针对流感和SARS冠状病毒2具有免疫原性的组合物、其制备和使用方法与流程

本发明总体上涉及用于引发针对sars-cov-2感染或sars-cov-2和流感感染的免疫应答的免疫原性组合物的领域。

背景技术：

1、2019年出现的新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2，或sars-cov-2)仍然是一场紧迫的公共卫生危机。随后的流行有两种可能性：(1)sars-cov-2将在目前许多国家实施的大规模干预措施之后从人类中消失；(2)sars-cov-2可能成为一种普通感冒病毒，并且像其他人类冠状病毒一样继续在人类中传播。自从2002/2003年的sars冠状病毒以来，有三种冠状病毒跨越了物种屏障并且感染了人类。有理由相信，在将来，可能会出现来自动物来源的其他冠状病毒，并且这些冠状病毒也可能会感染人类。需要快速响应和有效的疫苗以用于目前正在发生的sars-cov-2大流行病和未来新出现的冠状病毒。进一步地，人类对导致大流行病的sars-cov-2没有预先存在的免疫力，这导致全球范围内的流动性和死亡率显著上升。急需用于预防由sars-cov-2引起的感染的疫苗。还需要用于预防sars-cov-2和流感病毒的组合疫苗。

2、开发针对sars-cov-2的有效疫苗的新策略是必要的，所述疫苗具有提供广泛交叉保护活性的属性，并且可以与流感病毒免疫原性组合物共同施用。

3、对包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、条款等的任何讨论都不应被视为承认：任何或所有这些事项因为其在本技术的每项权利要求的优先权日之前已存在而形成现有技术基础的一部分，或是与本公开有关的领域中的公知常识。

4、在整个本说明书中，词语“包含”或者如“包括”或“含有”等变体将被理解为是意味着包括所陈述的元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他的元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明的目的在于提供一种安全且有效的活减毒冠状病毒。

2、本发明的目的还在于提供生成活减毒冠状病毒疫苗的方法。

3、本发明的目的还在于提供针对sars-2-cov-2和流感病毒具有免疫原性的组合物。

4、本发明的进一步目的在于提供在哺乳动物中引发针对冠状病毒的免疫应答的方法。

5、本发明的进一步目的在于提供在哺乳动物中引发针对冠状病毒和流感病毒的免疫应答的方法。

6、公开了针对sars-cov-2具有免疫原性的组合物以及针对sars-cov-2和流感病毒具有免疫原性的共组合物及其使用方法。sars-cov-2免疫原性组合物包括由表达流感病毒抗原和sars-cov-2抗原的基因修饰流感病毒制备的嵌合病毒。共组合物包括与活减毒甲型或乙型流感病毒(laiva/b)组合的嵌合病毒，所述活减毒流感病毒由于缺失病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)(delns1)的修饰而被减毒。

7、嵌合病毒建立在laiva/b的骨架上。由delns1活减毒甲型或乙型流感病毒(laiva/b)产生并且表达sars-cov-2抗原(cov2ag)的嵌合病毒毒株在本文中通常被称为a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag，具有名称不同的特异性嵌合病毒，这取决于正被表达的cov-2ag以及流感病毒骨架，即“a-毒株”或“b-毒株”是指特异性甲型或乙型流感病毒毒株。由delns1 laiva产生并且表达cov2ag的嵌合病毒毒株在本文中通常被称为-a-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag。由delns1 laivb产生并且表达cov2ag的嵌合病毒毒株在本文中通常被称为b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag。优选的cov2ag是sars-cov-2rbd(受体结合结构域)。因此，表达sars-cov-2-rbd的嵌合病毒通常被称为a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-rbd。

8、优选的基于甲型流感骨架的嵌合疫苗毒株包括ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd毒株。在一个实施方案中，优选的laiv骨架是传代适应甲型/加利福尼亚/04/2009毒株(a/ca/04/2009；ca04)，其包括病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)的缺失(在本文中被称为为ca04-delns1)，并且优选地包括位于np(d101n)和nep(e95g)基因中的两个适应性突变。

9、优选的laivb骨架是delns1-b8038(atcc保藏号为pta-125209)，并且在本文中与delns1-8038b可互换地提及。特别优选的基于乙型流感病毒骨架的嵌合病毒毒株是b8038-delns1-sars-cov-2-rbd。

10、公开了包括病毒的混合物的免疫原性组合物，所述混合物使用表达sars-cov-2抗原的基于流感的病毒和表达流感的各种血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的基于流感的病毒，在下文中公开了共组合物。在这些实施方案中，免疫原性组合物包括表达如本文所公开的sars-cov-2抗原的基于流感的病毒和表达流感的各种血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的基于流感的病毒的混合物。所公开的混合物针对流感病毒和sars-cov-2具有免疫原性。

11、在一个实施方案中，共组合物包括a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag和活减毒流感病毒(laiv)a(“laiva”)和/或活减毒流感病毒(laiv)b“(laivb”)，并且在任选的实施方案中，其中laiv a/b被工程化以表达流感的各种血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)。laiva和laivb由于缺失病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)(delns1)的修饰而是减毒病毒。优选来自维多利亚(victoria)谱系的laivb，其具有病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)的缺失。laivb额外地在区段3和5-7中包括如下的适应性核苷酸突变(am)：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)。具有适应性突变的laivb在本文中被称为am/laivb/delns1。am/laivb/delns1优选地不能在干扰素活性细胞(interferon-competent cell)(例如，a549细胞)中复制，并且优选地在低温如低于37℃的温度下复制，更优选地在30℃至33℃之间的温度下复制，并且最优选地在约33℃的温度下复制。优选的laivb是保藏在美国典型培养物保藏中心(the american type culture collection)的deins1-b8038hk，并且其atcc保藏号为pta-125209。laiva优选地基于h1n1流感病毒基因组，所述基因组包括毒力因子活性的缺失、第一组一个或多个突变以及第二组一个或多个突变，所述第一组一个或多个突变在不存在所述毒力因子活性的情况下在37℃下赋予复制，并且所述第二组一个或多个突变在低于35℃的温度下赋予复制。毒力因子活性的缺失可以包括毒力因子基因的至少一部分的缺失。此种缺失可以是延伸超过突变病毒的ns1区段的核苷酸57至528的ns1基因的至少一部分的缺失。优选的laiva是ca4-delns1，其包括赋予复制能力的一个或多个点突变，所述点突变可以位于突变h1n1流感病毒的m区域的外部(例如，h1n1流感病毒基因组中的g346a突变)。第二组一个或多个突变可以包括一个或多个点突变，如h1n1中的t261g或a310g突变。

12、laiva、laivb和嵌合a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag优选地在低温如低于37℃的温度下复制，更优选地在30℃至33℃之间的温度下复制，并且最优选地在约33℃的温度下复制。在一些实施方案中，所公开的嵌合病毒a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag的特征在于，其在37℃下在mdck细胞中的复制与其在33℃下在所述mdck细胞中的复制相比较差。在特别优选的实施方案中，嵌合a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag能够在疫苗产生系统(例如，卵或mdck细胞)中以与同一毒株的野生型流感病毒相当的水平复制。

13、还公开了用于制备表达sars-cov-2中的一种或多种抗原的嵌合病毒的方法。嵌合病毒毒株包括laiv a或b，其包括病毒毒力元件ns1蛋白的缺失和适应性突变，所述适应性突变允许突变毒株在疫苗产生系统(如卵和mdck细胞)中生长(即，嵌合a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag毒株)。所述方法包括(a)生成laiv(a或b)(其包括ns1编码区的编码区的缺失)、delns1以形成a-毒株-delns1(其中laiv是甲型流感病毒)或b-毒株-delns1(其中laiv是乙型流感病毒)，例如ca04-delns1，(b)通过转染a/b-毒株-delns1以表达冠状病毒抗原代替缺失的ns1，在a-毒株-delns1或b-毒株-delns1(例如ca04-delns1或b8038-delns1)中表达来自sars-cov-2的抗原(即cov2ag)，从而生成嵌合病毒，其在本文中为a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag，(b)拯救a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag，以及(c)将拯救的病毒在一个或多个疫苗产生细胞中传代直到病毒滴度稳定，以获得a-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag毒株。示例性的冠状病毒抗原结构域包括受体结合结构域(rbd)。按照用来生成嵌合sars-cov-2病毒的相似方案，laiva/b可以被工程化以用来自不同毒株的ha或na或用hef(血凝素-酯酶融合)代替缺失的ns1区段。

14、所公开的方法优选地包括反向遗传学。在一些优选的实施方案中，将含有缺失的ns1区段(delns1)并且表达所选冠状病毒抗原和其他七个衍生自流感病毒毒株的基因组区段的质粒转染到293t/mdck细胞混合物中。将拯救的病毒在mdck细胞中传代直到病毒滴度稳定，即连续三次传代的病毒滴度维持没有有意义的变化。如本文所用，没有有意义的变化是指包括无变化或无统计显著性变化在内的变化。

15、还提供了药物组合物。药物组合物包括所公开的免疫原性嵌合a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag，如ca04-delns1-rbd或b8038-delns1-rbd-，其根据所公开的方法单独产生，或与laiva和/laivb和/或laiva/b组合产生。药物组合物通常包括有效量的病毒，以在施用于有此需要的受试者时在所述受试者中诱导免疫应答。药物组合物可以包括额外的试剂，例如佐剂以增强免疫应答。在一些实施方案中，药物组合物不包括佐剂。在一个实施方案中，组合物包括有效量的嵌合ca04-delns1-cov2ag、单独的deins1-b8038hk或deins1-b8038hk与delns1-b8038组合。

16、还提供了通过将药物组合物施用于有此需要的受试者来治疗所述受试者的方法。所述方法可以是疫苗方案。因此，在一些实施方案中，将组合物施用于受试者，以提供针对单独的或与流感病毒组合的sars-cov-2的预防性或治疗性保护。通过皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)、口服或鼻内施用；或通过注射或吸入，将根据本文公开的方法生成的所公开的嵌合laiv a/b-sars-cov-2病毒(其被例示为例如ca04-delns1-cov2ag或delns1-b8038)单独或与所公开的laiva和/或laivb组合施用于有此需要的哺乳动物。在其他方面，毒株经鼻内施用。将含有嵌合delns1-cov2ag的组合物施用于需要针对sars-cov-2-感染的保护性免疫的哺乳动物。