对粘蛋白-1特异的抗体及其使用方法与流程

对粘蛋白-1特异的抗体及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年7月31日提交的美国临时申请号63/059,497的优先权权益，其公开内容通过引用并入本文。
3.通过引用并入以文本文件提供的序列表
4.本文以文本文件“rdwd-035wo seq list_st25.txt”提供序列表，该文件创建于2021年7月27日，并且具有29kb的大小。该文本文件的内容通过引用以其整体并入本文。
5.介绍
6.粘蛋白-1(也被称为粘蛋白1或muc1)是粘蛋白家族的成员。粘蛋白是在上皮表面形成保护性粘液屏障中发挥重要作用的o-糖基化蛋白质。muc1在上皮细胞的顶面表达，这些上皮细胞排列在许多不同组织(包括肺部、乳房、胃和胰腺)的粘膜表面。该蛋白被蛋白水解裂解为形成异二聚体复合物的α和β亚基。n-末端α亚基在细胞粘附中发挥作用，并且c-末端β亚基参与细胞信号传导。该蛋白的过度表达、异常的细胞内定位和糖基化的变化与癌相关。
7.本领域需要安全且有效的靶向muc1的剂，用于诊断和治疗muc1相关的病况，诸如癌症。
8.概要
9.本公开提供了对muc1特异的抗体。还提供了编码本公开的抗体的一个或两个可变链多肽的核酸，以及包括此类核酸的细胞。还提供了包括本公开的抗体的组合物，在一些情况下，包括药物组合物。还提供了制备和使用本公开的抗体的方法。在某些方面，提供了包括向患有细胞增殖性病症的个体施用治疗有效量的本公开的抗体的方法，其中向个体施用抗体以增强对细胞增殖性病症的异常增殖细胞的免疫反应，例如t细胞反应。抗体在各种诊断和监测应用中是有用的，其也被提供。
附图说明
10.图1显示根据尺寸排阻色谱法(sec)所确定的，抗muc1抗体、muc1gb06、muc1 g12和muc1 h02分别超过99％、超过99％和超过98％是单体的。
11.图2a-2c显示根据elisa所评估的，抗muc1抗体、muc1gb06、muc1 g12和muc1 h02结合至重组20mer muc1糖基化生物素，但不结合至重组60mer muc1非糖基化生物素或糖基化诱饵肽根据。
12.图3a-3b显示通过抗muc1抗体、muc1gb06、muc1 g12和muc1h02与未涂覆的链亲和素或maxisorp板的结合水平。
13.图4显示叠加直方图，其显示了一式三份测试的指示抗体与指定细胞系的结合。
14.图5显示交错直方图(staggered histograms)，其显示了指示抗体与指定细胞系的结合。
15.图6显示通过差示扫描荧光法确定的b06、g12和h02抗muc1抗体的ch2和fab区的熔解温度。
16.图7显示抗muc1抗体b06针对t47d异种移植的体内功效。n＝10只小鼠/组；箭头表示施用抗体或媒介物的天数。
17.定义
18.术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白(例如igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)、ige、igd、iga、igm等)；整个抗体(例如包括四聚体，四聚体又包括重链和轻链多肽的两个二聚体的抗体)；单链抗体(例如scfv)；保留与抗原特异性结合的抗体片段(例如整个链或单链抗体的片段)，包括但不限于fab、fv、scfv和fd片段；嵌合抗体；人源化抗体；单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以是例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等可检测标记的。抗体可以进一步与其他部分诸如特异结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异结合对的成员)等共轭。抗体也可以与固体支持物，包括但不限于聚苯乙烯板或珠子等结合。该术语还包括fab’、fv、f(ab’)2和或其他保留与抗原特异性结合的抗体片段以及单克隆抗体。抗体可以是单价的或双价的。
[0019]“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab’、f(ab’)2和fv片段；双抗体；线性抗体(zapata等，protein eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点以及残留的“fc”片段，名称反映了容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的f(ab’)2片段。
[0020]“fv”是最小的含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密地、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构造中，每个可变结构域的三个cdr相互作用以在vh-vl二聚体的表面上确定抗原结合位点。共同地，六个cdr将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使单一的可变结构域(或仅包括三个对抗原特异的cdr的fv的一半)，尽管亲和力低于整个结合位点，也具有识别和结合抗原的能力。
[0021]“fab”片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab片段通过在重链ch1结构域的羧基末端处添加几个残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而区别于fab’片段。fab
’‑
sh是本文对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基的fab’的命名。f(ab’)2抗体片段最初是作为成对的fab’片段产生的，在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学连接也是已知的。
[0022]
任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于它们的恒定结构域的氨基酸序列被分配为两个明显不同的类型(称为κ和λ)之一。基于它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分配为不同的类别。有五个主要的免疫球蛋白类别：iga、igd、ige、igg和igm，这些的几个可以被进一步划分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。
[0023]“单链fv”或“sfv”抗体片段包括抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些方面，fv多肽进一步包括在vh和vl结构域之间的多肽连接子(linker)，这使得sfv能够形成期望的用于抗原结合的结构。
[0024]
术语“双抗体”指的是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括与同一多肽链(v
h-v
l
)中的轻链可变结构域(v
l
)连接的重链可变结构域(vh)。通过使用太短而不允许
在同一链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。
[0025]
如本文中使用的，术语“亲和力”指的是两个剂的可逆结合的平衡常数，并被表示为解离常数(kd)。亲和力可以是与抗体对不相关氨基酸序列的亲和力相比至少1倍大、至少2倍大、至少3倍大、至少4倍大、至少5倍大、至少6倍大、至少7倍大、至少8倍大、至少9倍大、至少10倍大、至少20倍大、至少30倍大、至少40倍大、至少50倍大、至少60倍大、至少70倍大、至少80倍大、至少90倍大、至少100倍大或至少1000倍大或更多。抗体对靶蛋白的亲和力可以是，例如，从约100纳摩尔(nm)到约0.1nm，从约100nm到约1皮摩尔(pm)，或从约100nm到约1飞摩尔(fm)或更多。如本文中使用的，术语“亲合力(avidity)”指的是两个或多个剂的络合物在稀释后对解离的抵抗力。关于抗体和/或抗原结合片段，术语“免疫活性”和“优先结合”在本文中可互换使用。
[0026]
术语“结合”指的是由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用(包含诸如盐桥和水桥的相互作用)在两个分子之间的直接缔合。受试者抗muc1抗体与muc1多肽(例如，人muc1多肽，例如糖基化muc1或其片段内的表位特异地结合)。非特异性结合将指的是亲和力低于约10-7
m的结合，例如亲和力为10-6
m、10-5
m、10-4
m等的结合。
[0027]
在抗体和抗原的上下文中，术语“特异地结合”意指抗体以例如大于或等于约105m-1
的亲和力或ka(即，以单位为1/m的特定结合相互作用的平衡缔合常数)与抗原结合或与抗原缔合。
[0028]“高亲和力”结合指的是具有至少107m-1
、至少108m-1
、至少109m-1
、至少10
10
m-1
、至少10
11
m-1
、至少10
12
m-1
、至少10
13
m-1
或更大的ka的结合。可选地，亲和力可以定义为以单位为m(例如10-5
m至10-13
m，或更少)的特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)。在一些实施方式中，特异结合意指抗体以小于或等于约10-5
m、小于或等于约10-6
m、小于或等于约10-7
m、小于或等于约10-8
m、或小于或等于约10-9
m、10-10
m、10-11
m、或10-12
m或更小的kd结合至抗原。抗体对抗原的结合亲和力可以容易地使用常规技术确定，例如，通过竞争elisa(酶联免疫吸附试验)、平衡透析、通过使用表面等离子体共振(spr)技术(例如，biacore 2000仪器，使用制造商概述的一般程序)、通过放射免疫测定等。
[0029]
如本文中使用的，术语“cdr”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽两者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。cdr已被kabat等，j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat等，美国dept.of health and human services，“sequences of proteins of immunological interest”(1991)；chothia等，j.mol.biol.196:901-917(1987)；以及maccallum等，j.mol.biol.262:732-745(1996)描述，其中该定义在相互比较时包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或接枝抗体或其变体的cdr，意在如本文中定义和使用的术语的范围内。作为比较，涵盖如通过以上每一篇引用的参考文献篇所定义的cdr的氨基酸残基在以下表1中阐明。
[0030]
表1:cdr定义
[0031] kabat1chothia2maccallum
3vh cdr131-3526-3230-35v
h cdr250-6553-5547-58v
h cdr395-10296-10193-101vl cdr124-3426-3230-36v
l cdr250-5650-5246-55v
l cdr389-9791-9689-96
[0032]1残基编号遵循上述kabat等的命名法
[0033]2残基编号遵循上述chothia等的命名法
[0034]3残基编号遵循上述maccallum等的命名法
[0035]
在整个本公开中，免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中的残基编号是kabat等，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)中的编号，该文献通过引用明确地并入本文。
[0036]
如本文中使用的，术语“框架”当用于指抗体可变区时意指在抗体的可变区内的cdr区外的所有氨基酸残基。可变区框架通常是长度在约100-120个氨基酸之间的不连续氨基酸序列，但意仅指cdr的外部的那些氨基酸。如本文中使用的，术语“框架区”意指被cdr隔开的框架的每个结构域。
[0037]“亲本ig多肽”是包含缺乏如本文中描述的醛标记的恒定区的氨基酸序列的多肽。亲本多肽可以包括天然序列恒定区，或者可以包括具有预先存在的氨基酸序列修饰(诸如添加、删除和/或取代)的恒定区。
[0038]
在ig多肽的上下文中，术语“恒定区”在本领域是众所周知的，并且指的是ig重链或ig轻链的c-末端区。ig重链恒定区包括ch1、ch2和ch3结构域(以及ch4结构域，其中重链是μ或ε重链)。在天然ig重链中，ch1、ch2、ch3(如果有的话，以及ch4)结构域紧接着重链可变(vh)区(的c-末端)之后开始，并且各自的长度为从约100个氨基酸至约130个氨基酸。在天然ig轻链中，恒定区紧接着轻链可变区(vl)(的c-末端)之后开始，并且长度为约100个氨基酸至120个氨基酸。
[0039]“表位”是抗体与其结合的抗原上的位点(例如muc1上的位点)。表位可以通过蛋白质的折叠(例如三级折叠)由并列的连续的氨基酸或者非连续的氨基酸形成。由连续的氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常被保留，然而通过折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常被丢失。表位通常包括至少3个，并且更通常至少5个或8-10个呈线性或空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如，x-射线晶体学和二维核磁共振。例如，参见epitope mapping protocols in methods in molecular biology，第66卷，glenn e.morris编辑(1996)。一些商业实验室提供表位作图服务。由与膜缔合的抗原的免疫反应的抗体结合的表位可以位于细胞表面(例如，在跨膜蛋白的细胞外区)上，因此此类表位被认为是细胞表面可及的、溶剂可及的和/或细胞表面暴露的。
[0040]
在提及多肽、肽或蛋白质的氨基酸序列中所使用的“基因可编码的”意指氨基酸序列包括能够通过编码该氨基酸序列的核酸的转录和翻译产生的氨基酸残基，其中转录和/或翻译可以在细胞中或在无细胞体外转录/翻译系统中发生。
[0041]
术语“控制序列”指的是在特定表达系统(例如哺乳动物细胞、细菌细胞、无细胞合成等)中促进可操作地连接的编码序列的表达的dna序列。适用于原核生物系统的控制序列例如包括启动子、可选地操纵子序列以及核糖体结合位点。真核细胞系统可以利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
[0042]
当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，其被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌主导体(secretory leader)的dna被表达为参与多肽的分泌的前蛋白，那么其与多肽的dna可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，那么其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译的启动，那么其与编码序列可操作地连接。通常地，“可操作地连接”意指被连接的dna序列是连续的，并且在分泌主导体的情况下，是连续的并且在阅读框中。连接是通过接合或通过扩增反应完成的。合成的寡核苷酸接头(adaptor)或连接子可以根据常规实践用于连接序列。
[0043]
如本文中使用的术语“表达盒”指的是可以插入核酸(例如，通过使用与接合到感兴趣的构建体兼容的限制性位点或通过同源重组到感兴趣的构建体或宿主细胞基因组中)的核酸片段，通常是dna。一般而言，核酸片段包括编码感兴趣的多肽的多核苷酸，并且盒和限制性位点被设计以促进将盒插入正确的阅读框中用于转录和翻译。表达盒也可以包括在宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中促进编码感兴趣的多肽的多核苷酸的表达的元件。这些元件可以包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、反应元件、终止子序列、多腺苷酸化序列等。
[0044]“分离的”抗体是一种已经被识别并从其天然环境的成分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在一些实施方式中，抗体将被纯化(1)至按通过lowry方法确定的抗体的重量计，大于90％、大于95％或大于98％，例如，按重量计多于99％，(2)至通过使用旋杯式测序仪足以获得至少15个n-末端的残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)至通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)在还原或非还原条件下使用考马斯亮蓝或银染色的同质性。分离的抗体包括在重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分会不存在。在一些情况下，分离的抗体会通过至少一个纯化步骤来制备。
[0045]
术语“天然抗体”指的是其中抗体的重链和轻链已通过多细胞生物体的免疫系统制备和配对的抗体。脾脏、淋巴结、骨髓和血清是产生天然抗体的组织的实例。例如，通过从以抗原免疫的第一动物中分离的抗体产生细胞产生的抗体是天然抗体。
[0046]
术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”指的是含有一个或多个被来自人抗体的相应位置的氨基酸所取代的氨基酸(例如在框架区、恒定区或cdr中)的非人(例如小鼠或兔子)抗体。一般而言，与同一抗体的非人源化版本相比，人源化抗体在人宿主中产生减少的免疫反应。抗体可以使用本领域已知的各种技术进行人源化，例如，包括cdr接枝、贴面或表面重塑、链替换(chain shuffle)等。在某些实施方式中，通过对cdr和框架残基的相互作用进行建模来鉴定框架取代，来鉴定对抗原结合和序列比对重要的框架残基，以鉴定特定位置的异常框架残基。因此，上述的抗体可以使用本领域众所周知的方法进行人源化。
[0047]
在某些实施方式中，本文公开的抗体分子包括包含如本文提供的可变重链区和具有uniprot：p01857-1版本1中阐述的氨基酸序列的人igg1恒定区的重链。在某些实施方式中，本文公开的抗体分子包括包含如本文提供的可变轻链区和人轻链恒定区的轻链。在某些实施方式中，人轻链恒定区是具有uniprotkb/swiss-prot：p01834.2中阐述的氨基酸的人κ轻链恒定区。在某些实施方式中，存在于主题抗体中的人igg1重链恒定区可以包括突变，例如，调节fc功能的取代。例如，可以引入lalapg效应子功能突变(l234a、l235a和
p329g)或n297a突变来降低抗体依赖性细胞毒性(adcc)。取代的编号基于eu编号系统。当涉及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“eu编号系统”或“eu指数”(例如，kabat等，sequences of proteins of immunological interest,第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)中报道的eu指数)。“如kabat中的eu指数”指的是人igg 1eu抗体的残基编号。
[0048]
术语“嵌合抗体”指的是其轻链和重链基因通常通过基因工程从属于不同物种的抗体可变和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变片段可以连接到人恒定片段，诸如γ1和γ3。尽管可以使用来自其他哺乳动物物种的结构域，治疗性嵌合抗体的实例是包括来自小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定或效应子结构域的杂合蛋白。
[0049]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸的聚合形式。除非另有明确说明，否则“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以包括基因编码的和非编码的氨基酸、化学或生化修饰的或衍生的氨基酸、以及具有修饰的肽主链(backbone)的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合、含有至少一个n-末端甲硫氨酸残基的蛋白质(例如，促进在重组宿主细胞中的产生)、免疫标记的蛋白质等。在抗体的上下文中，很明显链或结构域包括多肽。
[0050]“天然氨基酸序列”或“亲本氨基酸序列”在本文中可互换使用，以指在修饰为包括修饰的氨基酸残基之前多肽的氨基酸序列。
[0051]
术语“氨基酸类似物”、“非天然氨基酸”等可以互换使用，并且包括在结构和/或整体形状中与通常在天然存在的蛋白质中发现的一种或多种氨基酸(例如，ala或a、cys或c、asp或d、glu或e、phe或f、gly或g、his或h、ile或i、lys或k、leu或l、met或m、asn或n、pro或p、gln或q、arg或r、ser或s、thr或t、val或v、trp或w、tyr或y)相似的氨基酸样化合物。氨基酸类似物还包括具有修饰的侧链或主链的天然氨基酸。氨基酸类似物还包括具有与天然存在的d-型以及氨基酸类似物的l-型中相同立体化学的氨基酸类似物。在一些情况下，氨基酸类似物共享一个或多个天然氨基酸的主链结构和/或侧链结构，差异是分子中的一个或多个修饰的基团。此类修饰可以包括但不限于原子(诸如n)对于相关原子(诸如s)的取代、基团(诸如甲基或羟基等)或原子(诸如cl或br等)的添加、基团的删除、共价键(单键对于双键等)的取代，或其组合。例如，氨基酸类似物可以包括α-羟基酸和α-氨基酸等。
[0052]
术语“氨基酸侧链”或“氨基酸的侧链”等可用于指附着于氨基酸残基的α-碳的取代基，包括天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。氨基酸侧链还可以包括如在本文所述修饰的氨基酸和/或共轭物的上下文中描述的氨基酸侧链。
[0053]
术语“共轭”通常指的是使一个感兴趣的分子与第二个感兴趣的分子近端缔合的化学键合(共价的或者非共价的二者其一，通常是共价的)。在一些实施方式中，剂选自半衰期延长部分、标记剂和治疗剂。对于半衰期延长，例如，本公开的抗体可任选地被修饰以提供改善的药代动力学概况(例如，通过聚乙二醇化、高糖基化等)。可以增强血清半衰期的修饰是感兴趣的。
[0054]
术语“碳水化合物”等可用于指单糖、二糖、低聚糖和多糖的单体单元和/或聚合物。术语糖可用于指较小的碳水化合物，诸如单糖、二糖。术语“碳水化合物衍生物”包括其中感兴趣的碳水化合物的一个或多个官能团被取代(被任何方便的取代基取代)、修饰(使
用任何方便的化学反应转化至另一个基团)或不存在(例如，被h消除或取代)的化合物。多种碳水化合物和碳水化合物衍生物是可用的，并且可以适合于用于主题化合物和共轭物。
[0055]
如本文中使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等指的是获得期望的药理学和/或生理学效果。在完全或部分预防疾病或其症状方面，效果可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良反应方面，效果可以是治疗性的。如本文中使用的“治疗(treatment)”涵盖哺乳动物中(特别是人中)疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病发生在可能易感疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；以及(c)缓解疾病，即引起该疾病的消退。
[0056]
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指的是哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
[0057]“治疗有效量”或“有效量”指的是当施用至哺乳动物或其他受试者用于治疗疾病时，足以影响对疾病的此类治疗的受试者抗muc1抗体的量。“治疗有效量”将根据抗muc1抗体、疾病及其严重程度以及要被治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
[0058]“生物样品”包含从个体中获得的各种样品类型，并且可用于诊断或监测测定。该定义包含生物来源的血和其他液体样品、固体组织样品(诸如活检标本或组织培养物或来源于其的细胞及其后代)。该定义还包括在它们的获取后以任何方式被操作的样品，诸如通过用试剂处理、增溶或者富集某些成分(诸如多核苷酸)。术语“生物样品”包含临床样品，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。在一些情况下，生物样本会包括肝细胞。
[0059]
在进一步描述本发明之前，应当理解的是本发明不限于描述的特定实施方式，因此当然可以变化。还应理解的是本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且不意在被限制，因为本发明的范围将仅被所附权利要求限制。
[0060]
在提供值的范围的情况下，应当理解的是除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限与该指定范围中的任何其他指定的或中间值之间的每个中间值，至下限的十分之一单位，都被包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包含在较小的范围中，并且也被包含在本发明内，受制于指定范围中任何明确排除的限制。在指定的范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制的任何一个或两个的范围也被包括在本发明中。
[0061]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管任何与本文描述的那些相似或等同的方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述了优选的方法和材料。本文中提到的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与其中引用出版物相关的方法和/或材料。
[0062]
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一/一个/一种(a)”、“一/一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“抗体”包括多种此类抗体，并且提及“cdr”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种cdr及其等同物，等等。进一步注意的是，权利要求可以被起草为排除任何可选的元素。因此，本声明意在充当用于使用与权利要求元素的叙述有关的此类排他性术语如“仅仅(solely)”、“仅(only)”等或者使用“否定”限制的先行基础。
[0063]
此处讨论的出版物仅仅提供它们在本技术的提交日期之前的公开内容。此处没有内容应被解释为承认本发明无权由于先前的发明而早于此类出版物。此外，提供的公布日期可与实际公布日期不同，实际公布日期可能需要单独确认。
[0064]
详细描述
[0065]
本公开提供了对muc1特异的抗体。还提供了编码本公开的抗体的一个或两个可变链多肽的核酸，以及包括此类核酸的细胞。还提供了包括本公开的抗体的组合物，在一些情况下，包括药物组合物。还提供了制备和使用本公开的抗体的方法。在某些方面，提供了包括向患有细胞增殖性病症的个体施用治疗有效量的本公开的抗体的方法，其中向个体施用抗体以增强对细胞增殖性病症的异常增殖细胞的免疫反应，例如t细胞反应。抗体在各种诊断和监测应用中是有用的，其也被提供。
[0066]
muc1抗体
[0067]
如以上总结的，本公开提供了抗muc1抗体。
[0068]
根据一些实施方式，本公开的抗体特异地结合至muc1，并且与包括下述的抗体竞争结合至muc1：
[0069]
可变重(vh)链，其包括具有下述序列的vh链的重链cdr1-3(hcdr1-3)：
[0070]
evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdhtmhwikqrpgkglewmgyfyprddstnynekfkgrvtltadkstdtaymelsslrsedtavyycarglryaldywgqgtlvtvss(seq id no:1)；以及
[0071]
可变轻(vl)链，其包括具有下述序列的vl链的轻链cdr1-3(lcdr1-3)：
[0072]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiygtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyawspptfgqgtkleik(seq id no:2)；
[0073]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvgssnlywyqqkpgqaprlwiyrstklasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyrwspptfgqgtkleik(seq id no:3)；或
[0074]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiigtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyswspptfgqgtkleik(seq id no:4)。
[0075]
可以采用任何合适的方法来确定第一抗体是否与第二抗体竞争结合至muc1。第一抗体是否与第二抗体“竞争”结合至muc1可以使用本领域已知的竞争性结合试验容易地确定。，竞争抗体可以例如经由抗体竞争试验被确定。例如，第一抗体的样品可以结合至固体支持物。然后，加入疑似能够与此类第一抗体竞争的第二抗体的样品。两个抗体中的一个被标记。如果标记的抗体和未标记的抗体结合至muc1上分开的和离散的位点，那么无论疑似竞争抗体是否存在，标记的抗体将结合到相同的水平。然而，如果相互作用的位点相同或重叠，那么未标记的抗体将竞争，并且结合至muc1的标记的抗体的量将被降低。如果未标记的抗体过量地存在，那么如果有的话，标记的抗体将很少结合。
[0076]
对于本公开的目的，竞争抗体是使抗体与muc1的结合减少约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多或约99％或更多的那些抗体。进行此类竞争试验的程序的细节在本领域是众所周知的。此类试验可以通过使用纯化的抗体来进行定量。可以通过滴定一种抗体针对其本身建立标准曲线，即标记和竞争者两者都使用相同的抗体。未标记的竞争抗体抑制标记的抗体与抗原的结合的能力可以被滴定。结果可以被绘制，并且可以比较达到期望的结合抑制程度所需的浓度。
[0077]
根据一些实施方式，本公开的抗体特异地结合至muc1并且包括：
[0078]
可变重(vh)链，其包括具有下述序列的vh链的重链cdr1-3(hcdr1-3)：
[0079]
evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdhtmhwikqrpgkglewmgyfyprddstnynekfkgrvtltadkstdtaymelsslrsedtavyycarglryaldywgqgtlvtvss(seq id no:1)；以及
[0080]
可变轻(vl)链，其包括具有下述序列的vl链的轻链cdr1-3(lcdr1-3)：
[0081]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiygtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyawspptfgqgtkleik(seq id no:2)；
[0082]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvgssnlywyqqkpgqaprlwiyrstklasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyrwspptfgqgtkleik(seq id no:3)；或
[0083]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiigtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyswspptfgqgtkleik(seq id no:4)。
[0084]
hcdr1-3和lcdr1-3可以由chothia、kabat或imt命名法限定。如根据列出的命名法定义的，本文公开的抗muc1抗体的hcdr1-3可以如下：
[0085]
表2：
[0086][0087]
本文中公开的抗muc1抗体的lcdr1-3可以根据表3-5中列出的命名法进行定义。
[0088]
表3
[0089][0090]
表4
[0091][0092]
表5
[0093][0094]
在某些实施方式中，抗muc1抗体的vh链包括本文所阐述的hcdr1-3，并且抗muc1抗体的vl链包括lcdr1-3，根据kabat定义，其中
[0095]
lcdr1包括氨基酸序列rasssvg/sssyly(seq id no:41)；
[0096]
lcdr2包括氨基酸序列g/rt/ss/tn/klas(seq id no:42)；
[0097]
lcdr3包括氨基酸序列hqya/r/swsppt(seq id no:43)。
[0098]
在某些实施方式中，抗muc1抗体的vh链包括本文所阐述的hcdr1-3，并且包括与seq id no:1所示的氨基酸序列具有80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、99％或更大、或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的抗muc1抗体的vh链与seq idno:1之间的任何氨基酸差异可以限于cdr之外的区，例如，在一个或多个框架区(fr)，例如fr1、fr2、fr3和/或fr4中。
[0099]
在某些实施方式中，抗muc1抗体的vl链包括本文表3中所阐述的lcdr1-3，并且包括与seq id no:2所示的氨基酸序列具有80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、99％或更大或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0100]
在某些实施方式中，抗muc1抗体的vl链包括本文表4中所阐述的lcdr1-3，并且包括与seq id no:3所示的所示的氨基酸序列具有80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、99％或更大或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0101]
在某些实施方式中，抗muc1抗体的vl链包括本文表5中所阐述的lcdr1-3，并且包括与seq id no:4所示所示的氨基酸序列具有80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、99％或更大或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0102]
在某些实施方式中，本公开的抗muc1抗体的vl链与seq id no:2、3和4之间的任何氨基酸差异可以限于cdr之外的区，例如，在一个或多个框架区(fr)，例如fr1、fr2、fr3和/或fr4中。
[0103]
在某些实施方式中，本公开的抗muc1抗体可以包括：a)重链，其包括具有seq id no:1所示的氨基酸序列的vh区；以及轻链，其包括具有seq id no:2、3或4所示的氨基酸序列的vl区。
[0104]
本公开的抗muc1抗体可以结合至具有通过elisa测量的约0.4-1nm(例如，0.5-0.9nm、0.6-0.8nm或0.65-0.75nm)的ec50的muc-1。提供半数最大响应(例如，最大荧光强度的一半)的抗体的浓度被测量为ec50。muc-1可以是如实施例1所公开的20mer糖基化muc1肽。
[0105]
如实施例1所公开的，本公开的抗muc1抗体可以结合至20mer muc1糖基化肽，但不结合至重组60mer muc1非糖基化肽。
[0106]
本公开的抗muc1抗体可以结合至癌组织，并且可以显示与正常组织无结合(例如，通过免疫组织化学测量的微不足道的结合或通过免疫组织化学检测不到的结合)。例如，本文描述的抗muc1抗体可以结合至具有癌细胞的人胃、乳腺和/或肺组织，然而显示与不具有癌细胞的人胃、乳腺和/或肺组织没有可检测的结合。
[0107]
在某些实施方式中，本公开的抗muc1抗体的vh区由与下述核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的核酸编码：
[0108]
gaggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggctacagtgaaaatctcctgcaaggtttctggatacaccttcaccgaccataccatgcactggatcaaacagcgacctggaaaagggcttgagtggatgggatacttctaccctagagatgattccacaaattacaacgagaagttcaagggcagagtcacccttaccgcggacaaatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgtggtcttcgatacgctcttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca(seq id no:19)
[0109]
在某些实施方式中，本公开的抗muc1抗体的vl区由与下述核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的核酸编码：
[0110]
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagttcaagtgttagcagcagctacttatactggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctctggatctatggtacctccaaccttgcctccggcgtcccagcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagactacactctcaccatcagctccctggagcctgaagatgcggcagtttattactgtcaccaatacgcctggtccccgccgacgttcggccaagggaccaagttggaaatcaaa(seq id no:38)；
[0111]
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagttcaagtgttggcagcagcaacttatactggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctctggatctataggtccaccaaacttgcctccggcgtcccagcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagactacactc
tcaccatcagctccctggagcctgaagatgcggcagtttattactgtcaccaatacagatggtccccgccgacgttcggccaagggaccaagttggaaatcaaa(seq id no:39)；或
[0112]
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagttcaagtgttagcagcagctacttatactggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctctggatcattggtacctccaaccttgcctccggcgtcccagcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagactacactctcaccatcagctccctggagcctgaagatgcggcagtttattactgtcaccaatactcctggtccccgccgacgttcggccaagggaccaagttggaaatcaaa(seq id no:40)。
[0113]
这些抗体发现用于各种研究、诊断和治疗应用，包括用于执行美国专利申请号us20120141375a1、us20160145343a1中描述的任何方法，其公开内容通过引用以其整体并入本文用于所有目的。
[0114]
主题抗体特异地结合muc1多肽，其中表位包括人muc1抗原内的氨基酸残基，其包括seq id no:20所示的氨基酸序列：
[0115]
mtpgtqspffllllltvltvvtgsghasstpggeketsatqrssvpssteknavsmtssvlsshspgsgssttqgqdvtlapatepasgsaatwgqdvtsvpvtrpalgsttppahdvtsapdnkpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdnrpalgstappvhnvtsasgsasgsastlvhngtsaratttpaskstpfsipshhsdtpttlashstktdassthhssvppltssnhstspqlstgvsffflsfhisnlqfnssledpstdyyqelqrdisemflqiykqggflglsnikfrpgsvvvqltlafregtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsgagvpgwgiallvlvcvlvalaivylialavcqcrrknygqldifpardtyhpmseyptyhthgryvppsstdrspyekvsagnggsslsytnpavaatsanl(seq id no:20)
[0116]
在某些实施方式中，由本文中公开的抗muc1抗体结合的muc1表位被糖基化。在某些实施方式中，由本文中公开的抗muc1抗体结合的muc1表位存在于由肺外腺癌细胞系(epipulmonary adenocarcinoma cell lines)和肺上皮细胞表达的muc1上。
[0117]
主题抗体表现出与muc1的高亲和力结合。例如，主题抗体以至少约10-7
m、至少约10-8
m、至少约10-9
m、至少约10-10
m，至少约10-11
m，或至少约10-12
m或大于10-12
m的亲和力结合至muc1。主题抗体以约10-7
m至约10-8
m、约10-8
m至约10-9
m、约10-9
m至约10-10
m、约10-10
m至约10-11
m、或约10-11
m至约10-12
m或大于10-12
m的亲和力结合至存在于muc1上的表位。
[0118]
本公开的抗muc1抗体在一些情况下可以在于其细胞表面上表达muc1的细胞中诱导细胞凋亡。
[0119]“muc1抗原”或“muc1多肽”可以包括与seq id no:20具有至少约75％、至少约
80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0120]
如本文中使用的术语“免疫球蛋白”指的是由基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(iga1和iga2)、γ(igg1、igg2、igg3、igg4)、δ、ε和μ恒定区基因；以及许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25kd或214个氨基酸)由n-末端处的可变区基因(约110个氨基酸)和c-末端处的κ或λ恒定区编码。全长免疫球蛋白重链(约50kd或446个氨基酸)由n-末端处的可变区基因(约116个氨基酸)和c-末端处的其他上述恒定区基因之一，例如γ(编码约330个氨基酸)编码。在一些实施方式中，主题抗体包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链。
[0121]
在一些实施方式中，主题抗体不包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链，而是包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链的抗原结合片段。在一些实施方式中，抗原结合片段被包含在分开的多肽链上；在其他实施方式中，抗原结合片段被包含在单个多肽链内。如上所述，术语“抗原结合片段”指的是能够特异地结合至muc1的全长抗体的一个或多个片段。结合片段的实例包括(i)fab片段(由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段)；(ii)f(ab’)2片段(二价片段，其包括通过铰链区处的二硫键连接的两个fab片段)；(iii)fd片段(由vh和ch1结构域组成)；(iv)fv片段(由抗体的单个臂的vh和vl结构域组成)；(v)dab片段(由vh结构域组成)；(vi)分离的cdr；(vii)单链fv(scfv)(由抗体的单个臂的vh和vl结构域组成，该抗体由合成连接子使用重组方法连接，使得vh和vl结构域配对以形成单价分子)；(viii)双抗体(由两个scfv组成，其中vh和vl结构域连接，使得它们不会配对形成单价分子；每一个scfv的vh与另一个scfv的vl结构域配对以形成二价分子)；(ix)双特异性抗体(由至少两个抗原结合区组成，每个区结合不同的表位)。在一些实施方式中，主题抗体片段是fab片段。在一些实施方式中，主题抗体片段是单链抗体(scfv)。
[0122]
在一些实施方式中，主题抗体是重组或修饰的抗体，例如嵌合、人源化、去免疫或体外生成的抗体。如本文中使用的术语“重组”或“修饰的”抗体意在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有抗体，诸如(i)使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；(ii)从重组、组合抗体库中分离的抗体；(iii)从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体；或(iv)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体包括人源化、cdr接枝、嵌合、去免疫和体外生成的抗体；并且可任选地包括来源于人种系免疫球蛋白序列的恒定区。
[0123]
全长双特异性抗体可以如下生成：例如使用两个单特异性二价抗体之间的fab臂交换(或半分子交换)，通过在每个半分子中的重链ch3界面引入取代，以有利于具有不同特异性的两个抗体半分子在体外无细胞环境中或使用共表达二者其一的异质二聚体形成。fab臂交换反应是二硫键异构化反应和ch3结构域的解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。所得的亲本单特异性抗体之一的游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，并且同时亲本抗体的ch3结构域通过解离-缔合释放和重组。fab臂的ch3结构域可以被工程化以有利于异源二聚化而不是同源二聚化。所得产物是具有两个fab臂或半分子的双特异性抗体，每个fab臂或半分子结合不同的表位。
[0124]“杵臼(knob-in-hole)”策略(参见，例如，pct国际公布号wo2006/028936)可用于
生成全长双特异性抗体。简而言之，形成人igg中ch3结构域界面的选定的氨基酸可以在影响ch3结构域相互作用的位置处突变，以促进异源二聚体形成。具有小的侧链的氨基酸(臼)被引入特异性结合第一抗原的抗体的重链中，并且具有大的侧链的氨基酸(杵)被引入特异性结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体的共同表达之后，由于具有“臼”的重链与具有“杵”的重链的优先相互作用，形成异质二聚体。形成杵和臼的示例性ch3取代对是(表示为第一重链的第一ch3结构域中的修饰位置/第二重链的第二ch3结构域中的修饰位置)：t366y/f405a、t366w/f405w、f405w/y407a、t394w/y407t、t3945/y407a、t366w/t394s、f405w/t394s和t366w/t366s/l368a/y407v。
[0125]
可以使用其它策略，诸如通过取代在一个ch3表面处的带正电荷的残基和在第二ch3表面处的带负电荷的残基，使用静电相互作用来促进重链异源二聚化，如us专利公布号us2010/0015133；us专利公布号us2009/0182127；us专利公布号us2010/028637或us专利公布号us2011/0123532中描述的。在其他策略中，异源二聚化可以通过下述取代(表示为在第一重链的第一ch3结构域中的修饰位置/在第二重链的第二ch3结构域中的修饰位置)来促进：如美国专利公布号us2012/0149876或美国专利公布号us2013/0195849中描述的l351 y/f405a/y407v/t394w、t366i/k392m/t394w/f405a/y407v、t366l/k392m/t394w/f405a/y407v、l351y/y407a/t366a/k409f、l351y/y407a/t366v/k409f、y407a/t366a/k409f、或t350v/l351y/f405a/y407v、t350v/t366l/k392l/t394w。
[0126]
还提供了单链双特异性抗体。在一些实施方式中，本公开的单链双特异性抗体是双特异性scfv。主题抗体可以被人源化。恒定区(如果存在)也可以基本上或完全来自人免疫球蛋白。
[0127]
制备人源化抗体的方法是本领域已知的。将小鼠cdr取代为人类变结构域框架可以导致保留它们正确的空间方向，例如，其中人可变结构域框架采用与cdr来源于其中的小鼠可变框架相同或相似的构象。这可以通过从人抗体中获得人可变结构域来实现，人抗体的框架序列表现出与cdr来源于其中的鼠可变框架结构域高度的序列同一性。重链和轻链可变框架区可以来源于相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列，或者可以是几种人抗体的共有序列。
[0128]
在确定了鼠供体免疫球蛋白和适当的人受体免疫球蛋白的互补决定区之后，下一步是确定哪些(如果有的话)来自这些组分的残基应该被取代以优化所得人源化抗体的特性。一般来说，用鼠取代人氨基酸残基应被最小化，因为在人中引入鼠残基增加抗体引发人抗小鼠抗体(hama)反应的风险。可以进行领域认可的确定免疫反应的方法，以在特定患者中或在临床试验期间监测hama反应。施用人源化抗体的患者可以在所述疗法的开始和整个施用过程中被给予免疫原性评估。例如，通过使用本领域技术人员已知的方法(包括表面等离子体共振技术(biacore)和/或固相elisa分析)检测来自患者的血清样品中人源化治疗试剂的抗体来测量hama反应。在许多实施方式中，受试者人源化抗体基本上不会在人受试者中引发hama反应。
[0129]
来自人可变区框架残基的某些氨基酸基于它们对cdr构象和/或结合至抗原的可能影响被选择用于取代。鼠cdr区与人可变框架区的不自然并置可导致非自然构象约束，除非通过取代某些氨基酸残基进行校正，否则其会导致结合亲和力的丧失。用于取代的氨基酸残基的选择可以部分地通过计算机建模来确定。用于产生免疫球蛋白分子的三维图像的
计算机硬件和软件是本领域已知的。通常，分子模型是从免疫球蛋白链或其结构域的解析结构中开始产生的。将要建模的链与解析的三维结构的链或结构域的氨基酸序列相似性进行比较，并且选择显示最大序列相似性的链或结构域作为分子模型构建的起点。选择共享至少50％序列同一性的链或结构域用于建模，并且优选地选择共享至少60％、70％、80％、90％序列同一性或更高的那些用于建模。对解析的起始结构进行修饰，以允许正在建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的那些之间的差异。然后将修饰的结构组装成复合免疫球蛋白。最后，模型通过能量最小化和通过验证所有原子在彼此之间的适当距离之内以及键长和键角在化学可接受的限制之内来进行改进。
[0130]
当框架残基(如由前述kabat,定义的)构成结构环残基(如由前述chothia定义的)时，存在于小鼠抗体中的氨基酸可以被选择用于取代成人源化抗体。“邻近cdr区”的残基包括在人源化免疫球蛋白链的一级序列中紧邻一个或多个cdr的位置，例如，在紧邻如由kabat定义的cdr，或如由chothia定义的cdr的位置(参见例如，chothia和lesk jmb 196:901(1987))的氨基酸残基。这些氨基酸特别地可能与cdr中的氨基酸相互作用，并且如果从受体中选择，可能扭曲供体cdr并降低亲和力。此外，相邻的氨基酸可以直接与抗原相互作用(amit等，science,233:747(1986))，并且从供体中选择这些氨基酸可以是期望的，以保持所有在原始抗体中提供亲和力的抗原接触。
[0131]
在一些实施方式中，主题抗体包括scfv多聚体。例如，在一些实施方式中，主题抗体是scfv二聚体(例如，包括两个串联scfv(scfv2))、scfv三聚体(例如，包括三个串联scfv(scfv3))、scfv四聚体(例如，包括四个串联scfv(scfv4))，或者是多于四个scfv的多聚体(例如，串联)。scfv单体可以经由长度为约2个氨基酸至约10个氨基酸，例如长度为2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa或10aa的连接子串联连接。合适的连接子包括，例如(gly)
x
，其中x是2至10的整数，甘氨酸-丝氨酸聚合物等。
[0132]
在某些实施方式中，抗体经由可裂解的或不可裂解的连接子与剂共轭。适合用于主题抗体的连接子包括“柔性连接子”。如果存在，连接子分子通常具有足够的长度以允许在连接的区之间一些柔性移动。连接子分子一般长约6-50个原子。连接子分子也可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。鉴于本公开，可以使用可结合至多肽的其他连接子分子。
[0133]
根据一些实施方式，连接子是化学不稳定的连接子，诸如酸可裂解的连接子，其在中性ph(血流ph 7.3-7.5)是稳定的，但在内化为靶细胞(例如，癌细胞)的弱酸性内涵体(ph 5.0-6.5)和溶酶体(ph 4.5-5.0)时经历水解。化学不稳定的连接子包括但不限于基于腙的连接子、基于肟的连接子、基于碳酸盐的接头、基于酯的连接子等。在某些实施方式中，连接子是酶不稳定的连接子，诸如是这样的酶不稳定的连接子，其在血流中是稳定的，但在内化为靶细胞时经历酶解，例如，通过靶细胞(例如癌细胞)的溶酶体中的溶酶体蛋白酶(诸如组织蛋白酶或纤溶酶)。酶不稳定的连接子包括但不限于包含肽键的连接子，例如基于二肽的连接子，诸如缬氨酸-瓜氨酸(vc)连接子，诸如马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄基(mc-vc-pab)连接子、缬氨酰-丙氨酰-对-氨基苄氧基(val-ala-pab)连接子等。
[0134]
在一些实施方式中，主题抗体包括免疫球蛋白的恒定区(例如，fc区)。fc区(如果存在)可以是人fc区。如果存在恒定区，抗体可以包含轻链和重链恒定区。本文中描述的抗体包括具有所有类型的恒定区的抗体，其包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何同种型，其
包括igg1、igg2、igg3和igg4。合适的重链fc区的实例是人同种型igg1 fc。轻链恒定区可以是λ或κ。主题抗体(例如，受试者人源化抗体)可以包括来自多于一个类别或同种型的序列。抗体可以表示为包含两条轻链和两条重链的四聚体，表示为单独的重链、轻链，表示为fab、fab’、f(ab’)2和fv，或表示为单链抗体，其中重链和轻链可变结构域通过间隔区连接。
[0135]
在一些实施方式中，本公开的抗muc1抗体可以包括fc区引入fc区的一种或多种氨基酸取代。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸取代可以处于fc区中的位置239、298、326、330和332。在一些实施方式中，本公开的抗muc1抗体可以包括引入fc区的以下氨基酸取代中的一种或多种：i332e；s239d/a330l/i332e；s239d/s298a/i332e；s239d/k326t/i332e；s239d/s298a/k326t/i332e；或s239d/a330l/i332e/d356e/l358m。
[0136]
在一些实施方式中，主题抗体在羧基末端包括游离巯基(-sh)基团，其中游离巯基可用于将抗体附着到第二多肽(例如，另一个抗体，包括主题抗体)、支架、载体等。
[0137]
在一些实施方式中，主题抗体包括一种或多种非天然存在的氨基酸。在一些实施发生中，非天然编码的氨基酸包括羰基、乙酰基、氨基氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。包含非天然存在的氨基酸可以提供与聚合物、第二多肽、支架等的连接。此类非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于n-乙酰葡糖胺基-l-丝氨酸、n-乙酰葡糖胺基-l-苏氨酸和o-磷酸酪氨酸。
[0138]
本公开还提供了具有感兴趣的附着部分(例如可检测的标记、药物、半衰期延长部分等)的抗muc1抗体。抗体的修饰可以通过各种合成和/或重组方法完成。附着于抗体的一个部分或多个部分可以提供各种功能或特征中的一种或多种。示例性部分包括可检测的标记(例如，染料标记(例如，发色团、荧光团)、生物物理探针(自旋标记、核磁共振(nmr)探针)、荧光共振能量转移(fret)型标记(例如，fret对的至少一个成员，包括荧光团/淬灭物对的至少一个成员)、生物发光共振能量转移(bret)型标记(例如，bret对的至少一个成员)、免疫可检测标签(例如，flag、his(6)等)、水溶性聚合物(例如聚乙二醇化)、纯化标签(例如，以促进通过亲和色谱进行分离(例如，flag表位的附着)、膜定位结构域(例如，脂质或糖基磷脂酰肌醇(gpi)型锚定)、固定标签(例如，以促进多肽至表面的附着，包括选择性附着)、药物(例如，以促进药物靶向，例如，通过药物至抗体的附着)等等。
[0139]
在一些实施方式中，主题抗体与聚合物(例如，多肽以外的聚合物)连接(例如，共价连接)。合适的聚合物包括，例如，生物相容性聚合物和水溶性生物相容性聚合物。合适的聚合物包括合成聚合物和天然存在的聚合物。合适的聚合物包括，例如，取代的或未取代的直链或支链聚亚烷基(polyalkylene)、聚亚烯基(polyalkenylene)或聚氧化烯聚合物或支化或非支化多糖，例如同多糖或杂多糖。合适的聚合物包括，例如，乙烯乙烯醇共聚物(通常以通用名称evoh或商品名eval已知)；聚甲基丙烯酸丁酯；聚(羟基戊酸酯)；聚(l-乳酸)；聚己内酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚(羟丁酸)；聚(羟丁酸-共-戊酸酯)；聚二噁烷酮；聚原酸酯；聚酸酐；聚(乙醇酸)；聚(d,l-乳酸)；聚(乙醇酸-共-三甲烯碳酸酯)；聚磷酸酯；聚磷酸酯尿烷；聚(氨基酸)；氰基丙烯酸酯；聚(三甲烯碳酸酯)；聚(亚氨基碳酸酯)；共聚(醚-酯)(例如，聚(环氧乙烷)-聚(乳酸)(peo/pla)共聚物)；聚亚烷基草酸盐；聚磷腈；生物分子，诸如纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维素、淀粉、胶原蛋白和透明质酸；聚氨酯；硅酮；聚酯；聚烯烃；聚异丁烯和乙烯-α烯烃共聚物；丙烯酸聚合物和共聚物；乙烯基卤化物聚合物和共聚物，诸如聚氯乙烯；聚乙烯醚，诸如聚乙烯基甲醚；聚亚乙烯基卤化物，诸如聚偏二氟乙烯和聚偏
二氯乙烯；聚丙烯腈；聚乙烯酮；聚乙烯芳烃，诸如聚苯乙烯；聚乙烯酯，诸如聚乙烯乙酸酯；乙烯基单体彼此和烯烃的共聚物，诸如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、abs树脂和乙烯-乙烯乙酸酯共聚物；聚酰胺，诸如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂；聚碳酸酯；聚甲醛；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂；聚氨酯；人造丝；三乙酸人造丝；纤维素；乙酸纤维素；丁酸纤维素；乙酸丁酸纤维素；玻璃纸；硝酸纤维素；丙酸纤维素；纤维素醚；无定形teflon；聚(乙二醇)和羧甲基纤维素。
[0140]
合适的合成聚合物包括未取代和取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)及其衍生物，例如取代的聚(乙二醇)诸如甲氧基聚(乙二醇)及其衍生物。合适的天然存在的聚合物包括，例如，白蛋白、直链淀粉、葡聚糖、糖原及其衍生物。
[0141]
合适的聚合物可以具有在500da至50000da的范围内的平均分子量，例如，从5000da至40000da，或从25000至40000da。例如，在一些实施方式中，其中主题抗体包括聚(乙二醇)(peg)或甲氧基聚(乙二醇)聚合物，peg或甲氧基聚(乙二醇)聚合物可以具有在从约0.5千道尔顿(kda)至1kda、从约1kda至5kda、从5kda至10kda、从10kda至25kda、从25kda至40kda或从40kda至60kda的范围内的分子量。
[0142]
在一些实施方式中，主题抗体与peg聚合物共价连接。在一些实施方式中，受试者scfv多聚体与peg聚合物共价连接。适合于与蛋白质共轭的peg在室温下通常溶于水，并且具有通式r(o-ch
2-ch2)no-r，其中r是氢或保护基诸如烷基或烷醇基，并且其中n是从1至1000的整数。其中r是保护基，它通常具有1至8个碳。共轭于主题抗体的peg可以是线性的或支化的。支化的peg衍生物包括星-peg的(star-peg’s)和多臂peg的(multi-armed peg’s)。
[0143]
主题抗体可以是糖基化的，例如，主题抗体可以包括共价连接的碳水化合物或多糖部分。抗体的糖基化通常为n-连接的或o-连接的二者其一。通过改变氨基酸序列使得其包含n-或o-连接的糖基化位点来方便地完成将糖基化位点添加到抗体。类似地，糖基化位点的去除可以通过在抗体的天然糖基化位点内的氨基酸改变来完成。
[0144]
主题抗体可以使用例如戊二醛、同双官能团交联剂或异双官能团交联剂共价连接到第二部分(例如，脂质、主题抗体以外的多肽、合成聚合物、碳水化合物等)。戊二醛通过它们的氨基部分交联多肽。同双官能团交联剂(例如，同双官能酰亚胺酯、同双官能团n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)酯或同双官能团巯氢基反应性交联剂)含有两个或多个相同的反应性部分，并且可用于一步反应过程，其中交联剂被添加到含有待连接的多肽的混合物的溶液中。同双官能团nhs酯和酰亚胺酯交联含有多肽的胺。在温和的碱性ph中，酰亚胺酯仅与伯胺反应以形成酰亚胺酰胺(imidoamide)，并且交联的多肽的总电荷不受影响。同双官能团巯氢基反应性交联剂包括双马来酰亚胺己烷(bmh)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯(dfdnb)和1,4-二-(3’,2
’‑
二硫基吡啶)丙酸酰氨基丁烷(dpdpb)。
[0145]
异双官能团交联剂具有两种或多种不同的反应性部分(例如，胺反应性部分和巯氢基反应性部分)，并且经由胺或巯氢基反应性部分与多肽的一个交联，然后经由未反应的部分与另一个多肽反应。多种异双官能团卤代乙酰基交联剂是可用的，吡啶基二硫交联剂也是如此。碳二亚胺是异双官能交联试剂的典型实例，用于将羧基与胺偶联，这产生酰胺键。
[0146]
主题抗体可以固定在固体支持物上。合适的支持物是本领域众所周知的，并且尤其包括商业可得的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表
面、硝酸纤维素条(nitrocellulose strip)、尼龙膜、片材、duracyte、反应托盘的孔(例如，多孔板)、塑料管等。固体支持物可以包括多种物质中的任何一种，包括例如玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。将主题抗体固定到固体支持物的合适方法是众所周知的，并且包括但不限于离子、疏水、共价相互作用等。固体支持物可以是可溶的或不溶的，例如，在水性溶液中。在一些实施方式中，合适的固体支持物通常不溶于水性溶液。
[0147]
主题抗体在一些实施方式中可以包括可检测标记。合适的可检测标记包括通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的任何组合物。合适的包括但不限于磁珠(例如，dynabeadstm)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶以及通常用于酶联免疫吸附试验(elisa)的其它酶)以及比色标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
[0148]
在一些实施方式中，主题抗体包括造影剂或放射性同位素，其中造影剂或放射性同位素是适合于用作可检测标记的物质，例如，在成像中，例如，对人进行的成像程序。标记的非限制性实例包括放射性同位素诸如
1231
i(碘)、
18
f(氟)、
99
tc(锝)、
111
in(铟)和
67
ga(镓)，以及造影剂诸如钆(gd)、镝和铁。放射性gd同位素(
153
gd)也是可用的，并且适用于非人哺乳动物中的成像程序。
[0149]
可以与主题抗体连接的合适的荧光蛋白包括但不限于来自维多利亚多管发光水母(aequoria victoria)的绿色荧光蛋白或其突变体或衍生物，增强型gfp，许多此类gfp是商业可得的，例如，从clontech,inc.；红色荧光蛋白；黄色荧光蛋白；来自珊瑚纲(anthozoan)物种的各种荧光和有色蛋白质中的任何一种等等。
[0150]
主题抗体在一些实施方式中将包括“不透射线”标记，例如可以使用例如x射线容易地可视化的标记。不透射线材料对本领域技术人员是众所周知的。最常见的不透射线材料包括碘化盐、溴化盐或钡盐。其它不透射线材料也是已知的，并且包括但不限于有机铋衍生物、不透射线多聚氨酯橡胶、有机铋(organobismuth)复合物、不透射线钡多聚体复合物等。
[0151]
主题抗体在一些实施方式中将与融合伴侣(例如配体；表位标签；肽；抗体以外的蛋白质等等)连接(例如，共价或非共价连接)。合适的融合伴侣包括具有下述特性的肽和多肽：赋予增强的体内稳定性(例如，增强的血清半衰期)；提供易于纯化等；提供来自细胞的融合蛋白的分泌；提供表位标签，例如(his)n，例如6his等；提供来自细胞的融合蛋白的分泌；提供表位标签，例如gst，血凝素(ha；例如cypydvpdya；seq id no:35)，flag(例如，dykddddk；seq id no:36)，c-myc(例如，ceqkliseedl；seq id no:37)等；提供可检测的信号，例如产生可检测的产物的酶(例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶)或其本身可检测的蛋白质，例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等；提供多聚化，例如，多聚化结构域，诸如免疫球蛋白的fc部分；等等。
[0152]
在一些实施方式中，主题抗体包括多胺修饰。主题抗体可以用天然存在的或合成的多胺进行修饰。有用的天然存在的多胺包括腐胺、亚精胺、精胺、1,3-脱氨基丙烷、降亚精胺(norspermidine)、对称篙精脒(syn-homospermidine)、热胺(thermine)、热精胺、嗜热性五胺(caldopentamine)、高嗜热性五胺(homocaldopentamine)和刀豆四胺(canavalmine)。
腐胺、亚精胺和精胺特别地有用。合成多胺包括经验式c
xhy
nz，可以是环状或无环状、支化或非支化、3-12个碳原子的烃链，进一步包括1-6nr或n(r)2部分，其中r是h、(c
1-c4)烷基、苯基或苄基。多胺可以使用任何标准的交联方法与抗体连接。
[0153]
在本公开的抗muc1抗体包括共价连接的异源部分的情况下，该异源部分可以直接或经由连接子连接到抗muc1重链和/或轻链。合适的连接子可以容易地选择并且可以具有任何合适的不同长度，诸如从1个氨基酸(例如，gly)至20个氨基酸、从2个氨基酸至15个氨基酸、从3个氨基酸至12个氨基酸(包括4个氨基酸至10个氨基酸)，5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
[0154]
柔性连接子的实例包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如(gs)n、(gsggs)n(seq id no:21)和(gggs)n(seq id no:22)，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、以及本领域已知的其它柔性连接子。
[0155]
修饰抗体的方法
[0156]
抗体可以通过使用多种方法中的任何一种进行修饰以具有共价连接的异源部分(例如，可检测的标记、药物等)。本公开提供了与感兴趣的部分共轭的抗muc1抗体，其中与感兴趣的部分共轭的抗muc1抗体被称为“抗muc1抗体共轭物”。本公开的抗muc1抗体共轭物可以包括：1)与感兴趣的部分共轭的ig重链恒定区；以及与感兴趣的部分共轭的ig轻链恒定区；2)与感兴趣的部分共轭的ig重链恒定区；以及未与感兴趣的部分共轭的ig轻链恒定区；或3)未与感兴趣的部分共轭的ig重链恒定区；以及与感兴趣的部分共轭的ig轻链恒定区。受试者抗muc1抗体共轭物还可以包括与感兴趣的部分共轭的vh和/或vl结构域。
[0157]
在一个实例中，抗体可以被修饰为包括2-甲酰甘氨酸残基，其可充当用于附着异源部分的化学手柄。例如，本公开的抗muc1的重链和/或轻链恒定区可以被修饰为包括硫酸酯酶基序的氨基酸序列，所述硫酸酯酶基序能够通过2-甲酰甘氨酸生成酶(fge)的作用转化为含有2-甲酰甘氨酸(fgly)。此类硫酸酯酶基序在本文中也可以被称为fge修饰位点。fge的作用以序列特异方式被定向，其中fge作用于位于免疫球蛋白多肽内的硫酸酯酶基序。感兴趣的部分被提供为反应性伴侣的组分，用于与标记的ig多肽的转化的醛标签的fgly残基的醛反应。可以使用多种多样商业可得的试剂来完成将感兴趣的部分附着于醛标记的ig多肽的fgly残基。例如，许多感兴趣的部分的氨基氧基、酰肼或氨基硫脲衍生物是合适的反应性伴侣，并且容易获得或者可以使用标准化学方法生成。
[0158]
例如，为了将聚(乙二醇)(peg)部分附着于标记的ig多肽，可以使用标准方案从单氨基peg和氨基氧基甘氨酸中生成氨基氧基-peg。然后可以将氨基氧基-peg与转化的(例如，fgly修饰的)醛标记的ig多肽反应，以提供peg部分的附着。可以使用氨基氧基生物素、生物素酰肼或2,4二硝基苯肼完成将生物素部分递送到转化的醛标记的多肽。
[0159]
醛标签的最小硫酸酯酶基序长度通常为5或6个氨基酸残基，长度通常不超过6个氨基酸残基。ig多肽中提供的硫酸酯酶基序为至少5或6个氨基酸残基，并且例如，可以为从5至16、6-16、5-15、6-15、5-14、6-14、5-13、6-13、5-12、6-12、5-11、6-11、5-10、6-10、5-9、6-9、5-8或6-8个氨基酸残基，以便限定长度小于16、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸残基的硫酸酯酶基序。在某些实施方式中，使用的硫酸酯酶基序可由下式描述：
[0160]
x1z1x2z2x3z3(seq id no:29)(i)，其中
[0161]
z1是半胱氨酸或丝氨酸(其也可以用(c/s)表示)；
[0162]
z2是脯氨酸或丙氨酸残基二者其一(其也可以用(p/a)表示)；
[0163]
z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(r)，并且可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，通常是赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，通常为a、g、l、v或i)；
[0164]
x1存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，尽管通常是脂肪族氨基酸，含硫氨基酸，或极性、不带电荷的氨基酸(即，芳香族氨基酸或带电荷的氨基酸除外)，通常为l、m、v、s或t，更通常为l、m、s或v，但条件是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n-末端时，x1存在；以及
[0165]
x2和x3独立地可以是任何氨基酸，尽管通常是脂肪族氨基酸，极性、不带电荷的氨基酸，或含硫的氨基酸(即，芳香族氨基酸或带电荷的氨基酸除外)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g。在一个实例中，醛标签为式l(c/s)tpsr(seq id no:5)，例如lctpsr(seq id no:6)或lstpsr(seq id no:23)。因此，本公开提供了包括醛标记的ig重链和/或醛标记的ig轻链的抗体，其中醛标记的ig抗体包括含有此类硫酸酯酶基序的重链和/或轻链的ig恒定区氨基酸序列。
[0166]
一般而言，根据醛标签中存在的硫酸酯酶基序来选择用于促进目标多肽的醛标签的硫酸酯酶基序中半胱氨酸或丝氨酸转化为fgly的fge。fge可以产自于其中表达醛标记的多肽的宿主细胞，或者宿主细胞可以被转基因以表达适当的fge。在一些实施方式中，可期望使用与人fge相容的硫酸酯酶基序，并在表达fge的人细胞中或宿主细胞(通常是哺乳动物细胞(转基因以表达人fge))中表达醛标记的蛋白。一般而言，适合用于生成fgly修饰的抗体的fge可以从天然存在的来源中获得或者合成生产。例如，适当的fge可以来源于自然产生fge的生物来源，或者被转基因以表达编码fge的重组基因的生物来源。编码许多fge的核酸是本领域已知的并且是容易地。
[0167]
随着fge对硫酸酯酶基序的作用，z1被氧化以产生2-甲酰甘氨酸(fgly)残基。此外，随着fge介导的转化和与包括感兴趣的部分的反应性伴侣反应，上述式中z1处的fgly位置与感兴趣的部分(例如，可检测的标记、水溶性聚合物、多肽、药物等)共价结合。因此，本公开提供了修饰为包括fgly部分的抗muc1抗体，其中抗muc1抗体包括下式的fgly转化的硫酸酯酶基序：
[0168]
x1(fgly)x2z2x3z3(seq id no:30)，其中：
[0169]
x1存在或不存在，并且当存在时，为任何氨基酸，条件是当硫酸酯酶基序位于多肽的n-末端时，x1存在；
[0170]
x2和x3各自独立地为任何氨基酸；以及
[0171]
z2是脯氨酸或丙氨酸残基二者其一(其也可以用(p/a)表示)；
[0172]
z3是碱性氨基酸；并且
[0173]
其中，fgly修饰的抗muc1抗体在折叠状态时将fgly基团呈现在溶剂可及表面上。在一些实施方式中，fgly转化的硫酸酯酶基序为式l(fgly)tpsr(seq id no:24)。
[0174]
如上所述，修饰为包括fgly部分的受试者抗muc1抗体可以进一步被修饰为包括经由fgly部分共价结合到抗muc1抗体的感兴趣的异源部分(例如，可检测的标记、水溶性聚合物、多肽、药物等)。因此，本公开提供了抗muc1抗体共轭物(本文也称为“抗muc1共轭物”)，该抗muc1共轭物包括：
[0175]
x1(fgly’)x2z2x3z3(seq id no:31)(i’)，其中
[0176]
fgly’是具有共价附着部分的2-甲酰甘氨酸残基；
[0177]
z2是脯氨酸或丙氨酸残基二者其一(其也可以用(p/a)表示)；z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(r)，并且可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，通常是赖氨酸)，或者脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，通常是a、g、l、v或i)；
[0178]
x1可以存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，尽管通常是脂肪族氨基酸，含硫氨基酸，或极性、不带电荷的氨基酸(即，芳香族氨基酸或带电荷的氨基酸除外)，通常是l、m、v、s或t，更通常是l、m或v，条件是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n-末端时，x1存在；并且x2和x3可以独立地是任何氨基酸，尽管通常是脂肪族氨基酸，含硫氨基酸，或极性、不带电荷的氨基酸(即，芳香族氨基酸或带电荷的氨基酸除外)，通常是s、t、a、v、g或c，更通常是s、t、a、v或g。在一些实施方式中，基序为式l(fgly’)tpsr(seq id no:25)。
[0179]
药物
[0180]
在一些情况下，本公开的抗muc1抗体包括与抗体的重链和/或轻链共价连接的药物。“药物”包括小分子药物、肽类药物、毒素(例如细胞毒素)等。
[0181]
本文中使用的“小分子药物”指的是化合物，例如有机化合物，其表现出感兴趣的药物活性，并且其分子量通常不大于约800da，或不大于2000da，但可以包含达至5kda的分子并且可以大至约10kda。小的无机分子指的是不含碳原子的分子，然而小的有机分子指的是含有至少一个碳原子的化合物。
[0182]
本文中使用的“肽药物”指的是含有氨基酸的聚合化合物，并且意指包含天然存在的和非天然存在的肽、寡肽、环肽、多肽和蛋白质以及肽模拟物。肽药物可以通过化学合成获得或从基因编码的来源(例如，重组来源)产生。肽药物的分子量可以变化，并且分子量可以是从200da至10kda或更大。
[0183]
在一些情况下，药物是毒素，例如细胞毒素。核糖体失活蛋白(rip)是此类细胞毒素的实例，其是高等植物中普遍存在的一类蛋白质。合适的细胞毒素包括但不限于蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(例如pe35、pe37、pe38、pe40等)、皂草毒、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白(pap)、肉毒杆菌毒素、异株泻根毒蛋白、苦瓜定和bouganin。
[0184]
在一些情况下，药物是癌症化疗剂。癌症化疗剂包括减少癌细胞增殖的非肽类(即非蛋白质的)化合物，并且包括细胞毒素剂和细胞生长抑制剂。化疗剂的非限制性实例包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。也可以使用肽类化合物。
[0185]
合适的癌症化疗剂包括海兔毒素及其活性类似物和衍生物；和澳瑞他汀及其活性类似物和衍生物。合适的癌症化疗剂还包括美登素类化合物及其活性类似物和衍生物；和倍癌霉素及其活性类似物和衍生物。
[0186]
发挥作用以减少细胞增殖的剂是本领域已知的并被广泛使用。此类剂包括烷化剂，诸如氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(cytoxantm)、美法仑(l-sarcolysin)、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、司莫司汀(甲基-ccnu)、链脲菌素、氯佐霉素、乌拉莫司汀、氮芥(chlormethine)、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚安三嗪、三亚乙基硫代磷酰胺、
白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
[0187]
抗代谢剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(cytosar-u)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷(fudr)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-mp)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-fu)、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-二氮杂叶酸(dideazafolate)(pddf,cb3717)、5,8-二氮杂四氢叶酸(dideazatetrahydrofolic acid)(ddathf)、亚叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他汀和吉西他滨。
[0188]
合适的天然产物及其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于ara-c、紫杉醇多西他赛脱氧助间型霉素、丝裂霉素-c,l-天门冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布喹那；生物碱，例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素，例如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素，例如蒽环霉素、盐酸柔红霉素(道诺霉素、红比霉素、正定霉素)、伊达比星、多柔比星、表柔比星和吗啉衍生物等；吩噁嗪双环肽，例如放线菌素；碱性糖肽，例如博来霉素；蒽醌甙，例如普卡霉素(光神霉素)；蒽二酮类，例如米托蒽醌；氮丙啶吡咯并吲哚二酮类药物(azirinopyrrolo indolediones)，例如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如环孢素、fk-506(他克莫司、普乐可复)、雷帕霉素等；等等。
[0189]
其他抗增殖细胞毒素剂是诺维本(navelbene)、cpt-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、雷洛昔芬、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬(droloxafine)。
[0190]
具有抗增殖活性的微管影响剂也适于使用，并且包括但不限于别秋水仙碱(nsc 406042)、软海绵素b(nsc 609395)、秋水仙碱(nsc 757)、秋水仙碱衍生物(例如nsc 33410)、海兔毒素10(nsc 376128)、美登素(nsc153858)、根霉素(nsc 332598)、紫杉醇衍生物、多西他赛硫代秋水仙碱(nsc 361792)、三苯甲基半胱氨酸(trityl cysterin)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、天然和合成的埃博霉素，包括但不限于埃博霉素a、埃博霉素b、圆皮海绵内酯；雌莫司汀、诺考达唑等。
[0191]
适于使用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松、地塞米松等；雌激素和孕激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌二醇、克罗米酚、泰莫西芬等；和肾上腺皮质抑制剂，例如氨鲁米特；17α-乙炔雌二醇；己烯雌酚、睾酮、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、甲泼尼龙、甲基睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺(drogenil)、托瑞米芬(fareston)和雌激素刺激增殖和分化；因此，与雌激素受体结合的化合物用于阻断这种活性。
[0192]
其他合适的化疗剂包括金属络合物，例如顺铂(顺式-ddp)、卡铂等；尿素，例如羟基脲；和肼，例如n-甲基肼；表鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂；甲基苄肼；米托蒽醌；亚叶酸；替加氟等。其他感兴趣的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如霉酚酸、沙利度胺、脱氧精胍菌素、氮杂孢菌素(azasporine)、来氟米特、咪唑立宾、azaspirane(skf 105685)；(zd1839，4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
[0193]
紫杉醇类适于使用。“紫杉醇类”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉醇类衍生物或前药。“紫杉醇”(其在本文中应理解为包括类似物、制剂和衍生物，诸如，例如，多西他赛、
taxol
tm
、taxotere
tm
(多西他赛的制剂)、紫杉醇的10-去乙酰基类似物和紫杉醇的3’n-去苯甲酰基-3’n-叔-丁氧羰基类似物)可容易地利用本领域技术人员已知的技术制备(另参见wo94/07882、wo 94/07881、wo 94/07880、wo 94/07876、wo 93/23555、wo93/10076；美国专利号5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529；和ep 590,267)，或从各种商业来源中获得的，包括例如sigma chemical co.,st.louis,mo.(来自短叶红豆杉的t7402；或t-1912来自云南红豆杉(taxus yannanensis))。
[0194]
紫杉醇应被理解为不仅指紫杉醇的常见化学可用形式，还指类似物和衍生物(例如，如上所述的taxotere
tm
多西他赛)和紫杉醇偶联物(例如，紫杉醇-peg、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
[0195]
术语“紫杉醇类”中还包括的是各种已知的衍生物，包括亲水衍生物和疏水衍生物。紫杉醇类衍生物包括但不限于半乳糖和甘露糖衍生物；哌嗪和哌嗪衍生物。
[0196]
产生抗体的方法
[0197]
主题抗体可以通过任何已知方法产生，例如，用于蛋白质合成的常规合成方法；重组dna方法等。
[0198]
在主题抗体是单链多肽的情况下，其可以使用标准化学肽合成技术来合成。在多肽是化学合成的情况下，合成可以经由液相或固相进行。固相多肽合成(spps)是用于主题抗体化学合成的合适方法的实例，其中序列的c-末端氨基酸附着于不溶性支持物上，然后依次添加序列中的剩余氨基酸。spps的各种形式(诸如fmoc和boc)可用于合成主题抗体。
[0199]
标准重组方法可用于主题抗体的产生。例如，将编码轻链和重链可变区的核酸(任选地连接到恒定区)插入到表达载体中。轻链和重链可以在相同或不同的表达载体中克隆。编码免疫球蛋白链的dna片段可操作地连接到表达载体中的控制序列，其确保免疫球蛋白多肽的表达。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然相关的或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞(例如cos或cho细胞)的载体中的真核启动子系统。一旦载体被整合入适当的宿主中，宿主就保持在适合核苷酸序列的高水平表达以及抗体的收集和纯化的条件下。
[0200]
由于密码子的简并性，多种核酸序列可以编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。期望的核酸序列可以通过从头固相dna合成或通过期望的多核苷酸的早期制备的变体的聚合酶链式反应(pcr)诱变来产生。
[0201]
合适的表达载体通常作为宿主染色体dna的附加体或作为组成部分二者其一在宿主生物体中复制。通常，表达载体包含选择标记(例如，氨苄西林抗性、潮霉素抗性、四环素抗药性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)，以允许检测用期望的dna序列转化的那些细胞。
[0202]
大肠杆菌是原核宿主细胞的实例，其可用于克隆编码主题抗体的多核苷酸。其他适于使用的微生物宿主包括杆菌(诸如枯草芽孢杆菌)以及其他肠杆菌科(诸如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和各种假单胞菌属物种)。其他微生物(诸如酵母)对表达也是有用的。酵母菌属(例如酿酒酵母)和毕赤酵母属是酵母宿主细胞的合适实例。
[0203]
除微生物外，哺乳动物细胞(例如，在体外细胞培养中生长的哺乳动物细胞)也可用于表达和产生本发明的多肽(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。合适的哺乳动物宿主细胞包括cho细胞系、各种cos细胞系、hela细胞、骨髓瘤细胞系和转化的b细胞或杂交瘤。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子和增强子，以
及必要的处理信息位点，诸如核糖体结合位点、rna剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。合适的表达控制序列的实例是源自免疫球蛋白基因、sv40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
[0204]
一旦合成(化学或重组二者其一)，整个抗体、它们的二聚体、单个轻链和重链、或其它形式的主题抗体(例如scfv等)可以根据本领域的标准程序进行纯化，本领域的标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、高效液相色谱(hplc)纯化、凝胶电泳等(一般参见scopes,protein purification(springer-verlag,n.y.,(1982))。主题抗体可以基本上是纯的，例如，至少约80％至85％纯、至少约85％至90％纯、至少约90％至95％纯、或98％至99％(或更多)纯，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除主题抗体以外的大分子等。
[0205]
组合物
[0206]
本公开提供了包括主题抗体的组合物。除主题抗体外，主题抗体组合物可以包括下述的一种或多种：盐，例如nacl、mgcl2、kcl、mgso4等；缓冲剂，例如tris缓冲液、n-(2-羟乙基)哌嗪-n
’‑
(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸钠盐(mes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、n-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)等；增溶剂；去污剂，例如非离子去污剂诸如吐温-20等；蛋白酶抑制剂；甘油；等等。
[0207]
核酸
[0208]
本公开提供了包括编码主题抗体的核苷酸序列的核酸。编码主题抗体的核苷酸序列可以可操作地连接到一个或多个调节元件(诸如启动子和增强子)，该调节元件允许核苷酸序列在预期的靶细胞(例如，被转基因以合成编码的抗体的细胞)中表达。
[0209]
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。对于在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于laci、lacz、t3、t7、gpt、lambda p和trc。对于在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒即时早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；来自逆转录病毒的长末端重复序列中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-i启动子；以及各种领域已知的组织特异性启动子。
[0210]
在一些实施方式中，例如，对于在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，诸如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等；或可调节的启动子，诸如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、pho5启动子、cup1启动子、gal7启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子，eno启动子、tp1启动子和aox1(例如，用于毕赤酵母属)。选择合适的载体和启动子完全在本领域普通技术人员的水平之内。
[0211]
用于原核宿主细胞的合适启动子包括但不限于噬菌体t7rna聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如，lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、t7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等。用于原核生物诸如大肠杆菌的合适的强启动子包括但不限于trc、tac、t5、t7和p
lambda
。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(laci阻遏蛋白在与乳糖接触时改变构象，从而阻止laci阻遏蛋白与操纵子结合)，色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸络合时，trpr阻遏蛋白具有结合操纵子的构象；在没有色氨酸的情况下，trpr阻遏蛋白具有不与操纵子结合的构象)，以及tac启动子操纵子。
[0212]
编码主题抗体的核苷酸序列可以存在于表达载体和/或克隆载体中。在主题抗体包括两个单独的多肽的情况下，编码两个多肽的核苷酸序列可以在相同或单独的载体中克隆。表达载体可以包括可选择的标记、复制起点以及提供载体的复制和/或维持的其他特征。
[0213]
大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多是商业可得的，用于生成受试者重组构建体。以下载体通过实例的方式提供。细菌的：pbs、phagescript、psix174、pbluescript sk、pbs ks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,la jolla,calif.,usa)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5(pharmacia,uppsala,sweden)。真核的：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。
[0214]
细胞
[0215]
本公开提供了用受试者核酸进行转基因的分离的转基因宿主细胞(例如体外细胞)。在一些实施方式中，受试者分离的转基因宿主细胞可以产生主题抗体。
[0216]
合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于hela细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(atcc)no.ccl-2)、cho细胞(atcc no.crl9618、ccl61、crl9096)、vero细胞、nih 3t3细胞(例如，atcc no.crl-1658)、huh-7细胞、bhk细胞(例如atcc no.ccl10)、pc12细胞(atcc no.crl1721)、cos细胞、cos-7细胞(atcc no.crl1651)、rat1细胞、小鼠l细胞(atcc no.ccli.3)、人胚胎肾(hek)293细胞(atcc no.crl1573)、hlhepg2细胞；等。
[0217]
合适的酵母细胞包括但不限于毕赤酵母(pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichia trehalophila)、pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(pichia membranaefaciens)、pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(pichia thermotolerans)、pichia salictaria、松栎毕赤酵母(pichia guercuum)、皮氏毕赤酵母(pichia pijperi)、pichia stiptis、甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、毕赤酵母属(pichia sp.)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、酵母属(saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属(kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、白假丝酵母(candida albicans)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、里氏木霉(trichoderma reesei)、chrysosporium lucknowense、镰刀菌属(fusarium sp.)、小麦赤霉病病菌(fusarium gramineum)、丝状镰刀菌(fusarium venenatum)、粗糙链孢霉(neurospora crassa)、莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)等。
[0218]
合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌、乳杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属等多种实验室菌株的任一种。
[0219]
药物组合物
[0220]
本公开提供了组合物，其包括包含主题抗体的药物组合物。一般而言，制剂包括有效量的主题抗体。“有效量”意指足以产生期望的结果(例如，癌细胞数量减少)的剂量。在一些情况下，与对照相比，期望的结果至少是恶性肿瘤症状的减少。
[0221]
制剂
[0222]
在主题方法中，主题抗体可以使用任何能够产生期望的治疗效果或诊断效果的方
便的方法将主题抗体施用于宿主。因此，可以将该剂并入用于治疗施用的各种制剂中。更具体地，主题抗体可以通过与适当的、药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。
[0223]
在药物剂型中，主题抗体可以以它们药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独使用、或与其它药学活性化合物适当联合以及组合使用。以下方法和赋形剂仅是示例性的，并且绝不是限制性的。
[0224]
对于口服剂型，主题抗体可以单独使用或与适当的添加剂组合使用，以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊，例如与常规添加剂组合，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合使用；与粘结剂，诸如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶组合使用；与分解剂，诸如玉米淀粉，马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合使用；与润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁组合使用；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合使用。
[0225]
主题抗体可以通过将它们溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(诸如植物油或其他类似油、合成脂肪族酸甘油酯、高级脂肪族酸或丙二醇的酯)中来配制成用于注射的剂型；并且如果需要，与常规添加剂，诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
[0226]
包括主题抗体的药物组合物通过将具有期望的纯度的抗体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张度剂混合来制备。可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接收者是无毒的，并且包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸和柠檬酸；防腐剂(诸如乙醇、苯甲醇、苯酚、间-甲酚、对-氯-间-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸诸如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其他碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如明胶或血清白蛋白；螯合剂，诸如edta；糖，诸如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡萄糖胺、n-甲基葡萄糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，诸如吐温、brij pluronics、triton-x或聚乙二醇(peg)。
[0227]
药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重构的液体形式，其中冻干剂型在施用之前用无菌溶液重构。重构冻干组合物的标准程序是加回许多纯水(通常相当于在冻干期间去除的体积)；然而，包括抗菌剂的溶液可用于生产用于肠胃外施用的药物组合物。
[0228]
受试者药物组合物中的示例性抗体浓度范围可从约1mg/ml至约200mg/ml或约50mg/ml至约200mg/ml，或约150mg/ml至约200mg/ml。
[0229]
抗体的水性制剂可以在ph缓冲溶液中制备，例如，在从约4.0至约7.0，或从约5.0至约6.0，或可选地约5.5的ph。适于在这个范围内的ph的缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和其他有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以是从约1mm至约100mm，或约5mm至约50mm，取决于例如缓冲液和制剂的所需张度。
[0230]
还可以添加冻干保护剂，以保护不稳定的活性成分(例如蛋白质)对抗在冻干过程
期间的不稳定条件。例如，已知的冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨醇和甘油)；和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。冻干保护剂可以以约10nm至500nm的量被包括。
[0231]
在一些实施方式中，受试者制剂包括主题抗体和一种或多种剂(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张度剂)并且基本上不含一种或多种防腐剂，诸如乙醇、苯甲醇、苯酚、间-甲酚、对-氯-间-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵及其组合。在其它实施方式中，防腐剂被包括在制剂中，例如，以浓度范围从约0.001至约2％(w/v)。
[0232]
例如，受试者制剂可以是适合用于肠胃外施用的液体或冻干制剂，并且可以包括：约1mg/ml至约200mg/ml的主题抗体；约0.001％至约1％的至少一种表面活性剂；约1mm至约100mm的缓冲液；任选地约10mm至约500mm的稳定剂；和约5mm至约305mm的张度剂；并且具有约4.0至约7.0的ph。
[0233]
作为另一个实例，受试者肠胃外制剂是液体或冻干制剂，包括：约1mg/ml至约200mg/ml的主题抗体；0.04％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm蔗糖；并且具有5.5的ph。
[0234]
本文中使用的术语“单位剂型”指的是适合作为人类和动物受试者的单一剂量的物理离散单位，每个单位含有以足以产生与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物关联的期望的效果的量计算的预定量的本发明化合物。主题抗体的规格可以取决于所采用的特定抗体和要达到的效果，以及与宿主中每种抗体相关的药效学。
[0235]
主题抗体可以作为可注射制剂施用。通常，可注射组合物被制备为液体溶液或悬浮液；在注射之前，也可以制备适合于在液体媒介物中溶解或在液体媒介物中悬浮的固体形式。该剂型也可以被乳化或者抗体被包封在脂质体媒介物中。
[0236]
药学上可接受的赋形剂，诸如媒介物、佐剂、载体或稀释剂对公众是容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，诸如ph调节和缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、润湿剂等，对公众是容易获得的。
[0237]
在一些实施方式中，主题抗体以控释制剂配制。缓释剂型可以使用本领域众所周知的方法制备。缓释剂型的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，其中基质呈成形物品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、l-谷氨酸和l-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、水凝胶、聚交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。通过使用适当的添加剂、通过控制含水量和通过开发特定的聚合物基质组合物，可以防止缓释剂型中包括的抗体的生物活性的可能损失和免疫原性的可能变化。
[0238]
物理系统包括但不限于具有速率控制膜的储存系统，诸如微型胶囊、大型胶囊和膜系统；没有速率控制膜的储存系统，诸如中空纤维、超微孔三乙酸纤维素以及多孔聚合物基底和泡沫；单片系统(monolithic system)，包括物理地溶解在无孔、聚合物或弹性基质中的那些系统(例如，不易受侵蚀的、易受侵蚀的、环境剂侵入和可降解的)，以及物理地分散在无孔、聚合物或弹性基质中的材料(例如，不易受侵蚀的、易受侵蚀的、环境剂侵入和可降解的)；分层结构，包括与外部控制层化学地相似或相异的储存层；以及其他物理方法，诸如渗透泵或吸附到离子交换树脂上。
[0239]
化学系统包括但不限于聚合物基质的化学侵蚀(例如，异质的或同质的侵蚀)，或聚合物基质的生物侵蚀(例如，异质的或同质的)。
[0240]
剂量
[0241]
合适的剂量可以由主治医师或其他合格的医务人员基于各种临床因素确定。正如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、患者的性别、施用时间和途径、一般健康状况和其他要同时施用的药物。主题抗体可以以每剂量在1ng/kg体重和20mg/kg体重之间，例如0.1mg/kg体重至10mg/kg体重之间，例如0.5mg/kg体重至5mg/kg体重之间的量施用；然而，设想低于或高于这个示例性范围的剂量，特别地考虑到上述因素。如果该方案是连续输注，它也可以在每分钟每公斤体重1μg至10mg的范围内。
[0242]
本领域技术人员将容易理解的是剂量水平可以根据具体抗体的功能、症状的严重程度和受试者对副作用的易感性而变化。给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种方法容易地确定。
[0243]
给药途径
[0244]
使用适合用于药物递送的任何可用的方法和途径(包括体内和离体方法)以及全身和局部施用途径将主题抗体施用至个体。
[0245]
常规和药学上可接受的施用途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、局部应用、静脉内、动脉内、直肠、鼻、口和其他肠内和肠胃外的施用途径。如果需要，可以根据抗体和/或期望的效果组合或调整施用途径。主题抗体组合物可以以单剂量或以多剂量施用。在一些实施方式中，主题抗体组合物口服施用。在一些实施方式中，主题抗体组合物经由吸入途径施用。在一些实施方式中，主题抗体组合物鼻内施用。在一些实施方式中，主题抗体组合物局部施用。在一些实施方式中，主题抗体组合物颅内施用。在一些实施方式中，主题抗体组合物静脉内施用。
[0246]
可以使用适合用于递送常规药物的任何可用的常规方法和途径将剂施用至宿主，包括全身性或局部途径。一般而言，由本发明所设想的施用途径包括但不必须限于肠内、肠胃外或吸入途径。
[0247]
除吸入施用以外的肠胃外施用途径包括但不必须限于局部、经皮、皮下、肌内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、肝内和静脉内途径，即除通过消化道以外的任何施用途径。肠胃外施用可以进行以实现主题抗体的全身性或局部递送。在需要全身性递送的情况下，施用通常涉及药物剂型的侵入性或全身性吸收的局部或粘膜施用。
[0248]
主题抗体也可以通过肠内施用递送至受试者。肠内施用途径包括但不必须限于口和直肠(例如，使用栓剂)递送。
[0249]
通过治疗意指至少改善与困扰宿主的病理学状况相关的症状，其中改善在广义上用于指与正被治疗的病理学状况(诸如乳腺癌、胰腺癌或肺癌)相关的参数(例如症状)的幅度中的至少减少。因此，治疗还包括其中病理学状况或至少与其相关的症状被完全抑制(例如阻止发生，或停止，例如终止)的情况，使得宿主不再遭受病理学状况或者至少表征病理学状况的症状。
[0250]
在一些实施方式中，主题抗体通过注射施用，例如，用于全身性递送(例如，静脉输注)或到达局部部位。
[0251]
各种宿主(其中术语“宿主”在本文中可与术语“受试者”、“个体”和“患者”互换使用)根据主题方法是可治疗的。通常，此类宿主是“哺乳动物(mammal)”或“哺乳动物
(mammalian)”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物类中的生物体，包括食肉目(例如，狗和猫)，啮齿目(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如，人、黑猩猩和猴子)。在一些实施方式中，宿主将是人。
[0252]
治疗方法
[0253]
本公开提供了治疗与muc1阳性细胞(例如，癌性muc1阳性细胞或自身反应性muc1阳性细胞)相关的或由其引起的疾病或病症的方法。
[0254]
治疗恶性肿瘤
[0255]
本公开提供了治疗恶性肿瘤(包括实体瘤或血液系统恶性肿瘤)的方法，该方法通常涉及主题抗体单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加的治疗剂组合(例如，在组合疗法中)向需要其的个体(例如，具有恶性肿瘤的个体)施用有效量的主题抗体。
[0256]
恶性肿瘤包括，例如，hcc、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、前淋巴细胞性白血病、肛门癌、阑尾癌、胆管癌(即肝胆管型肝癌)、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、原发性不明癌症(cup)、食道癌、眼癌、输卵管癌、胃肠病癌、肾癌、肝癌、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺疾病、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌等。
[0257]
在一些实施方式中，主题抗体的有效量是这样的量，当单独施用(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加治疗剂组合施用(例如，在组合疗法中)时，在一个或多个剂量中，与没有用抗体治疗的个体中癌细胞数量相比，该量有效减少个体中的癌细胞数量至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或更多。
[0258]
组合治疗
[0259]
在一些实施方式中，治疗恶性肿瘤的主题方法涉及施用主题抗体和一种或多种附加治疗剂。合适的附加治疗剂包括但不限于癌症化疗剂(如上所述)。
[0260]
适于治疗的受试者
[0261]
多种受试者适于用主题方法治疗。合适的受试者包括任何患有恶性肿瘤的个体(例如人)；被诊断患有恶性肿瘤的个体(例如人)；曾患有恶性肿瘤并具有恶性肿瘤复发风险的个体(例如人)；曾用受试者抗muc1抗体以外的剂治疗恶性肿瘤的个体(例如，曾用癌症化疗剂治疗的个体)并且对该剂无反应的个体(例如人)；或曾用受试者抗muc1抗体以外的剂治疗恶性肿瘤的个体(例如，曾用癌症化疗剂治疗的个体)(例如人)并且最初对该剂有反应但随后停止反应(例如复发)的个体(例如人)。
[0262]
检测方法
[0263]
本公开提供了涉及主题抗体的使用的各种检测方法。检测方法包括诊断方法、预后方法和监测方法。主题检测方法通常涉及检测muc1阳性细胞，例如癌细胞。
[0264]
在一些实施方式中，主题方法是诊断方法，例如，以确定个体是否患有恶性肿瘤。
[0265]
在一些实施方式中，主题方法是监测方法，例如，被诊断为患有恶性肿瘤并且正被治疗病症、被监测对治疗的反应和/或病症的进展/消退的个体。
[0266]
在一些情况下，主题检测方法涉及向个体施用本公开的可检测标记的抗muc1抗体；并检测抗体与个体中组织的结合。检测可以例如通过磁共振成像或其他合适的成像技
术来实现。
[0267]
在其他情况下，主题检测方法涉及将本公开的可检测标记的抗muc1抗体与从个体中获得的生物样品接触；并检测抗体与生物样品中分子的结合。
[0268]
抗muc1抗体可被直接或间接标记。间接标记包括包含可检测标记的二抗，其中二抗结合受试者抗muc1抗体。其他间接标记包括生物素，其中生物素化的抗muc1抗体可以使用包含可检测标记的亲和素或链霉亲和素来检测。
[0269]
合适的可检测标记包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的任何组合物。合适的包括但不限于磁珠(例如，dynabeads
tm
)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)、放射性标记物(例如，3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和酶联免疫吸附试验(elisa)中其它常用的酶)以及比色标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
[0270]
在一些实施方式中，主题抗体包括造影剂或放射性同位素，其中造影剂或放射性同位素是适合用于成像，例如在人上进行的成像程序的物质。标记的非限制性实例包括放射性同位素(诸如
1231
i(碘)、
18
f(氟)、
99
tc(锝)、
111
in(铟)和
67
ga(镓))以及造影剂(诸如钆(gd)、镝和铁)。放射性gd同位素(
153
gd)也是可用的，并且适用用于非人哺乳动物中的成像程序。主题抗体可以使用标准技术进行标记。例如，主题抗体可以使用氯胺t或1,3,4,6-四氯-3α,6α-脱苯基甘脲(dephenylglycouril)进行碘化。主题抗体也可以通过标准技术用造影剂进行标记。例如，主题抗体可以通过将低分子gd螯合物(诸如gd二亚乙基三胺五乙酸(gddtpa)或gd四氮杂环十二烷四乙酸(gddota)与抗体共轭来用gd标记主题抗体。主题抗体可以通过例如将聚赖氨酸-gd螯合物与抗体共轭来用gd标记主题抗体。可选地，主题抗体可以通过将包含gd螯合剂脂质的顺磁性聚合脂质体与亲和素和生物素化抗体孵育来用gd标记主题抗体。
[0271]
可以与主题抗体连接的合适的荧光蛋白包括但不限于来自维多利亚多管发光水母的绿色荧光蛋白或其突变体或衍生物，增强型gfp，许多此类gfp是商业可得的，例如，从clontech,inc.获得；红色荧光蛋白；黄色荧光蛋白；来自珊瑚虫物种的各种荧光和有色蛋白质中的任何一种；等等。
[0272]
本公开的非限制性方面的实例
[0273]
以上描述的本主题的方面(包括实施方式)可以单独受益或与一个或多个其它方面或实施方式组合受益。在不限制前述描述的情况下，以下提供了编号1-50的本公开的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的，每个单独编号的方面可以与任何前面或后面单独编号的方面一起使用或组合。这意在为所有此类方面的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面组合：
[0274]
1.一种特异地结合至粘蛋白-1(muc-1)并且与第二抗体竞争结合至muc-1的抗体，其包括：
[0275]
可变重(vh)链，其包括具有下述序列的vh链的重链cdr1-3(hcdr1-3)：
[0276]
evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdhtmhwikqrpgkglewmgyfyprddstnynekfkgrvtltadkstdtaymelsslrsedtavyycarglryaldywgqgtlvtvss(seq id no:1)；以及
[0277]
可变轻(vl)链，其包括具有下述序列的vl链的轻链cdr1-3(lcdr1-3)：
[0278]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiygtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyawspptfgqgtkleik(seq id no:2)；
[0279]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvgssnlywyqqkpgqaprlwiyrstklasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyrwspptfgqgtkleik(seq id no:3)；或
[0280]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiigtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyswspptfgqgtkleik(seq id no:4)。
[0281]
2.特异地结合至粘蛋白-1(muc-1)的抗体，该抗体包括：
[0282]
可变重(vh)链，其包括具有下述序列的vh链的重链cdr1-3(hcdr1-3)：
[0283]
evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdhtmhwikqrpgkglewmgyfyprddstnynekfkgrvtltadkstdtaymelsslrsedtavyycarglryaldywgqgtlvtvss(seq id no:1)；以及
[0284]
可变轻(vl)链，其包括具有下述序列的vl链的轻链cdr1-3(lcdr1-3)：
[0285]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiygtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyawspptfgqgtkleik(seq id no:2)；
[0286]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvgssnlywyqqkpgqaprlwiyrstklasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyrwspptfgqgtkleik(seq id no:3)；或
[0287]
eivltqspatlslspgeratlscrasssvsssylywyqqkpgqaprlwiigtsnlasgvparfsgsgsgtdytltisslepedaavyychqyswspptfgqgtkleik(seq id no:4)。
[0288]
3.方面1或方面2所述的抗体，其中vh多肽包括与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0289]
4.方面1-3中任一项所述的抗体，其中vl多肽包括与seq id no:2、3或4所示所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0290]
5.方面1-3中任一项所述的抗体，其中：
[0291]
根据kabat定义
[0292]
hcdr1包括氨基酸序列dhtmh(seq id no:17)；
[0293]
hcdr2包括氨基酸序列yfyprddstnynekfkg(seq id no:18)；
[0294]
hcdr3包括氨基酸序列glryaldy(seq id no:9)；
[0295]
lcdr1包括氨基酸序列rasssvg/sssyly(seq id no:41)；
[0296]
lcdr2包括氨基酸序列g/rt/ss/tn/klas(seq id no:42)；以及
[0297]
lcdr3包括氨基酸序列hqya/r/swsppt(seq id no:43)，；或者根据kabat定义
[0298]
lcdr1包括氨基酸序列rasssvsssyly(seq id no:10)；
[0299]
lcdr2包括氨基酸序列gtsnlas(seq id no:11)；以及
[0300]
lcdr3包括氨基酸序列hqyawsppt(seq id no:12)。
[0301]
6.方面1-3中任一项所述的抗体，其中根据kabat定义：
[0302]
hcdr1包括氨基酸序列dhtmh(seq id no:17)；
[0303]
hcdr2包括氨基酸序列yfyprddstnynekfkg(seq id no:18)；
[0304]
hcdr3包括氨基酸序列glryaldy(seq id no:9)；
[0305]
lcdr1包括氨基酸序列rasssvgssnly(seq id no:13)；
[0306]
lcdr2包括氨基酸序列rstklas(seq id no:14)；以及
[0307]
lcdr3包括氨基酸序列hqyrwsppt(seq id no:15)。
[0308]
7.方面1-3中任一项所述的抗体，其中根据kabat定义：
[0309]
hcdr1包括氨基酸序列dhtmh(seq id no:17)；
[0310]
hcdr2包括氨基酸序列yfyprddstnynekfkg(seq id no:18)；
[0311]
hcdr3包括氨基酸序列glryaldy(seq id no:9)；
[0312]
lcdr1包括氨基酸序列rasssvsssyly(seq id no:10)；
[0313]
lcdr2包括氨基酸序列gtsnlas(seq id no:11)；以及
[0314]
lcdr3包括氨基酸序列hqyswsppt(seq id no:16)。
[0315]
8.方面1-7中任一项所述的抗体，其中抗体是人源化抗体。
[0316]
9.方面1-8中任一项所述的抗体，其中抗体是嵌合抗体。
[0317]
10.方面1-9中任一项所述的抗体，其中抗体选自下述组成的组：igg、fv、单链抗体、scfv、fab、f(ab’)2或fab’。
[0318]
11.方面1-10中任一项所述的抗体，其中抗体是结合至muc1的抗体片段。
[0319]
12.方面1-10中任一项所述的抗体，其中抗体是igg。
[0320]
13.方面1-10中任一项所述的抗体，其中抗体是igg1。
[0321]
14.方面1-10中任一项所述的抗体，其中抗体是fab。
[0322]
15.方面1-10中任一项所述的抗体，其中抗体是单链抗体。
[0323]
16.方面1-10中任一项所述的抗体，其中抗体是scfv。
[0324]
17.方面1-16中任一项所述的抗体，其中抗体是包括特异地结合muc1的第一抗原结合结构域的双特异性抗体，并且其中第一抗原结合结构域包括如方面1至7中任一项所限定的vh链和vl链。
[0325]
18.方面1-17中任一项所述的抗体，其中抗体是可检测标记的。
[0326]
19.方面1-18中任一项所述的抗体，其中抗体包括共价连接的非肽合成聚合物。
[0327]
20.方面19所述的抗体，其中合成聚合物是聚(乙二醇)聚合物。
[0328]
21.方面1-19中任一项所述的抗体，其中抗体包括共价连接的脂质或脂肪酸部分。
[0329]
22.方面1-18中任一项所述的抗体，其中抗体包括共价连接的多糖或碳水化合物部分。
[0330]
23.方面1-22中任一项所述的抗体，其中抗体包括造影剂。
[0331]
24.方面1-23中任一项所述的抗体，其中抗体包括亲和结构域。
[0332]
25.方面1-24中任一项所述的抗体，其中抗体被固定在固体支持物上。
[0333]
26.方面1-25中任一项所述的抗体，其中抗体包括共价连接的细胞毒素。
[0334]
27.方面1-26中任一项所述的抗体，其中抗体包括包含硫酸酯酶基序的氨基酸序列的恒定区氨基酸序列。
[0335]
28.方面1-26中任一项所述的抗体，其中抗体包括包含硫酸酯酶基序的氨基酸序列的恒定区氨基酸序列，并且其中硫酸酯酶基序被修饰为包括2-甲酰甘氨酸(fgly)部分。
[0336]
29.方面28所述的抗体，其中抗体包括经由fgly部分共价连接至抗体的异源部分。
[0337]
30.方面29所述的抗体，其中异源部分选自药物、毒素、可检测标记、水溶性聚合物和合成肽。
[0338]
31.一种核酸，其编码方面1至17中任一项所述的抗体的可变重(vh)链、可变轻(vl)链或两者。
[0339]
32.方面31所述的核酸，其中抗体是单链抗体，并且其中核酸编码单链抗体。
[0340]
33.方面32所述的核酸，其中单链抗体是scfv。
[0341]
34.一种重组表达载体，其包括方面31-33中任一项所述的核酸，其中核酸可操作地连接至真核细胞中有活性的转录控制元件。
[0342]
35.一种细胞，其包括方面31至33中任一项所述的核酸或方面34所述的表达载体。
[0343]
36.方面35所述的细胞，其中核酸编码抗体的vh链和抗体的vl多肽。
[0344]
37.方面36所述的细胞，其中抗体是单链抗体，并且其中核酸编码单链抗体。
[0345]
38.方面37所述的细胞，其中单链抗体是scfv。
[0346]
39.一种细胞，其包括：
[0347]
编码方面1至17中任一项所述的抗体的可变重(vh)链的第一核酸；和
[0348]
编码抗体的可变轻(vl)链的第二核酸。
[0349]
40.方面39所述的细胞，其包括：
[0350]
包括第一核酸的第一表达载体；和
[0351]
包括第二核酸的第二表达载体。
[0352]
41.一种共轭物，其包括：
[0353]
方面1-17中任一项所述的抗体；和
[0354]
与抗体共轭的剂。
[0355]
42.方面41所述的共轭物，其中剂选自由下述组成的组：半衰期延长部分、标记剂和治疗剂。
[0356]
43.一种融合蛋白，其包括：
[0357]
方面1-17中任一项所述的抗体的可变重(vh)链、可变轻(vl)链或两者；融合至
[0358]
异源氨基酸序列。
[0359]
44.一种药物组合物，其包括：
[0360]
a)方面1-17中任一项所述的抗体；和
[0361]
b)药学上可接受的载体。
[0362]
45.一种药物组合物，其包括：
[0363]
a)方面41-42中任一项所述的共轭物；和
[0364]
b)药学上可接受的载体。
[0365]
46.一种药物组合物，其包括：
[0366]
a)方面43所述的融合蛋白；和
[0367]
b)药学上可接受的载体。
[0368]
47.方面44-46中任一项所述的药物组合物，进一步包括t细胞激活剂。
[0369]
48.方面47所述的药物组合物，其中t细胞激活剂选自由下述组成的组：免疫检查点抑制剂、细胞因子和抑制性免疫受体的拮抗剂。
[0370]
49.方面44-48中任一项所述的药物组合物，其中抗体被包封在脂质体中。
[0371]
50.一种治疗受试者中细胞增殖性病症的方法，该方法包括：
[0372]
向患有细胞增殖性病症的受试者施用治疗上有效量的方面44-49中任一项所述的药物组合物。
实施例
[0373]
提出下述实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制作和使用本发明的完整公开内容和说明，并且不意在限制发明人认为是他们的发明的范围，它们也不意在表示以下实验是所有或唯一进行的实验。已经作出努力以确保关于所使用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为按重量计的份数，分子量为加权平均分子量，温度以摄氏度为单位，以及压力为处于或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内(地)；i.p.，腹腔内(ly)；s.c.，皮下；等等。
[0374]
除非另有说明，否则实施例中提及的商业可得的试剂是根据制造商的说明书使用的。通过ecacc登记号在实施例和整个说明书中确定的细胞的来源是英国索尔兹伯里的欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)。除非另有限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。以下描述了示例性方法和材料，尽管与本文中描述的那些相似或等同的方法和材料也可用于本发明的实践或测试。材料、方法和实施例仅是说明性的并且不意在限制范围。
[0375]
实施例1：抗muc1单克隆抗体
[0376]
材料和方法
[0377]
sec hplc：为确定聚集体，使用分析尺寸排阻色谱法分析样品(sec；tosoh#08541)，流动相为300mm nacl、25mm磷酸钠、ph 6.8。
[0378]
muc1elisa：在pbs中以100ng/孔将抗原直接涂覆在链霉亲和素(pierce，15500)或maxisorp(vwr，62409-024)96孔板上。将涂覆的板在4℃过夜孵育。用酪蛋白封闭缓冲液(thermo fisher,37528)封闭板并用pbs-吐温-20洗涤。将抗体在pbs中连续稀释，其被加入到涂覆的孔，并且在室温振荡孵育1h。为了测试粘性，还将抗体添加到未涂覆的、封闭的孔中。过氧化物酶(hrp)共轭的抗fc二抗(jackson immunoresearch,#109-035-098)用于检测，然后是tmp底物(thermo fisher,34028)和h2s04淬灭。在molecular devices酶标仪上在450nm处读取吸光度。
[0379]
流式细胞术分析：用versene收获细胞系，转移到具有2％fbs(pbs/fbs)的pbs中并冷藏。将细胞在冰上用指定的抗体(1μg/测试)孵育20-30分钟。用pbs/fbs洗涤1次后，加入alexafluor488共轭的抗人igg-fc抗体&染料7-aad(用于排除死细胞)，并将细胞在冰上孵育20分钟。用pbs/fbs洗涤样品2次，然后在运行facsdiva
tm
软件的facs canto
tm
仪器上进行流式细胞术分析。通过排除双联体和死细胞并对fsc/ssc细胞群进行门控(gating)来进行分析。测定每种抗体的alexafluor488通道的几何平均荧光强度(gmfi)。所有样品一式三份运行。对照包括muc1阴性细胞系(hct-116)、单独用二抗标记的细胞和未染色的细胞。
[0380]
差示扫描荧光法。抗体(10μl，1mg/ml)用于使用protein thermal shift试剂盒(applied biosystems)进行蛋白质熔解温度测量。将抗体与5μl的缓冲液和2.5μl的8x荧光染料混合用于20μl反应。quantstudio3(applied biosystems)实时pcr仪用于生成熔解曲线。设置为：25℃保持2分钟，然后0.05℃/秒，升高温度至99℃，然后在99℃保持2分钟。原始数据通过protein thermal shift软件(applied biosystems)进行分析。
[0381]
结果
[0382]
产生了三种抗muc1单克隆抗体，muc1gb06、muc1 g12和muc1h02。三种抗体共享相同的重链序列，并具有不同的轻链序列。
[0383]
以下显示了具有基于chothia定义、kabat定义和imgt定义划分的框架区(下划线)和hcdr(粗体)的可变重链区序列：
[0384][0385]
以下显示了具有基于chothia定义、kabat定义和imgt定义划分的框架区(下划线)和lcdr(粗体)的可变轻链区序列：
[0386]
gb06，vl：
[0387][0388][0389]
g12，vl：
[0390][0391]
h02，vl：
[0392][0393]
gb06，vl：
[0394][0395]
g12，vl：
[0396][0397]
h02，vl：
[0398][0399]
图1显示根据尺寸排阻色谱法(sec)所确定的，抗muc1单克隆抗体muc1 gb06、muc1 g12和muc1 h02分别超过99％、超过99％和超过98％是单体的。
[0400]
图2a-2c显示，根据elisa所评估的，抗muc1单克隆抗体muc1 gb06、muc1 g12和muc1 h02结合至重组20mer muc1糖基化生物素，但不结合至重组60mer muc1非糖基化生物素或诱饵肽。20mer muc1糖基化生物素指的是包括序列vtsapdtrpapgstappahg(seq id no:26)的在一些s/t残基上具有tn(galnac)抗原或唾液酸化tn(neu5acα2-6galnac)抗原修饰的肽，其中生物素与n末端共轭。60mer muc1非糖基化生物素指的是包括序列vtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrpapgstappahgvtsapdtrp apgstappahg(seq id no:27)的肽，其中生物素与n末端共轭。诱饵肽指的是包括序列plpvtssastghatprav(seq id no:28)的在一些s/t残基上具有tn(galnac)抗原或唾液酸化tn(neu5acα2-6galnac)抗原修饰的肽。
[0401]
图3a-3b显示抗muc1抗体、muc1gb06、muc1 g12和muc1 h02与未涂覆的链霉亲和素或maxisorp板结合的水平。
[0402]
图4显示叠加直方图，其显示了指示抗体与指定细胞系的结合，(一式三份测试)。
[0403]
图5显示交错直方图，其显示了指示抗体与指定细胞系的结合。
[0404]
图6显示通过差示扫描荧光法测定的b06、g12和h02抗muc1抗体的ch2和fab区的熔解温度。
[0405]
实施例2：抗muc1单克隆抗体的体内功效
[0406]
异种移植研究
[0407]
方法：雌性ncg小鼠(10/组)被植入雌激素颗粒(0.36mg/90天，17β-雌二醇)，并且然后用基质胶(1:1体积/体积)在pbs中皮下接种20百万个t47d细胞。在治疗开始前一天(第0天)，所有动物接受静脉注射10mg/kg人igg。
[0408]
当肿瘤达到平均为223mm3(第1天)时治疗开始。对于治疗，动物静脉注射单独媒介物或b06抗体。治疗剂量每周发生4个总剂量。每周两次监测动物的体重和肿瘤大小。当肿瘤达到2000mm3时，将动物安乐死。
[0409]
结果：在整个研究中，媒介物对照组中的肿瘤缓慢但一致地生长。给予10mg/kg的b06抗体的动物导致肿瘤停止状态。
[0410]
图7显示抗muc1抗体b06对t47d异种移植的体内功效。n＝10只小鼠/组；箭头指示施用抗体或媒介物的天数。
[0411]
虽然已经参照其具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应当理解的是可以在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下进行各种改变并且可以替换等同物。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质的组成、过程、一个工艺步骤或多个步骤适应
本发明的目标、精神和范围。所有此类修改都意在本文所附权利要求的范围之内。