针尖液、微针贴片及其制备方法与应用

1.本发明属于药物制剂领域，具体地，涉及针尖液、微针贴片及其制备方法与应用。


背景技术：

2.据最新的全球流行病统计研究“2016年全球疾病负担研究项目(globalburden of disease study 2016，gbd)”，2016年发病率最高的10大疾病中，其中有三种是皮肤病，包括由细菌感染引起的脓皮病、真菌感染引起的真菌性皮肤病和其他皮肤及皮下疾病。皮肤病，特别是由细菌和真菌引起的感染性皮肤病，已经成为影响人类健康不容忽视的重要问题。
3.感染性皮肤病以外用药物治疗为主，其原因是：
①
直接作用于皮肤靶部位；
②
局部停留时间长，可以更好地发挥控制症状的作用；
③
外用吸收少，可避免系统给药不良反应的发生和引起菌群失调等；
④
能减少抗生素的系统用量，减轻患者的经济负担；
⑤
使用方式简单等。然而，感染性皮肤病的致病菌(细菌或真菌)种类繁多，甚至存在多种致病菌混合感染的可能，而且在有些地区，由耐药菌(如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)引起的感染性皮肤病更是高达 50％。传统的局部外用抗生素制剂(如红霉素软膏、新霉素软膏和氧氟沙星乳膏等)又因为皮肤渗透性差，不具备在感染部位聚集的能力，其疗效与治疗周期较长。
4.皮肤是人体最大的器官，它作为身体抵御外界侵袭的屏障，同时也为药物进入人体内带来了障碍。人表皮最外层的角质层(一般10～15μm)，是药物经皮渗透的主要障碍。角质层由死亡的角质细胞和细胞内基质组成，胆固醇、甘油三酯和神经酰胺是细胞内基质的主要成分。角质层的结构致密且亲脂性强，只允许少量分子量小于500da的亲脂性药物透过，这导致很多药物通过皮肤给药难以达到药效剂量，生物利用度低。
5.微针(microneedle)给药系统可用于提高药物(包括小分子药物与生物大分子药物)的皮肤渗透性，对改善药物的体内药效具有重要意义。微针贴片由多个针长25～2000μm的微型针头以阵列的方式连接在基座上组成，是一种结合皮下注射与皮肤贴片双重优点的微侵袭透皮给药方式。这些微型针头具有足够的长度和机械强度，通过把微针贴片刺入皮肤，能刺透皮肤角质层及其下层的组织，打破了角质层屏障对药物的阻滞作用，将药物直接递送到表皮或真皮中，从而提高其渗透率和在特定部位的蓄积。常见的微针分为固体实心微针、涂层微针、空心微针和可溶性微针四种。可溶性微针一般由生物溶解或降解的高分子材料制备而成，结构分为起支撑微针阵列作用的基底层和装载药物的针尖层。在微针阵列刺入皮肤后，药物随着针尖溶解而释放到皮肤中。不同于固体微针由金属或硅组成，可溶性微针的聚合物不仅可以充当基质，还可以包裹药物，增加了微针的载药量。因此可溶性微针的耐受性良好、使用方便、患者依从性良好、载药量高，是一种十分有潜力、安全便利的给药方式。
6.具有抗菌活性的微针可用于局部治疗皮肤感染，减少皮肤因为被刺破而引起感染的可能性。近年来，人们为了构建抗菌微针做了一些尝试。gittard等基于双光子聚合-微成型技术，制备了一系列表面涂覆银膜、庆大霉素的微针贴片。 boehm等使用压电喷墨印刷的
方法将两性霉素b包覆到gantrez 169 bf的微针的表面。park等把绿茶提取物包裹到可溶性微针针尖中，获得具有较好抗菌活性的微针贴片，用于促进伤口感染的皮肤愈合。caffarelsalvador等利用可溶性微针装载亚甲基蓝，通过光动力抗菌化学疗法抗菌。这些工作都为抗菌微针的研究奠定了基础，然而由于抗生素容易产生耐药，抗菌药物抗菌能力不足和表面涂覆抗菌试剂的方法载药量较低等问题，抗菌微针的研究还远远不足。
7.针尖载药量低，是可溶性微针的经皮给药系统需要克服的主要难题。典型的可溶性微针针尖层由基质高分子材料和药物组成。作为针尖的主体，基质高分子材料具有较好的机械强度，是微针贴片能够有效刺穿皮肤的基本保证。为了保证针尖的基本力学性能，药物在针尖层中所占比例不能太大。而且，对于某些与针尖基质材料相容性较差的药物(如一些疏水性药物或蛋白质药物)，如果投药量太高，药物在可溶性微针针尖的制备或储存过程中会析出，导致药物活性与水溶性降低。
8.ε-聚赖氨酸是一种含有25—30个赖氨酸残基的聚多肽，具有广谱抗菌活性，也具备一定的力学性能。然而，采用纯ε-聚赖氨酸制备的微针质地较脆，力学性能较差，难以刺破皮肤角质层，需添加一定的高分子辅料，与之混合制备微针。若辅料含量高，则会占用微针针尖大部分空间，降低抗菌药物在针尖的富集；若辅料含量太低，则会导致微针力学性能较差。因此，构建载药量高、力学性能好的微针，是制备高效抗菌可溶微针的主要技术难题。


技术实现要素：

9.基于此，本发明的目的之一是提供一种高效广谱的抗菌微针贴片及其制备方法。通过利用ε-聚赖氨酸同时具备高分子材料的力学性能以及抗菌药的广谱抗菌活性的特点，再通过与少量其它针尖基质材料和抗菌药物配合，获得皮肤穿刺率高且针尖抗菌活性物质负载量高的高效广谱抗菌微针贴片。
10.实现上述目的技术方案如下。
11.一种微针针尖液，其由针尖基质材料溶液与药物制备而成，所述针尖基质溶液包含有ε-聚赖氨酸和聚乙烯醇。
12.在其中一些实施例中，所述药物为抗菌类药物，更优选为水溶性抗菌类药物，最优选为盐酸强力霉素。
13.在其中一些实施例中，所述ε-聚赖氨酸与聚乙烯醇的质量比为1:9—9:1，进一步优选为质量比为3:7—7:3，更优选为1:1。
14.在其中一些实施例中，所述药物与所述针尖基质材料溶液中溶质的质量比为 1:1—1:100(w:w)，优选为1:2—1:32，更优选为1:8。
15.本发明另一目的还提供了所述微针针尖液的制备方法。
16.一种微针针尖液的制备方法，包括以下步骤：将所述ε-聚赖氨酸溶液与聚乙烯醇溶液，按照溶液中溶质的比例混合，在70
±
5℃加热直至完全溶解，得针尖基质材料溶液；
17.将所述抗菌类药物，加入pbs中，加热溶解，配成0.69g/ml的母液，并将药物与所述针尖基质材料溶液中的溶质按比例，加入针尖基质溶液中，恒温搅拌混匀，得到微针针尖液。
18.在其中一些实施例中，所述ε-聚赖氨酸溶液，由ε-聚赖氨酸与水混合制备，混合比例为1:0.5—1:10(w:v)，更优选为1:1.8，和/或所述聚乙烯醇溶液，由聚乙烯醇与水混合后
加热溶解制备，混合比例为1:0.5—1:10(w:v)，更优选为1:1.8。
19.本发明的目的之一是提供一种高效广谱的抗菌微针贴片及其制备方法。通过利用ε-聚赖氨酸同时具备高分子材料的力学性能以及抗菌活性物质的广谱抗菌活性的特点，再通过与少量其它针尖基质材料和抗菌药物配合，获得皮肤穿刺率高且针尖抗菌活性物质负载量高的高效广谱抗菌微针贴片。
20.一种微针贴片，包括基底层和装载药物的针尖层，所述针尖层由上述微针针尖液制备而成。
21.在其中一些实施例中，所述基底层由聚乙烯吡咯烷酮制备而成，更优选地，所述基底层由聚乙烯吡咯烷酮k90制备而成。
22.本发明的另一目的是提一种可溶性微针贴片的制备方法。
23.一种可溶性微针贴片的制备方法，包括以下步骤：
24.按照上述制备方法得到所述针尖液；
25.配置好基底层溶液，优选地，所述基底层溶液的配置为：聚乙烯吡咯烷酮按1：2—1：8(w:v)的比例加入乙醇或水溶解，更优选为1:3.8；
26.搅拌均匀后溶胀过夜，第二天再充分搅匀，离心除气泡，得基底液；
27.将针尖液加入微针阴模，经过离心，刮去多余针尖液，离心干燥后，加入基底液，离心；
28.将微针阴模干燥后，将微针剥离，即得。
29.本发明的另一个目的是提供上述可溶性微针贴片在制备治疗皮肤病制剂中的应用。
30.本发明通过以ε-聚赖氨酸(ε-pll)同时作为针尖基质材料的主要成分以及广谱抗菌活性物质之一，通过与高分子材料聚乙烯醇(pva)配合，获得自带抗菌活性，同时力学性能好的可溶性微针针尖基质。研究发现pva的引入对改善微针的穿刺率极为重要，本发明所设计的抗菌微针贴片，穿刺率达到99％以上。
31.本发明还研究发现，当ε-pll与强力霉素(dox)等抗生素共同装载时，有利于扩大所制备的可溶性微针贴片的抗菌谱，甚至有利于发挥协同作用，进一步提高微针在体内的抗菌活性，以更好地应用于皮肤病的治疗。
32.此外，本发明所设计的抗菌微针贴片具有极高的抗菌活性成分负载量，其总负载量高达2319.1μg/片以上，其中ε-pll的负载量为1869.3μg/片和dox的负载量为449.8μg/片。
附图说明
33.图1实施例1中可溶性微针贴片的显微图。
34.图2实施例2中可溶性微针贴片皮肤穿刺性能研究。
35.图3ε-pll和pva比例不同的微针贴片的皮肤穿刺率
36.图4实施例1中针尖液辅料筛选6个处方的显微图:(a)纯ε-pll；(b)ε-pll:pvpk30＝1:1；(c)ε-pll:dex40＝1:1；(d)ε-pll:pvpk30:pva-103＝45:45:10；
37.(e)ε-pll:dex40:pva-103＝45:45:10；(f)ε-pll:pva-103＝6:4
38.图5实施例3中盐酸强力霉素与抗菌肽共装载的微针显微图。
39.图6载强力霉素的抗菌微针贴片的载药量。
40.图7实施例4中小鼠背部炎症皮肤图。(a)对照组小鼠皮肤侧视图；(b)对照组小鼠皮肤俯视图；(c)对照组小鼠皮肤组织图；(d)载药微针治疗组小鼠皮肤侧视图；(e)载药微针治疗组小鼠皮肤俯视图；(f)载药微针治疗组小鼠皮肤组织图。
具体实施方式
41.除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、药剂学、细胞生物学，其属于本领域技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
42.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/ 或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
43.抗菌活性物质包括抗菌药物(antibacterial agents)以及具有抗菌活性的其它物质。抗菌药物一般是指具有杀菌或抑菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。水溶性抗菌药物是抗菌药物中的一种，包括有盐酸强力霉素，以及硫酸庆大霉素、硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、硫酸妥布霉素、硫酸新霉素、盐酸壮观霉素、硫酸西索米星、硫酸小诺米星、硫酸阿米卡星、硫酸奈替米星、盐酸万古霉素，盐酸去甲万古霉素，替考拉宁、多粘菌素a、多粘菌素b、多粘菌素c、多粘菌素d、多粘菌素 e、甲氧西林钠、苯唑西林钠、氯唑西林钠、双氯西林钠、氨苄西林钠、阿莫西林钠、氨苄西林钠、替卡西林钠、匹美西林、盐酸头孢替安、头孢噻肟钠、头孢曲松、头孢吡普酯、头孢美唑钠、头孢米诺钠、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢唑肟、拉氧头孢钠、氟氧头孢钠、克拉维酸钾、舒巴坦钠、他唑巴坦钠、亚胺培南、美罗培南等
44.ε-pll不同于常规的抗菌小分子药物。(1)此聚合物分子量较大，所以力学性能较好。(2)其结构中富含大量水溶性好的氨基官能团，因此水溶性良好。(3) 其降解产物主要是天然氨基酸赖氨酸，因此生物可降解性佳。这种具有广谱抗菌活性的ε-pll，具备传统可溶性微针针尖基质材料的主要结构特点，可把它直接(或与少量其它基质材料复合)做成微针贴片的针尖层。这种新思路有利于减少其它基质材料的使用量，大大提高药物在微针针尖层的比重，从而提高载药量。另外，由ε-pll所构建的可溶性微针贴片，针尖层中具有大量氨基、羰基和亚甲基，能够为装载药物提供氢键、静电和疏水作用等多重分子间相互作用。因此，有利于高效装载其他药物，构建协同给药系统。但是，固体的ε-pll虽然具有一定力学性能，但材料本身较脆，单独成型无法构建具有足够力学性能的可溶性微针针尖，其皮肤穿刺率低。
45.以下将结合具体实施例和附图对本发明的基于ε-pll的可溶性微针贴片做进一步详细的说明，本领域技术人员应当理解，下面所描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
46.以下实施例中所用ε-pll购买于郑州拜纳佛生物。
47.pva-103购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
48.pvp k90购买于德国basf公司。
49.实施例1
50.不含抗生素的ε-pll/pva的可溶性微针贴片的制备与表征
51.1.微针阴模的制备
52.将四棱锥形金属微针阳模(微针高度为1200μm，底部宽度为300μm，针尖间距为800μm，微针数目为12
×
12)置于无水乙醇中，超声20分钟，反复清洗后，将阳模置于室温待其表面乙醇完全挥发。将9ml聚二甲基硅氧烷 (polydimethylsiloxane,pdms)和0.9ml固化剂(美国dow corning公司)以10: 1的比例(w/w)混匀并搅拌均匀，真空除气泡约10分钟。将去除气泡的含固化剂的液态pdms缓慢倒入阳模中(6g)，而后置于真空干燥箱中，连接真空泵脱气45分钟，至液体表面无气泡。将阳模置于80℃烘箱中固化2小时，待 pdms完全固体化，取出阳模，冷却后分离出阴模。
53.2.针尖液和基底液的配制
54.ε-pll(10g)按1:1.8的比例(w/v)加入18ml超纯水溶解后摇匀，pva-103 (10g)按1:1.8的比例(w/v)加入18ml超纯水后搅拌，90℃加热2小时以上，加热期间定时摇匀。按ε-pll:pva-103＝1:1的比例(w/w)将ε
‑‑
pll溶液和pva-103溶液混匀后，70℃水浴1小时。
55.往pvp k90(10g)中按1:3.8的比例(w/v)加入38ml乙醇溶解，用勺子搅拌均匀并溶胀。第二天再充分搅匀，2000rpm离心2分钟除气泡，取上清液得基底液，沿壁加入注射器。
56.3.微针贴片的制备
57.取针尖液250μl，加入微针阴模中，配平后离心(4000rpm，10min，0-10℃)，使得针尖液填满模具。用干净的刮片将多余的针尖液去掉，然后再次离心干燥 (4000rpm,45min,20-30℃)。加入pvp k90基底液，离心(4000rpm,45min, 0-10℃)。将微针阴模放入干燥箱中，干燥24小时以上。将微针剥离，密封干燥保存。
58.将微针轻轻从模具中取出，获得针型完好的抗菌微针贴片，并用光学显微镜观察，如图1所示。
59.实施例2
60.不含抗生素的ε-pll/pva的可溶性微针贴片的的皮肤穿刺性能研究
61.将鼠皮角质层向上平铺在平板上，用大头钉固定，经过脱毛后，将实施例1 所述微针贴片(ε-pll:pva-103＝1:1)用插入皮肤，按1分钟，贴4分钟，然后移除微针。用清水洗去融掉的微针液体，用4％(0.4g/10ml)台盼蓝溶液浸染皮肤表面一段时间(约2分钟)后用清水除去染色剂，擦干后用胶带贴去背景颜色，观察皮肤表面染色小孔的情况及被移除的微针针尖情况。(图2)
62.图2中表明，采用ε-pll:pva-103＝1:1的处方获得的可溶微针贴片，同时综合了ε-pll的硬度和大分子材料的韧度，有良好的机械强度，穿刺率达到 99％以上。图3表明，采用ε-pll:pva-103＝1:1获得的微针贴片皮肤穿刺率最高。
63.实施例3不同辅料组合构建的微针贴片对比
64.选用ε
‑‑
pll作为主要针尖基质材料，pvp、pva或右旋糖酐(dex 40)用于改善针尖性能，选用平均分子量为1300kda的pvp k90作为基底层材料，构建不同可溶性微针贴片(其他参数请参照实施例1的制备方法)。实验结果见图4，ε-pll与不同的辅料以不同的比例搭配时，制备出来的微针品质有所不同。当ε-pll单独使用或与pvp k30和dex 40单独搭配时，制备出来的微针质地不均一，且断针率高，而当处方中加入一定比例pva-103时，制备出来
的微针断针率大大减少；ε-pll和pva-103搭配制备出来的微针质地均一，完全透明。
65.实施例4载强力霉素的抗菌微针的制备与表征
66.ε-pll(5g)按1:1.8的比例(w/v)加入9ml超纯水溶解后摇匀，pva-103 (5g)按1:1.8的比例(w/v)加入9ml超纯水后搅拌，90℃加热2小时以上，加热期间定时摇匀。
67.盐酸强力霉素(1.25g)按1.25：1.8的比例(w/v)加入1.8ml的pbs缓冲液配制成高浓度溶液，70℃水浴至完全溶解。
68.往pvp k90(10g)中按1：3.8的比例(w/v)加入38ml乙醇溶解，用勺子搅拌均匀并溶胀。第二天再充分搅匀，2000rpm离心2分钟除气泡，得基底液，沿壁加入注射器。
69.按1：1的比例(w/w)将ε-pll溶液和pva-103溶液混匀后，70℃水浴1 小时后趁热按比例加入盐酸强力霉素高浓度溶液(ε-pll与强力霉素的质量比为4:1)，继续水浴1小时，超声5分钟除气泡，得针尖液。
70.1.微针的制备
71.取针尖液250μl，加入微针阴模中，配平后离心(4000rpm,10min,0-10℃)，使得针尖液填满模具。用干净的刮片将多余的针尖液去掉，然后再次离心干燥 (4000rpm,45min,20-30℃)。加入pvp k90基底液，离心(4000rpm,45min, 0-10℃)。将微针阴模放入干燥箱中，干燥24小时以上。将微针剥离，密封干燥保存。
72.如图5所示，实验结果显示，装载强力霉素的抗菌微针的针形良好，针尖层和基底层的分层明显，针内基本没有气泡。计算发现，该微针的抗菌活性成分载药量高，含强力霉素449.8μg/片，含ε-pll1869.3μg/片，抗菌活性药物总量高达2319.1μg/片(图6)
73.实施例5 ε
‑‑
pll与强力霉素共装载的可溶性微针贴片的体内抗菌活性评价方法，按照如下方法进行：
74.icr小鼠腹腔注射0.2ml的1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后，在小鼠背部皮下注射100μl 1
×
108cfu/ml的mrsa菌液，并标记注射位置。对照组在打菌2h后在小鼠背部皮下注射100l ph值7.4的pbs溶液(注射部位与打菌相同)，实施例4所述载药微针在打菌24h后，将载药微针插入小鼠背部感染部位，按压1分钟，10分钟后移除微针。48h后处死小鼠，剪取炎症部位皮肤观察脓肿情况。(结果参见图7)。
75.实验结果显示，与对照组相比，载药微针治疗组治疗的小鼠皮下基本没有脓包，无明显红肿，这说明载药抗菌微针能够发挥显著体内抗菌活性。此外，载药微针治疗组小鼠皮肤的俯视图和侧视图显示，微针穿刺产生的针孔不明显，这说明可溶性微针治疗是一种安全可靠的微创技术。
76.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。