痤疮丙酸杆菌的预防性和治疗性免疫治疗的制作方法

背景技术：

技术实现思路

0、3
技术实现要素：

1、因此，本发明提供了本文要求保护和进一步描述的主题，包括其实施方案。本发明提供了用于免疫靶向痤疮丙酸杆菌的实际和临床相关策略以及与这种微生物相关的治疗结果。本发明旨在免疫学地解决(人类)患者的免疫系统，以便能够有效预防或治疗痤疮丙酸杆菌适应症。用根据本发明的产品，尤其是疫苗以及治疗性和预防性方法，痤疮丙酸杆菌适应症得到有效控制、改善或治愈。相比于痤疮丙酸杆菌适应症的治疗领域中的目前情况(尤其是对于寻常痤疮：zaenglein等人2016)，其中没有提出可行的疫苗接种方法并且痤疮的免疫病理学被指示为是疾病发病机制知识的一个空白，本发明提供了用于此类障碍的合适且相关的预防和治疗方法。另外，目前在临床试验中测试的药物与几十年前发现的药物并没有太大区别，并且显示出令人失望的结果，此外，基于痤疮丙酸杆菌抗原的疫苗策略在可行性方面受到质疑(zouboulis等人2017)。因此，本发明-首次-开辟了一种可行的痤疮丙酸杆菌适应症的疫苗接种方法。

2、优选地，包含根据本发明的创新多肽的疫苗(其可用作治疗性或预防性治疗)保护对抗宽范围的遗传上不同的痤疮丙酸杆菌菌株，所述遗传上不同的痤疮丙酸杆菌菌株定殖于人类宿主并且能够在有利于毒力基因和性状表达的特定环境或条件中变得有致病性。优选地，利用本发明，表位被鉴定和表征为当由活痤疮丙酸杆菌细菌呈现时直接可及于抗体，并且免疫系统对这些表位的特异性结合导致细菌数量、适合度、生长、毒力或其组合的降低。优选地，在本发明过程中表征的这些表位由痤疮丙酸杆菌细菌呈现，使得它们被识别为表面可及的表位并且被针对痤疮丙酸杆菌产生的人类血清免疫球蛋白特异性结合。优选地，如在本发明过程中为了实验证明的目的还观察到的，这些表位也被针对蛋白质本身产生的动物血清抗体或被痤疮丙酸杆菌特异性结合。

3、根据本发明的一个具体方面，根据本发明表征的疫苗抗原诱导抗体，其导致至少两种痤疮丙酸杆菌mlst种系型和/或至少两种不同的痤疮丙酸杆菌cc型和/或至少两种痤疮丙酸杆菌核糖体分型的特异性结合和调理吞噬杀伤显著增加，如通过采用流式细胞术的表面结合测量和在杀细菌杀伤测定中使用针对此类疫苗抗原产生的免疫血清确定的。

4、优选地，用本发明的产品免疫后诱导的抗体的交叉反应性、尤其是交叉型反应性可以通过特异性结合并且诱导至少两种或三种遗传上不同类型的痤疮丙酸杆菌菌株的调理吞噬杀伤活性来确定。根据本发明的一个具体实施方案，交叉反应性/交叉型反应性针对至少一种i型和至少一种ii型或iii型菌株。根据本发明的又一个具体实施方案，交叉反应性/交叉型反应性针对至少一种ii型和至少一种i型或iii型菌株。根据本发明的又一个具体实施方案，交叉反应性/交叉型反应性针对至少一种iii型和至少一种i型或ii型菌株。根据本发明的又一个具体实施方案，交叉反应性/交叉型反应性针对至少一种i型、至少一种ii型和至少一种iii型菌株。

5、优选地，通过用本发明的疫苗免疫诱导的抗体的交叉反应性/交叉型反应性针对选自以下的两种或更多种痤疮丙酸杆菌菌株：如根据mlst分型方案定义的ia1型、ia2型、ib型、ic型、ii型和iii型菌株，或i-ia型、i-ib型、i-2型和ii型和iii型(lomholt和kilian2010；mcdowell等人2012；barnard等人2015；o’neill和gallo 2018；mclaughlin等人2019)。甚至更优选地，通过用本发明的疫苗免疫诱导的抗体的交叉型反应性针对两种或更多种不同的痤疮丙酸杆菌菌株，这两种或更多种不同菌株各自选自由以下组成的不同类型：如根据mlst分型方案定义的ia1型、ia2型、ib型、ic型、ii型和iii型菌株，或i-ia型、i-ib型、i-2型、ii型和iii型。

6、优选地，通过用本发明的疫苗免疫诱导的抗体的交叉反应性/交叉型反应性针对选自以下的两种或更多种痤疮丙酸杆菌菌株：各种核糖体分型，例如，如根据16s核糖体序列差异确定(fitz-gibbon等人2013；tomida等人2013)。

7、优选地，通过用本发明的疫苗免疫诱导的抗体的交叉反应性/交叉型反应性针对基于如scholz等人2014所述的单基因座(slst)的分析确定的两种或更多种种系型，包括多于140种sls型a1-l10，其记录于在线slst数据库中：http://medbac.dk/slst/pacnes(更新：2019年9月14日；st数量：142)。

8、优选地，通过用本发明的疫苗免疫诱导的抗体的交叉反应性/交叉型反应性针对至少两种不同的系统发生类型(phylogenetic type)，更优选三种，甚至更优选四种、五种或六种系统发生类型，所述系统发生类型由以下任何菌株表示：nctc737、kpa171202(dsmz，德国微生物和细胞培养物保藏中心(german collection of microorganisms and cellcultures)，德国布伦瑞克)、sk137、hl005pa1、hl005pa4、hl013pa1、hl030pa1、hl043pa1、hl053pa1、hl053pa2、hl050pa1、hl050pa2、hl060pa1、hl110pa4(bei，生物防御和新发感染研究资源库(biodefense and emerging infections research resources repository)，弗吉尼亚州马纳萨斯)、p.acn31、pv66和asn12(mcdowell等人2012)、hung.#2(匈牙利科学院生物研究中心生物化学研究所(institute of biochemistry,biological researchcentre of the hungarian academy of sciences)，塞格德)和iai 008、iai031、iai034、iai035、iai038、iai040、iai042、iai045、iai041(charitê berlin,pro-implantfoundation)。

9、优选地，如本文所述的疫苗保护对抗由痤疮丙酸杆菌侵染、感染诱导的病理病症的发展，或它可以预防或减少痤疮丙酸杆菌相关适应症的发展。保护可以通过至少两个或多个以下测试来确定：

10、a)结合痤疮丙酸杆菌表面的抗原特异性抗体的诱导；和/或

11、b)其他同源或抗原特异性抗体对痤疮丙酸杆菌的抗细菌活性的功能性抑制；和/或

12、c)针对痤疮丙酸杆菌的调理吞噬杀伤活性的诱导

13、d)由痤疮丙酸杆菌引起的生物膜形成的预防、抑制或减少

14、e)由痤疮丙酸杆菌引起的植入物或医疗装置感染的预防

15、f)由痤疮丙酸杆菌感染引起的炎症或组织伤害的减少

16、g)对人类细胞、细胞外基质组分或组织的粘附的能力的降低

17、h)细胞侵袭和细胞内存活能力的降低

18、i)逃避或与人类免疫反应竞争的能力的降低(例如，通过抑制毒力因子的功能或表达)

19、j)摄取生态位适应和生存所需的营养物和矿物质的能力的降低

20、k)痤疮丙酸杆菌诱导的组织炎症的减少

21、l)痤疮丙酸杆菌损伤后组织愈合和修复率增加。

22、优选地，将疫苗配制品重复施用于人类，优选通过至少2或3次施用或至少通过4、5或甚至更多次重复施用。优选地，疫苗可以在一个或多个治疗周期中使用，每个治疗周期涉及在例如1年的时间段内以至少1或2周的间隔至少两次或三次连续施用。优选地，治疗周期可以例如在5年或更少的时间段内至少重复1次、2次、3次或4次、甚至更多次中的任一个。

23、根据一个具体方面，疫苗被配制用于施用于人类受试者，例如儿童、青少年或成人受试者。典型地，疫苗提供在适用于涉及初免和加强免疫两者的治疗方案的配制品中，优选地其中相同的配制品适用于初免和加强施用。

24、优选地，所述配制品由与佐剂一起配制的一种或多种作为有效成分的抗原或表位组成或构成。

25、优选地，佐剂选自矿物盐、水包油乳剂、脂质体、tlr激动剂、单磷酰脂a、皂苷、磷脂或其组合。

26、优选地，疫苗被配制为适用于皮内、皮下(s.c.)、肠胃外，例如肌内(i.m.)、粘膜、透皮或外用施用。优选地，不同类型的配制品可以用于治疗相同的人类受试者，例如从全身治疗或注射开始，然后通过局部或外用施用进行长期治疗，例如通过(重复)应用疫苗贴剂。

27、优选地，每剂疫苗包含每剂0.1μg至5mg、优选0.5至1000μg、更优选1至500μg、甚至更优选5至300μg、尤其是10至200μg每种抗原。

28、优选地，抗原被提供为抗原编码dna或rna。因此，本发明进一步提供了一种人疫苗，所述人疫苗包含编码如本文所述疫苗抗原的dna或rna，优选作为mrna分子具有以下结构的mrna疫苗：5’utr-信号肽-编码抗原或表位-3’utr。在这种情况下，rna/dna疫苗剂量可以在1μg至5mg dna或rna的范围内。

29、优选地，当重复施用时，剂量可以改变，例如从较高的治疗剂量开始，然后是减少的治疗剂量。

30、与本领域当前文献/现状中的实践相反，根据本发明的疫苗和配制品可用于多种多样的痤疮丙酸杆菌相关适应症并且具有普遍适用性。在现有技术中，搜索/鉴定了假定引起特定疾病的特定菌株。例如，据信痤疮由ia1菌株引起(mclaughlin,2019)，进行性黄斑色素减少症由iii型菌株引起(barnard,2016)，产生硫肽的ib型菌株更强烈地促进前列腺癌(sayanjali等人,2016)，或在例如结节病中，抗体升高有致病作用，而不是保护作用(schupp等人,2015)。与种系型无关的致病性已最多描述在由产生更多生物膜的菌株引起的植入物相关感染的背景下，与种系型无关(achermann等人,2014；kuehnast等人,2018)。然而，根据本发明的产品可用于对抗所有种类的痤疮丙酸杆菌相关感染。

31、根据一个具体方面，本发明提供了一种用于治疗处于痤疮丙酸杆菌适应症风险或患有痤疮丙酸杆菌适应症的人类受试者的人抗痤疮丙酸杆菌疫苗，以有效量预防、治疗或改善此类疾病，优选选自寻常痤疮、角膜炎、滑膜炎痤疮脓疱病骨质增生骨炎(sapho)综合征、心内膜炎、医疗植入物生物膜感染、假体关节感染、手术伤口感染、血管移植物感染、厌氧性关节炎、心血管装置相关感染诸如人工瓣膜心内膜炎；眼部植入物感染、乳房植入物病患、坐骨神经痛、结膜炎、分流器相关和/或脊柱硬件中枢神经系统感染、分流器相关中枢神经系统感染、结节病、眼内炎骨髓炎、过敏性肺泡炎、类风湿性关节炎、感染性关节炎、慢性幼年性关节炎、慢性破坏性寡关节炎、退行性椎间盘疾病、牙齿感染、溃疡性结肠炎高热、脑脓肿、硬膜下积脓、腹膜炎、牙周炎、牙髓感染、眼内炎、角膜炎、慢性鼻窦炎、毛囊炎、角膜炎、角膜溃疡、眼内炎、前列腺炎、慢性前列腺炎、原发性胆汁性肝硬化、化脓性汗腺炎、反常性痤疮、肺脉管炎、动脉粥样硬化、前列腺癌、进行性黄斑色素减少症和聚合性痤疮。通过如本文所述的医学用途治疗的特定疾病病症是其中痤疮丙酸杆菌作为致病因子起作用的任何医院感染或炎症相关疾病。

32、本发明疫苗的这种“宽带”适用性也与brüggemann等人,1019中对当前研究目标的展望和总结形成对比：在这篇呈现了“在后基因组时代中对痤疮丙酸杆菌的研究现状的概述”的综述文章中，作者得出的结论是，仍然缺乏对潜在疾病发病机制的了解，并且为了更好地了解致病机制，更好地阐明细菌宿主相互作用的特性至关重要；由于缺乏有效的研究工具，这目前是一个挑战。他们最后提供的带回家的信息总结如下：“目前正在深入研究痤疮丙酸杆菌(和其他皮肤微生物)与人类免疫系统组分的相互作用及其结果。这些相互作用很复杂并且涉及不同的细胞类型[..]”。针对未来要解决的疗法选择，指出了目前正在开发的“新治疗策略”：“鉴于抗生素无效的威胁以及过度抗生素疗法和其他抗痤疮治疗的严重副作用，替代策略是优选的。目前正在开发用于皮肤的益生菌[..]”。引人注目地，此文章中没有提及疫苗是这些“有前途的未来策略”之一，也没有任何暗示此类痤疮丙酸杆菌疫苗如何起作用或它们是如何设计的。

33、优选地，所述疫苗用于诱导免疫以预防和/或改善痤疮丙酸杆菌感染和/或减轻此类感染的至少一种症状和/或增强另一剂疫苗的功效。所述疫苗可以方便地用于预防、改善或以其他方式治疗痤疮丙酸杆菌适应症。在引入受试者后，所述疫苗能够引发免疫反应，包括产生抗体和/或细胞因子和/或激活细胞毒性t细胞、b细胞、抗原呈现细胞、辅助t细胞、树突细胞和/或其他细胞反应。

34、优选地，受试者接受任何预防或疗法的治疗。

35、优选地，受试者是患有其中涉及来自i型、ii型或iii型痤疮丙酸杆菌中的任一种的菌株或i型、ii型和i型中的至少两种种系型或至少两种痤疮丙酸杆菌核糖体分型的组合作为致病因子的皮肤或其他受影响的器官或组织病症的患者，或可能易感于任何痤疮丙酸杆菌菌株感染的健康个体。

36、优选地，本发明提供了一种治疗受试者的任何上述适应症或更一般地任何痤疮丙酸杆菌适应症的方法，其中将有效量的疫苗抗原施用于受试者。

37、优选地，将抗原以在每种抗原0.1μg至5mg的范围内的有效量施用至少一次。优选地，所述疫苗用于重复施用于受试者，优选至少3次施用，或至少4、5或甚至更多次重复施用。优选地，疫苗可以在一个或多个治疗周期中使用，每个治疗周期涉及在例如1年的时间段内以至少1或2周的间隔至少两次或三次连续施用。优选地，治疗周期可以例如在5年或更少的时间段内至少重复1次、2次、3次或4次、甚至更多次中的任一个。

38、根据又一个具体的方面，本发明提供了一种通过以下方式生产如本文所述疫苗的方法：将如本文所述抗原或编码所述抗原的dna或rna与人药学上可接受的载体混合和/或缀合，从而获得人佐剂配制品。

39、抗原也可以作为抗原编码rna或dna配制品递送，优选作为mrna分子具有以下结构的mrna疫苗：5’utr-信号肽-编码抗原或表位-3’utr(或例如，可替代地还提供复制酶)；此类配制品已用于人体临床试验中的局部注射和全身注射。

40、4本发明的总体描述

41、在痤疮丙酸杆菌相关病理领域中的当前挑战是在关于以下的设计和详细描述方面定义特定的预防性或免疫治疗性产品：应包括多少以及哪些抗原或抗原表位，它们应如何组合和产生，免疫反应应针对哪些抗原表位以及针对哪些痤疮丙酸杆菌菌株以确保免疫效应细胞对细菌的希望作用，以及应如何制造和施用产品以在易感宿主中提供最佳保护和/或治疗作用。

42、本发明通过提供疫苗材料中诱导针对痤疮丙酸杆菌的保护性反应所需的抗原和抗原表位的确切组成来提供这些问题的解决方案，并且本发明还提供了关于应该如何生产和施用产品的说明。另外，本发明为免疫治疗和预防方法应针对哪些痤疮丙酸杆菌菌株的问题提供了解决方案：这些发现结果还导致关于最佳治疗策略和产品的不同结论，使疫苗具有确保比现有技术中目前建议的覆盖率广泛得多的菌株覆盖率的抗原组成，并且为此领域的当前知识现状带来另一水平的创新。

43、尤其地，疫苗和基于免疫的疗法的发现受到了研究宿主免疫反应中的困难的阻碍，所述免疫反应受中枢免疫和皮肤免疫两者的调节并且可以由定植和感染两者诱导和塑造。

44、主动疫苗接种可以基于单价或多价亚单位疫苗或全细胞疫苗。在全细胞疫苗的情况下，细菌细胞通过使用各种化学试剂固定而灭活，或通过加热或细胞裂解被杀死，并且然后反复口服或皮下应用。与亚单位疫苗相比，全疫苗含有表征差的许多不同蛋白质的混合物，所述蛋白质包含在微生物细胞壁内或被分泌出来，其中只有一些可能有助于保护；然而，它们的功效取决于具有致病潜力的所有不同菌株中天然表位表达和保留的水平。尤其是使用自体细菌菌株制备的自体疫苗另外增加了免疫反应质量的不确定性水平，因为化学处理对天然结构和表位的影响在从不同个体分离的菌株之间可能存在很大差异，并且对特定自体细菌菌株的预先存在的免疫水平在不同患者中可能有很大差异。由于所有这些原因，用全细胞疫苗免疫的效率在不同受试者中可能有很大差异，并且加上安全风险的增加，全细胞疫苗不再是优选的治疗选择并且在许多西方社会已被禁止使用。虽然如此，但使用包括痤疮丙酸杆菌在内的几种共生机会性病原体的自体细菌菌株进行自体疫苗接种的有益作用的报道(zaluga 1998；lovecková和havlíková2002)以及允许对大量细菌菌株进行快速测序的最新技术进步已经导致在痤疮丙酸杆菌相关疾病的预防和免疫疗法领域中研究的复兴。

45、在过去的20年中已投入大量精力来鉴定可用作疫苗的抗原。不同的研究小组已鉴定出许多推定痤疮丙酸杆菌毒力因子，并且已提出关于痤疮发病机制的各种假设。然而，由于痤疮丙酸杆菌表达和分泌数百种不同的蛋白质，其中许多被提出是推定的毒性因子，并且人类被每个人特有的特定特征的不同痤疮丙酸杆菌菌株定殖，没有提供具体的说明或证据来说明保护性预防或治疗产品应该是什么样子，以使其对由痤疮丙酸杆菌引起的疾病具有保护作用，并且有潜力为较大比例的易感个体提供治疗益处。因此，基于本文获得的数据，本发明能够鉴定和说明，此领域中当前面临的挑战是根据以下来定义产品描述：哪些抗原可能是最佳选择，疫苗组合中是否需要一种或多种抗原，疫苗应靶向哪些痤疮丙酸杆菌菌株，免疫反应应针对哪些抗原表位，以及应如何生产和施用产品以提供最佳保护性或治疗性免疫调节作用，以提供针对高百分比的具有毒性潜力的菌株的保护并且减少逃逸突变体的机率，含有单抗原的疫苗更有可能发生这种情况。此领域的现状已在最近的出版物中进行了描述，所述出版物综述了关于痤疮丙酸杆菌在寻常痤疮和其他病理病症在的作用的知识，并且强调了在发现保护性治疗产品方面的挑战(o’neill和gallo 2018；brüggemann2019；mclaughlin等人2019)。这些挑战目前正在导致从针对痤疮丙酸杆菌诱导感染开发广泛交叉反应性疫苗的考虑转变为设计应仅针对一种特定种系型的产品，例如在寻常痤疮的情况下，种系型ia1被认为是主要致病因素。开发基于疫苗的策略的困难导致此领域的新方向侧重于非免疫剂，诸如益生菌、光疗法和应支持被认为无害的共生菌株生长的其他方法。

46、作为本专利申请主题的发明的现有技术和最相关的背景可以概括如下：

47、在2001年和2003年，公开了由corixa corporation申请的两项专利申请，其披露了使用从人类供体中分离的抗体和t细胞对痤疮丙酸杆菌噬菌体展示文库进行血清学筛选的结果(wo 2001/81581a2和wo 2003/033515 a1)。wo 2001/81581 a2披露了一系列痤疮丙酸杆菌蛋白及其免疫原性片段。wo 2003/033515 a1披露了针对痤疮丙酸杆菌的抗原组合物和疫苗。这两个申请含有大量多肽序列和免疫原性片段，其中包括可用作免疫治疗或诊断产品的各种蛋白质。与人类血清反应的候选抗原被指定为免疫原性痤疮丙酸杆菌蛋白并且总结在wo 2001/81581 a2的表5中。潜在的抗原候选物被认为是基于生物信息学分析并且与由其他微生物病原体表达的蛋白质的同源性预测具有可能与宿主防御相关的生物学功能的那些。其中尤其包括许多不同的转移酶、肠毒素、脂蛋白、透性酶、蛋白酶、膜蛋白、分泌蛋白、粘附素、转运蛋白、溶血素、青霉素结合蛋白、唾液酸酶、铁载体(siderophore)、锌、铁和锰结合蛋白(表6，wo 2001/81581 a2)。本技术中公开的许多抗原后来也被其他研究小组鉴定和更详细地研究，然而，只有少数已在体外和体内评估了它们作为潜在的预防或治疗疫苗候选物的适用性(nakatsuji等人2008；liu等人2011；wang等人2018)。最有希望的抗原候选物包括唾液酸酶、脂肪酶和camp因子2，它们受us 9,340,769 b2(申请为us 2011/0243960 a1和wo 2010/065735 a2)保护。

48、在2006年，lodes等人更详细地表征了专利申请wo 2001/81581 a2和wo 2003/033515 a1中披露的四种免疫反应性痤疮丙酸杆菌蛋白。两种蛋白质与白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheria)htaa基因(pa-21693和pa-4687)有关；另外两种(pa-5541和pa-25957)与链球菌m样蛋白具有一些相似性并且发现彼此相似(68％)。基于生物信息学分析，作者预测pa-21693在不同的临床分离株中是较保守的，并且发现其表达取决于铁的可利用性。然而，发现其他三种蛋白质由不同菌株显著更大差异性地表达，因为在dna序列中鉴定出许多移码和突变。此外，在被认为能够表达蛋白质的菌株中，预测了细胞位置的差异，使得所述蛋白质可以位于细胞表面上或被分泌。表明分泌依赖于特定细胞壁结合基序的存在，所述基序称为lp(x)tg结构域，其中x可以是任何氨基酸。生物信息学和免疫印迹分析引导作者得出以下结论：在不同的痤疮丙酸杆菌分离株中，所鉴定的蛋白质具有相变异(表达和不表达)以及抗原变异(相同蛋白质的不同抗原变体的表达)两者的潜力。另外，位于蛋白质pa-5541和pa-25957的c末端的脯氨酸-苏氨酸(pt)重复区域预测具有高度抗原性。通过分析具有缺乏pt重复的n末端蛋白片段(nh2-25957)的人类抗体与含有pt重复的c末端片段(pt-25957)相比的反应性，作者得出以下结论：痤疮阴性血清(定义为“有轻度痤疮史或无痤疮史”)中的抗体与含有pt重复的c末端片段特异性反应，并且这种反应是igg2/3型的，而用四种测试的igg亚类中的任一种检测到针对n末端片段非常小的反应性或没有反应性。与这些结论相反，作者发现来自痤疮阳性血清(定义为“有中度至重度痤疮史”)的抗体针对蛋白质的n末端部分，并且它们是igg1/4亚型的。在pa-21693和pa-4687中鉴定的亲水重复区域也被预测为具有高度抗原性，然而，没有研究来自痤疮阴性和阳性受试者的人类抗体对这些区域的反应性。抗体类型的差异以及pa-25957和pa-5541的不同片段的结合表明可能是易患痤疮个体中免疫反应失调的原因。然而，作者没有提供关于痤疮患者是否可以有效进行疫苗接种或如何治疗痤疮患者以便诱导更受调节的免疫反应的说明，他们也没有建议疫苗中应包含一种还是多种研究的蛋白质或序列区域(表位)以及哪些蛋白质或序列区域(表位)(只有c末端pt重复区被提及为在健康个体中具有抗原性并且对于健康皮肤是潜在相关的)。另外，抗原pa-25957、pa-5541和pa-4687的表达被认为是高度可变的，然而，没有提供说明应如何克服预测的抗原变异和表达变异，以确保在定植不同个体的不同痤疮丙酸杆菌菌株和基因型中疫苗的保护性，应靶向这些菌株中的哪些以及如何进行，以确保针对疾病相关菌株和功能表位的作用。与特定抗原组成、表位选择、产品设计和应用有关的所有问题都保持开放，并且作者建议应通过未来的研究对其进行研究。因此，尽管作者从他们的研究中得出以下结论：有关四种蛋白质pa-21693、pa-4687、pa-5541和pa-25957的发现结果在选择治疗疫苗的抗原以及还有选自所述抗原的可驱动所希望的免疫反应的重要表位的两个方面也可以是重要的，提出四种蛋白质都不是合适的疫苗抗原。恰恰相反，作者得出的结论是，在患有严重炎性痤疮的个体中可能发生对这些不同表达的痤疮丙酸杆菌抗原的免疫反应失调，并且在针对治疗疫苗的这种抗原选择的过程中，这种可能性仍有待研究。

49、相比于这些非常早期的纯粹基于初级序列、(粗略)生物信息学、sds-page中对变性蛋白的检测和仅测试四种菌株(两种ia型和两种ii型)提交专利申请的尝试，根据本发明的策略是基于现实生活的方法以及基于在大量不同的痤疮丙酸杆菌菌株和种系型表面上抗体对特定抗原的实际结合和识别以及抗原特异性抗体实际通过人类免疫系统实现细菌杀伤的能力的定量测量。因此，采用了使用针对许多不同抗原产生的抗体的流式细胞术，并且将这些抗体与活痤疮丙酸杆菌一起孵育以测试哪些抗原以及序列的哪些部分(肽和片段)暴露在表面上并且可及于活细菌表面上的抗体；因此，根据本发明的策略提供了“现实生活(real life)”证据，表明这些抗原对于在痤疮丙酸杆菌细胞表面上的抗体结合是可及的，并且所述抗体具有高度交叉(型)反应性且能够提供针对多于100种测试菌株中高百分比的测试菌株的保护。这非常不同于检测在噬菌体库筛选期间由大肠杆菌(e.coli)细菌表达的肽，其中无论其在痤疮丙酸杆菌活细菌上的抗体的实际位置和可及性，都将检测到被抗体识别的任何肽。另外，在抗体依赖性调理吞噬杀伤测定中测试由这些抗原产生的免疫血清，所述测定给出了对抗体结合特定表面暴露表位的功能免疫结果的“现实生活”评估(尤其是在人类情况下，当疫苗被注射到患者的皮肤或肌肉中时，其将被抗原呈现细胞接取，所述抗原呈现细胞进而应处理所述抗原并且刺激t细胞和b细胞，以增加针对特定片段/序列区域内的表位的调理吞噬杀伤抗体的产生；以有助于进一步调理和作用于细菌，所述细菌破坏皮肤屏障，导致疾病或感染的发病机制)。尽管许多抗原具有免疫原性(用作疫苗时能够产生抗体)，但这些抗原产生免疫相关抗体的能力存在显著差异，所述免疫相关抗体能够调理细菌并且导致痤疮丙酸杆菌的吞噬性杀伤。wo 2011/149099 a1披露了具有14和13个氨基酸长度的两种短抗原肽，称为“pepa”和“pepd”，其衍生自genbank/embl/ddbj登录号yp_056445的氨基酸序列；以及含有这些肽或编码这些肽的核苷酸的疫苗。

50、2010年，holland等人试图通过分析在厌氧培养过程中由痤疮丙酸杆菌分泌的蛋白质来鉴定痤疮相关毒力因子。在此研究中鉴定出许多推定的毒力相关因子：发现蛋白质ppa1939是所有分离株最强烈分泌的，ppa0816被菌株ib、ii和iii分泌并且表明是可能有助于粘附和毒力的表面蛋白。还鉴定出其他推定的粘附素，例如ppa1715，其含有二肽脯氨酸-苏氨酸(pt)重复，如针对lodes等人(2006)和holland等人(2010)的ppa2127和ppa2210所述，然而仅检测到由ia型菌株266分泌的ppa2127，而ib型菌株(kpa171202和p6)由于dna序列内的突变和移码而不表达这种蛋白质。提出了另外的发病机理相关因子是ppa2175(假设蛋白，可能是内溶性肽聚糖转糖基酶(endolytic peptidoglycan transglycosylase)rlpa)和ppa0687(camp2，由五个成员组成的camp因子超级家族的成员)。作者建议，未来的研究应侧重于对分泌的毒力因子及其致病意义的更详细研究。根据作者，对分泌因子的功能的表征将需要开发适当的工具(例如，产生痤疮丙酸杆菌敲除突变体的诱变方法)并且阐明不同痤疮丙酸杆菌临床分离株中观察到的毒力差异的分子基础。因此，尽管建议许多不同的蛋白质潜在地充当毒力因子，但没有给出关于特定蛋白质选择或其作为预防或治疗痤疮丙酸杆菌相关病理病症的产品的特定用途的特定说明。

51、2011年，mcdowell等人试图通过采用基因分型和抗体标记方法基于疮丙酸杆菌菌株的毒力潜力将其分类。作者产生了两种不同的单克隆抗体，作为其中一种的qubpa1发现结合先前由lodes等人(2006)鉴定的两种抗原、pa5541/ppa2210和pa-25957/ppa2127(mcdowell等人2011)。通过研究不同痤疮丙酸杆菌菌株上的qubpa1单克隆抗体的标记类型，mcdowell等人证明所鉴定的抗原始终由主要从痤疮患者中分离的ia型菌株表达。他们表示他们的发现结果与holland等人的发现结果相似，holland等人检测到由ia型菌株而非ii型和iii型菌株分泌的ppa2127(holland等人2010)。mcdowell等人(2011)提出了ia型菌株与痤疮的发病机制相关，并且ib型、ii型和iii型菌株与其他类型的感染相关。他们还证实了lodes等人(2006)的发现结果，即抗原pa5541/ppa2210和pa-25957/ppa2127易于发生相变异、抗原变异和分泌，并且基于它们结合硫酸皮肤素的能力，作者将这两种蛋白质命名为硫酸皮肤素-粘附素：dsa1(pa-25957/ppa2127)和dsa2(pa5541/ppa2210)。此研究侧重于表达各种推定毒力因子(还发现由ia菌株产生其他毒力因子，例如神经氨酸苷酶和脂肪酶geha)的菌株的临床意义以及使用这些发现结果作为不同痤疮丙酸杆菌菌株分类的支持工具。除了被提出是重要的毒力因子外，作者没有就基于这些或任何其他描述的抗原的可能预防性或治疗性干预措施提供建议。通过免疫荧光显微术(ifm)进行单克隆抗体(mab)分型，如mcdowell等人,2005(mcdowell等人,j.clin.microbiol.43(2005),326-334)所述。mcdowell(2012)通过用不同痤疮丙酸杆菌菌株的杀死全细胞免疫balb/c小鼠产生单克隆抗体。通过有限稀释克隆产生痤疮丙酸杆菌特异性mab的杂交瘤细胞系(mcdowell(2005))。检查分离株与小鼠单克隆抗体qubpa1和qubpa2的反应性，所述小鼠单克隆抗体分别靶向ia1型和ii型内的菌株。这些单克隆抗体用于标记痤疮丙酸杆菌菌株以进行ifm，并且ifm用于系统发生结构化(ia型和ii型菌株的鉴定)。检查一系列基因，尤其是那些编码细胞表面相关抗原的基因，所述细胞表面相关抗原具有很强的辨别能力(mcdowell(2011))。他们指出，他们先前使用的单克隆抗体qubpa1是ia型特异性的(第10页)。此外，mcdowell(2011)使用了仅对痤疮丙酸杆菌菌株ia1具有特异性的单克隆抗体qubpa1，在免疫亲和柱上进行纯化以及用于如第2000页指示的免疫荧光显微术的标记的目的：用qubpa1对i型菌株的ifm分析揭示了细胞表面上的极性和隔膜标记(mcdowell等人,2005)。[…]对于ia型菌株，用qubpa1的ifm实际上提供了表达的菌株内相变异的证据，而不是结合细胞表面和诱导针对不同种系型的杀细菌作用的能力。因此，此单克隆抗体不建议用于鉴定关键的免疫原性和免疫相关表位而是用于鉴定抗原的性质(即，相变异)以及区分痤疮丙酸杆菌基因型的研究工具。除此之外，具有相/抗原变异能力和增强免疫原性的细胞表面粘附素的表达以及有助于过度生长和宿主组织组分降解的特定毒力因子的产生被用作ia型菌株与痤疮的关联的基本原理。然而，本发明旨在提供在对抗痤疮丙酸杆菌相关疾病和感染方面具有广泛的交叉反应性(即，交叉型反应性，并且不限于ia1型)和治疗益处的疫苗，而不是鉴定用于标记特定痤疮丙酸杆菌种系型的研究工具。

52、此外，mclaughlin(2019)指出“用单克隆抗体(mab)对皮肤活检样品进行ifm分析显示痤疮受试者和对照受试者两者的皮脂腺中都存在ia型和ii型两者[…]”。用不识别dsa1/dsa2的不同单克隆抗体(即，qubpa2(mcdowell等人(2011)))检测ii型菌株。mclaughlin(2019)在第15页指出：“使用随后揭示出靶向细胞表面上的dsa1和dsa2抗原的mab(qubpa1)，只有代表ia1型、ia2型以及还有ic型的菌株具有免疫反应性，显示出极性和隔膜标记两者。[…]我们可以推测，ia型经由dsa免疫原性蛋白调节它们与宿主免疫系统的相互作用的潜力可能对痤疮的复发性质很重要”。因此，mclaughlin(2019)用术语“免疫反应性”指代单克隆抗体对dsa1和dsa2的极性和隔膜标记(septal labelling)。此外，他们“推测”痤疮复发的原因，并且他们没有提到免疫疗法作为结论，更不用说如何设计治疗痤疮的产品的指示或动机。此外，mclaughlin(2019)的文章推测了在图12和表2中总结的长列表的抗原中各种毒力因子与痤疮相关菌株的致病意义的关联；并且谨慎地建议疫苗应只靶向ia1种系型菌株。没有关于如何制造此类疫苗的建议，尤其是没有关于如何制造超出靶向ia1菌株的疫苗的建议。mclaughlin(2019)揭示了kpa171202菌株与基于推定组织降解因子(包括溶血、共溶血christie-atkins-munch-peterson(camp)因子、唾液酸酶、鞘糖脂内切糖苷酶、脂肪酶、卟啉和透明质酸裂解酶(hyl))的基因以及具有炎症潜力的细胞壁/细胞被膜相关蛋白和含有多个脯氨酸-苏氨酸重复(ptr)的蛋白质的基因的其他菌株相比的致病潜力。另一种如何定义推定毒力因子的方法是将kpa171202的转录组与ia1型菌株266(胸膜肺感染)进行比较，并且在对数中期鉴定119种常见基因的差异性表达。这些包括三酰基甘油脂肪酶鞘糖脂内切糖苷酶、dsa1和htaa/p071的基因。然而，为什么这些基因产物可以代表推定毒力因子的结论仅基于以下事实：这些基因在266中上调，这没有明确指示疫苗产品、抗原的选择以及使用哪些抗原以及如何使其对于人类应用可行。此外，毒力因子仅表明表达此类基因的菌株更具毒力，但它根本没有表明此类因子在疫苗接种背景中的适用性。因此，与本发明相比，现有技术也指向了不同的方向；形成鲜明对比，mclaughlin等人的“疫苗开发”部分因此仅将camp因子2称为潜在的疫苗靶标。

53、brzuszkiewicz等人(2011)进一步研究了不同毒力相关因子的表达，brzuszkiewicz等人对不同毒力相关基因的活性提供了额外的见解，除此之外，他们还提到了geha脂肪酶(ppa2105)；多不饱和脂肪酸异构酶pai(ppa1039)；由lodes等人(2006)描述的三种蛋白质：pa-25957/ppa2127、pa5541/ppa2210和铁获取蛋白htaa(pa-4687/ppa0786)。与mcdowell等人(2011)和lodes等人(2006)类似，brzuszkiewicz等人(2011)还假设菌株的毒力潜力差异可能是由于不同种系型的毒力因子表达的差异，并且他们提出除了这些，其他毒力因子可能也很重要。他们还提出，不同痤疮丙酸杆菌菌株的致病潜力不仅由种系型特异性基因组含量确定，还由可变基因表达确定。作者提供了关于炎性痤疮病变可能如何发展、哪些菌株可能重要的潜在情景，但没有就疫苗材料的选择和疾病治疗或预防的产品的设计提出任何具体说明。与其他人一样，他们建议未来的研究精力应投入到阐明导致菌株差异化行为的因子以及导致痤疮丙酸杆菌诱导的炎症的内在机制。他们假设对痤疮丙酸杆菌具有不平衡免疫反应的宿主可能容易受到具有较高毒力潜力的菌株的存在的影响，并且来自系统发生组i-ia的菌株表达较高水平的粘附素和其他毒力因子，更有可能在易感宿主中诱导病理症状。also mayslich等人(microorg.9(2021),303)综述了关于毒力因子和痤疮丙酸杆菌感染的实际研究现状。认识到，痤疮丙酸杆菌-作为一种共生细菌-仅具有弱的免疫原性并且因此通常在宿主皮肤上具有耐受性。据推测，当它在其表面表达不同的抗原组分时，它仅作为机会性病原体参与致病环境，这可能导致皮肤和许多其他内脏器官中的强烈炎症反应。mayslich等人综述了各种毒力因子(尤其是camp2)，但(在他们对现有技术的总结和结论中)得出了两个剩余的“未解决的主要问题”：首先，特定的痤疮丙酸杆菌类型是否可能响应于与特定毒力因子表达相关的环境变化而变得更具致病性；并且其次，痤疮丙酸杆菌与皮肤微生物群的相互作用如何影响其致病性。这两个问题以及当然解决这种致病发展的方法仍然没有答案。2011年，liu等人发表了一项研究，其中他们使用了针对camp 2的单克隆抗体，camp 2是先前由corixa在血清学筛选中并且后来由holland等人(2010)通过分泌蛋白质组的蛋白质组学鉴定的抗原之一。这种蛋白质也被鉴定为由其他细菌分泌的毒力因子，据报道具有作为溶血因子和成孔毒素的功能。表明单克隆抗体对camp 2抗原的作用对于中和分泌的camp 2毒力因子以减弱其毒力是重要的。作者特别提出，通过靶向分泌的毒力因子减弱痤疮丙酸杆菌毒力应该是痤疮免疫疗法的目标，而不是靶向位于痤疮丙酸杆菌细胞表面的蛋白质，并且用这种新方法，他们放弃了先前选择的疫苗候选物痤疮丙酸杆菌唾液酸酶，痤疮丙酸杆菌唾液酸酶是一种细胞表面蛋白。事实上，所有最近的综述作者都得出以下结论：新的有前途的治疗方法应侧重于“调节皮肤上痤疮丙酸杆菌菌株的群体，而不会引起负面反应[..]”，其目标是设计为不直接作用于痤疮丙酸杆菌并且不干扰微生物组的产品。因此，引入共生的“健康”的痤疮丙酸杆菌菌株被认为好于作用于“致病”菌株，如例如疫苗方法将进行(参见例如，o’neill和gallo 2018；brüggemann等人,2019；cong等人,2019；mayslich等人,2021；petronelli,2021)。总之，所有这些最近的综述表明，新的治疗方法通过回避疫苗方法(大约20年前被认为是有希望的)或对其提出极端谨慎/警告(“不引起负面反应”；mayslich等人,2021)来解决痤疮丙酸杆菌相关感染的病理。

54、2014年，bek-thomsen等人试图通过对从健康个体和受痤疮影响的个体中提取的皮脂腺毛囊管丝进行蛋白质组学分析来研究痤疮形成所涉及的病理过程(bek-thomsen等人2014)。他们寻找与易患痤疮的皮肤毛孔相比可能在健康皮肤毛孔中差异性表达的蛋白质，然而他们无法鉴定任何毒力因子差异性表达的证据，而是得出以下结论：健康皮肤毛孔和受痤疮影响的皮肤毛孔都含有相同的蛋白质组成。在受痤疮影响的毛囊样品和健康的毛囊样品两者中鉴定出的最丰富的痤疮丙酸杆菌蛋白是硫酸皮肤素粘附素dsa1(pa-25957/ppa2127)和dsa2(pa5541/ppa2210)、camp因子1和2、以及未表征的脂肪酶ppa1796。他们认为重要的其他蛋白质是髓过氧化物酶、乳转铁蛋白、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂和波形蛋白。与mcdowell等人(2011)相反，他们得出了以下结论：脂肪酶geha(甘油酯水解酶a，ppa2105)可能不是重要的毒力因子，因为它仅在小百分比的健康皮肤样品中被发现并且在所有受痤疮影响的皮肤样品中均未被发现。相反，作者表示新型未表征的脂肪酶ppa1796在体内更重要，并且他们为这种潜在的毒力因子提出了一个新的基因名称gehb。发现痤疮中最重要的生物学过程是“对细菌的反应”，这是基于对已知参与免疫反应、组织重塑和愈合的高水平人宿主蛋白的鉴定得出的结论。另外，作者得出以下结论：健康的皮脂腺毛囊和受痤疮影响的皮脂腺毛囊都被相同的菌株定植，基于ib型、ii型和iii型不表达的两种粘附素dsa1和dsa2的高表达水平表明所述菌株是ia型。另外，他们表示ia型菌株之间的毒力潜力可能存在一些重要差异，并且未来的研究应对此进行研究。尽管此研究呈现了与健康皮肤相比痤疮中毛囊皮脂腺毛囊的蛋白质组学含量的潜在感兴趣数据，但作者承认所述研究存在许多局限性，使得难以得出更具体的结论，并且他们没有提供有关如何使用此知识来开发任何特定的痤疮治疗产品的说明。相反，他们假设某些有毒力的痤疮丙酸杆菌菌株可能利用此研究中鉴定的特定人宿主分子(诸如波形蛋白)的存在来侵袭皮肤细胞并且从而诱导炎症，并且未来的研究应针对的是鉴定毛囊皮脂腺管丝中波形蛋白表达的起源。

55、2015年，achermann等人通过研究一种特定痤疮丙酸杆菌菌株在生物膜感染期间体内产生的痤疮丙酸杆菌蛋白并且通过测试动物血清以了解针对通过二维电泳分离的痤疮丙酸杆菌细胞壁和膜相关级分中发现的蛋白质的抗体的存在，寻找潜在的疫苗候选物。他们鉴定出作为潜在的痤疮丙酸杆菌疫苗候选物提出的23种免疫原性蛋白。其中，提出了最有希望的疫苗候选物是由登录号g7u8y4标识的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gadph)，与holland等人(2010)和bek-thomsen等人(2014)先前鉴定为ppa0816的蛋白质相同。abc转运蛋白(d4hah2)特别重要；苹果酸脱氢酶(q6a6z5)、dnak伴侣蛋白(w4tzs5)、甲基丙二酰辅酶a变位酶(e4d8y8)和几种其他蛋白质也被提及属于最佳候选物。在变性条件下分离并且通过蛋白质印迹分析的细胞级分中蛋白质的检测并不提供任何证据表明这些蛋白质暴露在细菌细胞表面并且对于抗体结合是可及的。也没有测试单抗原作为疫苗材料诱导既不针对此研究中使用的痤疮丙酸杆菌菌株也不针对来自许多其他已知痤疮丙酸杆菌遗传类型的任何其他菌株的抗原特异性和功能性抗体的能力。也没有测试这些抗原在人宿主中是否具有免疫原性以及是否可被人类抗体检测到。尽管如此，但作者提出应该进行进一步研究，以找出这些候选物在预防慢性痤疮丙酸杆菌生物膜介导的感染或用于诊断测试方面的潜力。

56、与鉴定导致痤疮丙酸杆菌相关疾病的发病机制的因子的努力平行地，此领域中的新颖技术发展引入了对人皮肤上整个微生物群体的更复杂研究，并且尝试将痤疮丙酸杆菌菌株另外细分为更大或更小毒力的并且鉴定健康相关的或真实的共生菌株。

57、基于多基因座基因测序的系统发生研究以及来自人类微生物组计划(humanmicrobiome project，hmp)的分离株的全基因组分析为痤疮丙酸杆菌的遗传群体结构提供了有价值的见解。多基因座序列分型(multi locus sequence typing，mlst)生成不同的序列，所述序列定义为不同的等位基因，然后将其用于生成每个痤疮丙酸杆菌分离株的序列类型(st)。已经开发出两种不同的mlst分型方案，所述方案将痤疮丙酸杆菌分为密切相关的簇ia1、ia2、ib、ic、ii和iii(mcdowell等人2012)或i-1a、i-1b、i-2、ii和iii(lomholt和kilian 2010)。

58、最近的基因组研究导致基于所有已知痤疮丙酸杆菌菌株的全基因组测序鉴定出另外的细分，这导致单基因座序列分型(slst)方案，所述方案尤其有助于鉴定混合微生物群落中的痤疮丙酸杆菌st多样性(scholz等人2014)。基于16s rrna谱分析的另一种单基因座方法已被用于研究痤疮丙酸杆菌在痤疮和其他痤疮丙酸杆菌相关病理中的致病作用。已提出特定的痤疮丙酸杆菌菌株与痤疮相关，并且其他一些菌株与健康皮肤相关或参与其他类型的感染(fitz-gibbon等人2013；o’neill和gallo 2018；mclaughlin等人2019)。

59、尽管这些研究大多依赖于对从不同个体分离的菌株的分析并且存在与皮肤采样和分析方法有关的局限性，但他们为后续研究提供了方向并且影响了此领域的知识现状。这些发展已将研究精力导向鉴定和分析由被认为有毒力的选定痤疮丙酸杆菌遗传类型表达的蛋白质或通过分析在不同类型临床材料中发现的蛋白质。

60、继关于特定核糖体分型在痤疮的发病机制中的重要性新颖发现之后，yu等人(2015；2016)采用蛋白质组学分析来分析痤疮丙酸杆菌菌株的不同蛋白质表达，所述痤疮丙酸杆菌菌株根据特定核糖体分型进行分类，被认为与痤疮或健康皮肤相关。这些作者发现，几种蛋白质的表达在不同的核糖体分型中是不同的，并且由于这些核糖体分型先前与疾病与健康有关并且诱导人体细胞不同量的细胞因子分泌，因此作者提出将这些蛋白质作为潜在的疫苗候选物进行研究。尤其受到关注的是对应于gi 50843388(ppa1939)、gi50843565(pa-25957)、gi 50843218(ppa1758)和其他几种功能未知的蛋白质。作者还提出，疫苗候选物的寻找不应针对寻找诱导抗体的抗原，而是寻找诱导强烈treg细胞反应的那些抗原。因此，他们偏离了lodes等人和其他人的提议，抗原候选物应是抗原性的并且与人类抗体反应性的。此方向是基于以下假设提出的：痤疮丙酸杆菌是一种引起炎症的共生细菌，并且最佳疫苗抗原的作用应减少适应性免疫反应的激活，而不是增强它(yu等人2015)。另外，作者由于以下发现结果将pa-5541(gi 50843645)从潜在疫苗候选物列表中排除：发现它仅由与痤疮相关的菌株或具有中性意义的菌株表达，而不由与健康相关的菌株表达(iirt6)(yu等人2016)。总之，这些研究中披露的许多蛋白质显著也被其他人鉴定过，并且作者没有就疫苗组成和产品设计提供解决方案或具体建议，而只是提出了在最佳疫苗的发现方面以及在研究疾病发病机制方面的未来研究方向。

61、2016年的其他出版物呈现了与其他人先前鉴定的一些蛋白质相关的研究结果：ppa1939(allhorn等人2016)和pa-25957(grange等人2017)。这两种蛋白基于其推定的另外生物学功能而被发现是引起兴趣的：ppa1939被提出与血红素结合和抗氧化能力有关，并且pa-25957表明在纤维蛋白原结合中起作用。另外，基于pa-25957与纤维蛋白原的相互作用以及表达限于与特定疾病相关的痤疮丙酸杆菌种系型，其毒力潜力得到了另外的支持。这些作者并没有提出这种蛋白质如何用作疫苗产品，而只是假设其作为毒力因子的作用，其除了结合硫酸皮质素外，还可以通过在毛囊内与纤维蛋白原接触形成“团块”来发挥作用。他们还提出，未来的研究应侧重于开发测试不同蛋白片段结合纤维蛋白原的能力的工具，并且所述蛋白质可能在不同菌株表面的分泌和表达水平上显示出显著的差异性，这应通过未来的研究来研究以便更好地了解其潜在意义。

62、最近，camp 2免疫治疗产品的开发已从单克隆抗体转向治疗性疫苗，所述疫苗的作用应诱导降低痤疮丙酸杆菌细胞毒性的抗体并且防止角质形成细胞和吞噬细胞释放细胞因子，从而起到抵抗炎症的作用(wang等人2018)。尤其是痤疮丙酸杆菌对吞噬细胞存活的负面影响已被呈现为camp 2毒力的重要证据，并且这支持了由camp 2疫苗诱导的免疫反应的有益作用的论证。此研究的局限性在于，未测试在痤疮丙酸杆菌的存在下camp 2抗体对吞噬细胞活力的影响，并且在同一测定中与抗体对其他抗原候选物和更大范围痤疮丙酸杆菌菌株的影响进行比较，使得难以评估这些发现结果的意义。

63、由于关于不同痤疮丙酸杆菌菌株在痤疮发病机制中的重要性的假设不断演变和变化、作为人皮肤微生物组的一部分的其他微生物的潜在作用以及人类对细菌的免疫反应的功能意义尚未解决的争议，此领域中关于最佳疫苗候选物的困惑仍在继续。最近的一项综述表明在选择各种疫苗接种方法的抗原候选物时要谨慎，其中强调了仍不清楚哪些痤疮丙酸杆菌菌株是有毒力的并且应被疫苗靶向，并且仍不清楚痤疮的严重程度是否是由患者的基本先天免疫状况或痤疮丙酸杆菌的毒力水平驱使的，并且在设计免疫疗法方案时并且尤其是在决定靶抗原的选择时，应考虑到这一点(contassot 2018)。作者推理出，对分泌毒力因子的特异性抑制可以限制不希望的靶向非致病性细菌的风险，并且克服可能的抗性细菌选择。更重要的是，作者建议，基于表面抗原的疫苗应具有高度特异性，以避免“脱靶”效应和对可能有益于宿主的痤疮丙酸杆菌菌株产生活性。然而，如果痤疮的严重程度是由患者的先天免疫状况而不是由特定的毒力菌株引起的，那么这将对免疫治疗方法产生影响并且尤其是对针对疫苗所选的抗原的类型产生影响。

64、尽管许多不同的分子和蛋白质已被研究并且建议作为潜在的毒力因子，但其中只有少数被测试为潜在的疫苗或治疗产品候选物，并且此领域中的现状使得无法对所述任何分子作为合适的痤疮疫苗产品候选物的潜力得出确切的结论。一些毒力因子被发现是分泌的，一些在细胞膜中表达，但它们在细菌细胞表面上的可及性及其功能免疫相关性尚未研究，一些被发现仅由毒力潜力尚不十分了解的特定菌株表达。一些潜在的毒力因子表明是由特定种系型表达的，所述特定种系型被认为有毒力但具有高的抗原多样性和变化表达，因此还没有提出或证明在特定产品中使用的具体提议。另外，所有研究都有显著的局限性，使得无法就不同抗原的免疫相关优越性得出确切的结论。例如，未测试所鉴定的抗原以疫苗形式诱导免疫反应的能力，或者结论主要基于使用次优方法用单抗原获得的结果。例如，生物信息学分析提供了关于特定基因产物表达的可能性及其细胞位置的有限信息。虽然蛋白质组学分析可以提供关于限定基因背景下特定细菌细胞中基因表达的实际水平的更有价值的信息，但它也容易出错并且不可用于评估某种基因产品作为免疫治疗靶标的潜力。诸如生物材料制备过程中表达蛋白的稳定性、sds-page分离过程中的行为、溶解和从细胞膜提取的容易性等因素都可能影响分析结果并且导致次优结论。此外，蛋白质组学分析不提供关于细菌细胞表面上蛋白质及其免疫保护相关表位的可及性的任何信息。另外，许多研究侧重于只测试一些选定的痤疮丙酸杆菌菌株；分析中使用的临床样品是从少数供体获得的并且收集的方式引入了额外的变异，所述变异使得难以就不同分子或其衍生物作为产品候选物的适用性得出较可靠的结论。再加上此领域中关于介导痤疮丙酸杆菌诱导的病理的不同因素或可能提供保护的因素的重要性增加了另外矛盾的信息的最新发展，本领域技术人员无法基于本领域的现状有信心地猜测，设计最佳疫苗产品需要哪些以及多少抗原或表位，此类产品是否应诱导、减少或调节对特定蛋白质或其表位的免疫反应，以及如何设计它来保护对抗所有具有致病潜力的菌株，以及应靶向哪些菌株以实现对宿主的最大益处。

65、现有技术缺乏系统免疫学研究，其包括许多遗传上不同的痤疮丙酸杆菌菌株并且使用相同的免疫学的疫苗相关方法相互比较不同的抗原和片段。由于缺乏了解宿主与细菌之间的相互作用以及为什么只有某些个体中的痤疮丙酸杆菌与疾病的病理相关，这一进展也受到阻碍。这也使得研究界在开发基于痤疮丙酸杆菌的免疫治疗产品时小心谨慎，因为在产品应针对哪些痤疮丙酸杆菌菌株方面仍未达成共识，并且一些研究人员在考虑疫苗接种方法时非常谨慎，因为担心疫苗对可能有益于人类健康的菌株产生负面影响。这种谨慎尤其是由于对促成疾病的宿主因素的了解有限，因为痤疮丙酸杆菌通常被认为对免疫细胞的吞噬杀伤有抗性(webster等人1985)，并且还已报道，即使被吞噬细胞吞噬之后，也能逃避吞噬杀伤(fischer等人2013年)。另外，已经描述了痤疮丙酸杆菌转运的不同细胞内通路，其中之一涉及自噬，自噬是一种不依赖痤疮丙酸杆菌抗体的非特异性反应，它因细胞类型和条件而异，并且可能与先天免疫反应相关，这可能不会导致适应性免疫的激活。因此，可以激活稳态或保护性的适应性免疫反应，取决于宿主免疫系统如何感知细菌与宿主相互作用的后果以及细菌对宿主构成的危险的量。

66、还由于缺乏可用的疫苗抗原鉴定方法和模型，鉴定合适疫苗的进展缓慢。与更典型的感染性疾病相反，所有人的免疫系统都已对痤疮丙酸杆菌初免产生反应，并且在患者和健康个体两者的血液中都能发现针对这种细菌的抗体。因为不仅皮肤中的细菌而且还有在其他定植部位(例如，口腔、肠道)可以刺激免疫系统，并且对痤疮丙酸杆菌的免疫反应的水平也受到单独特定的因素的相互作用的影响，所述因素可能导致免疫系统将刺激感知为更大或更小的“危险”：仅仅在某个个体的血液中存在抗体并不能表明其实际临床有效性或重要性。因此，基于在没有任何功能测定的情况下的血清学筛选对抗原候选物的选择受到与仅通过存在和从不同个体的皮肤分离来确定特定痤疮丙酸杆菌菌株的致病性相同的局限性的束缚。在不了针对痤疮丙酸杆菌的抗体的抗细菌活性的任何情况下，难以辨别哪些抗原特异性抗体可以帮助免疫系统控制细菌的生长和侵袭行为，哪些可能导致产生只是正常细胞周转过程中持续定植、分泌和抗原呈现的副产品的抗体。

67、因此，目前痤疮丙酸杆菌免疫保护性抗原鉴定面临的挑战是多方面的并且涉及缺乏合适的疾病模型和缺乏用于抗原筛选的可靠功能性体外测定两者。在其他典型的疫苗发现项目中，即使没有可用的疾病动物模型，也可以使用功能性体外测定来选择合适的抗原用于保护性疫苗。例如，通过研究在动物体内抗原诱导杀细菌抗体的作用，使销售针对脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)的疫苗的发现成为可能，这在血清杀细菌测定中测试(giuliani等人2006)；通过在体外调理吞噬杀伤测定中研究抗体的调理吞噬杀伤作用，促进了针对肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的疫苗的发现(van westen等人2013)；以及

68、基于在抗体中和测定中测量的抗体对病毒复制的中和作用，已经发现了几种抗病毒疫苗(vanblargan等人2016)。目前还没有开发出用于痤疮丙酸杆菌疫苗研究的此类功能性体外测定。此外，在现有技术的当前状态下，痤疮丙酸杆菌被认为对吞噬杀伤和持久炎症具有抗性，这是由于作为大量推定毒力因子的表达和分泌的结果的广泛免疫刺激。这些因素中，哪些可能有助于宿主免疫细胞减少炎症组织中的细菌活性和密度并且从而有潜力使炎症减少或消退目前这是一个备受争议的问题，并且尚未提供令人满意的答案，除了以下提议：在寻常痤疮中，来自种系型ia1的菌株可能比其他菌株更具毒力，以及应在由这些菌株表达的那些中寻找理想的痤疮疫苗候选物(o’neill和gallo 2018；mclaughlin等人2019)。这使得对以下发现的重要性的回答不令人满意：除ia1型外的其他种系型经常与其他类型的痤疮丙酸杆菌相关感染(例如，植入物感染)分离，并且这些种系型还定植于人皮肤，这在手术过程中可能感染易感个体。根据宿主的机会和易感性，相同菌株可能在不同的背景下引起疾病的可能性在现有技术中尚未充分解决。相反，侧重点是尝试将特定痤疮丙酸杆菌系统发生类型与特定疾病相关联，但这种方法导致许多令人不满意或甚至矛盾的发现以及不同研究小组之间的许多争论(fitz-gibbon等人2013；eady和layton,2013；alexeyev和zouboulis,2013)。

69、本领域中最新进展并且影响研究人员的最新颖概念是皮肤微生物组的概念，并且因此，最近的研究侧重于鉴定致病因素，所述致病因素可能是定植于皮肤作用的特定区域的整个微生物群落内相互作用平衡失调的结果，并且引入了术语微生物组失调来指示这种可能性(o'neill和gallo 2018)。因此，研究人员目前的精力侧重于研究不同微生物物种之间的相互作用以及开发将解决“微生物组失调”的产品。尽管这种极其新颖的概念缺乏对每个个体中“健康”微生物组应该是什么样子的解释；许多研究人员已经在开发基于特定细菌菌株的混合物的下一代痤疮治疗产品或其作为皮肤益生菌和益生元的产品。最近关于此领域中在寻找治疗产品方面的进展的综述仍然将许多不同的毒力因子描述为可能有助于发病，然而，只有少数提出的毒力因子被实际测试为潜在的疫苗候选物：camp2和acherman2015等人鉴定的一组抗原(o'neill和gallo 2018)；然而，即使没有在相同的测定中并且使用更大范围的菌株系统地测试和比较这些抗原，这也将允许不偏倚地选择最合适的候选物(mclaughlin等人2019)。因此，即使在这些候选物中，在没有进一步测试的情况下也难以猜测哪种(如果有的话)最具保护性并且最适合作为疫苗候选物。

70、在超过15年的时间里，许多不同的蛋白质被提出促成痤疮丙酸杆菌毒力，并且许多不同研究小组已经研究了它们的生物学和潜在临床意义。已经在痤疮患者和健康个体的血清中检测了它们的细胞位置、分泌、由不同细菌菌株在不同环境中(在不同的生长介质中、在不同的体外生长条件下或在人皮肤中)的表达以及在一些情况下识别这些抗原的抗体。然而，这些发现结果的意义无法外推，以设计一种治疗痤疮或其他痤疮丙酸杆菌相关病理病症的疫苗产品。由于超过一个研究小组对许多蛋白质进行了研究并且其生物学和病理学意义仍在研究中，因此在截至今日的公共数据库(例如，uniprot:https://www.uniprot.org/)中，许多蛋白质仍然被指示为“推定的”或“未表征的”，或者它们是根据建议的、假设的生物学功能命名的，例如“保守蛋白质，推定用于fe转运”。为了便于理解本发明中呈现的数据，在总结表1中提供了截至本发明申请日在公共序列数据库中使用的序列和命名法。