(p-acc)(#3661)、sirt1(#9475)。所有一次抗体是自cellsignalingtechnology获取。识别pgc-1α(sc-13067)的抗体是自santcruz获得。
[0197]
统计分析
[0198]
统计分析是利用prism6来进行。为了对3个以上的变量进行分析，在单向anova分析(单向方差分析)后进行sidak的多重比较检验(sidak’smultiplecomparisontest)。为了对两个组进行比较而进行学生t检验(studentttest)。所有统计分析是假设为参数数据，进行2标本的检验。将p值小于0.05者设为显著。数据的偏差是作为平均值
±
标准误差(sem)进行评价。为了推定本研究中的试样尺寸，认为5个以上的试样较为合适。试样与动物是自集团中随机选择并进行处理。试样或动物的处理并非盲检。
[0199]
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[0260]
[实施例2]
[0261]
对c57bl/6小鼠接种5
×
105的小鼠大肠癌mc38。7天后腹腔内 给予抗pd-l1抗体(1-111a、150μg)与ampk抑制剂(化合物c：200μg 的bbs液，200μl)。抗pd-l1抗体是每隔6天给予3次，化合物c(c.c) 是每隔2天给予7次。显示自接种mc38至第25天的肿瘤的体积 (mm3)。
[0262]
将结果示于图9。ampk抑制剂会增强抗pd-l1抗体治疗的效 果。
[0263]
[实施例3]
[0264]
对balb/c小鼠接种2
×
106的小鼠肾癌renca。7天后腹腔内给 予抗pd-l1抗体(1-111a、150μg)与ampk抑制剂(化合物c：200μg 的pbs液、200μl)。抗pd-l1抗体是每隔6天给予3次，化合物c(c.c) 是每隔2天给予7次。显示自renca接种至第25天的肿瘤的体积 (mm3)。
[0265]
将结果示于图10。ampk抑制剂会增强抗pd-l1抗体治疗的效 果。
[0266]
[实施例4]
[0267]
对c57bl/6小鼠接种5
×
105的mc38。7天后腹腔内给予抗pd-l1 抗体(1-111a、150μg)与pgc-1α/转录因子复合物活化剂(2-(4-{2-[(4
‑ꢀ
氯苯甲酰基)氨基]乙基}苯氧基)-2-甲基丙酸(苯扎贝特)：10μg的pbs 液、200μl)。抗pd-l1抗体是每隔6天给予3次，苯扎贝特是每隔2 天给予7次。显示自接种mc38至第25天的肿瘤的体积(mm3)。
[0268]
将结果示于图11。pgc-1α/转录因子复合物活化剂会增强抗 pd-l1抗体治疗的效果。
[0269]
[实施例5]
[0270]
对balb/c小鼠接种5
×
105的metha，7天后腹腔内给予抗pd-l1 抗体(1-111a、80μg)与foxo1抑制剂(5-氨基-7-(环己基氨基)-1-乙基-6
‑ꢀ
氟-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸、calbiochem)(2mg/kg)。给予时间表是 依据图3。将自metha接种至第28天的肿瘤的体积(mm3)示于图16。 foxo1抑制剂会增强抗pd-l1抗体治疗的效果。
[0271]
[实施例6]
[0272]
通过gc-ms分析对5只pd-1-/-小鼠(immunity 11，141-151 (1999).；science 291，319-322(2001).；nat.med.9，1477-1483(2003).) 与野生型c57bl/6n小鼠(与pd-1-/-小鼠同胎出生的小鼠)的血清中所 含的氨基酸量进行鉴定。将结果示于图17。图17是表示将野生型的 值设为1时的pd-1-/-小鼠的值。在缺损pd1的小鼠体内进行t细胞 的分裂，血中氨基酸进行代谢，其值减少。
[0273]
对balb/c小鼠接种5
×
105的纤维肉瘤metha(cell resourcecenter for biomedical research)，7天后给予抗pd-l1抗体(1-111a、 60μg)与aminoleban(大冢(塚)制药、400μl/mouse)。给予时间表是依据 图3。将aminoleban的组成示于图18。
[0274]
将结果示于图19。氨基酸会增强抗pd-l1抗体治疗的效果。
[0275]
将本说明书中所引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考 而编入至本说明书中。
[0276]
产业上的可利用性
[0277]
本发明的药物组合物可以用作抗癌剂、感染症治疗剂或它们的组 合。
[0278]
序列表自由文本
1α的转录因子复合物)的物质为选自下述的至少1种 化合物：2-(4-{2-[(4-氯苯甲酰基)氨基]乙基}苯氧基)-2-甲基丙酸、9
‑ꢀ
顺式，12-顺式-十八碳二烯酸)、2-[4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基]-2-甲基丙 酸-d6 1-甲基乙酯、(十一烷硫基)-乙酸、4-甲基-5-(2-吡嗪基)-3-二硫杂 环戊烯硫酮、n，n-二甲基甲酰胺、3-[4-(2，4-双(三氟甲基)苄氧基)-3
‑ꢀ
甲氧基苯基]-2-氰基-n-(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)丙烯酰胺和它 们的类似物。
[0297]
11.实施方案6所述的药物组合物，其中，控制foxo1的物质为选自 下述的至少1种化合物：5-氨基-7-(环己基氨基)-1-乙基-6-氟-4-氧代
ꢀ‑
1，4-二氢喹啉-3-羧酸、2-环戊基-n-{2，4-二氯-3-[(异喹啉-5-基氧基)甲 基]苯基}-n-甲基乙酰胺及其类似物。
[0298]
12.实施方案1～3中任一项所述的药物组合物，其中，氨基酸为选自 下述的至少1种化合物：色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪 氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、 脯氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和它们的类似物。
[0299]
13.实施方案1～12中任一项所述的药物组合物，其被用作抗癌剂、 感染症治疗剂或它们的组合。
[0300]
14.实施方案1～13中任一项所述的药物组合物，其分别给予pd-1信 号抑制剂与选自下述(i)～(iii)的至少1种物质：
[0301]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0302]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0303]
(iii)氨基酸。
[0304]
15.实施方案1～13中任一项所述的药物组合物，其为包含pd-1信号 抑制剂与选自下述(i)～(iii)的至少1种物质的调配剂：
[0305]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0306]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及(iii)氨基酸。
[0307]
16.pd-1信号抑制活性增强剂，其包含选自下述(i)～(iii)的至少1种物 质：
[0308]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0309]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0310]
(iii)氨基酸。
[0311]
17.癌症、感染症或它们的组合的治疗方法，其包括下述的步骤：在 给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的任一时期，以药物上有效 的量对受验者或受验动物给予选自下述(i)～(iii)的至少1种物质：
[0312]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0313]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0314]
(iii)氨基酸。
[0315]
18.选自下述(i)～(iii)的至少1种物质的应用，其是用于治疗癌症、感 染症或它们的组合，且在给予pd-1信号抑制剂之前、之后或同时的 任一时期，给予选自下述(i)～(iii)的至少1种物质：
[0316]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0317]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0318]
(iii)氨基酸。
[0319]
19.选自下述(i)～(iii)的至少1种物质的应用，其是用于在治疗癌症、 感染症或它们的组合的方法中应用，且在给予pd-1信号抑制剂之前、 之后或同时的任一时期，给予选自下述(i)～(iii)的至少1种物质：
[0320]
(i)ros发生剂和控制其下游信号的物质、
[0321]
(ii)显示解偶联作用的物质和控制其下游信号的物质、以及
[0322]
(iii)氨基酸。