一种绿色可持续提取小米多酚的方法及应用

1.本发明涉及一种绿色可持续提取小米多酚的方法及应用，属于提取加工技术领域。


背景技术：

2.小米是一种重要的谷类作物，在干旱和半干旱的热带地区栽培较多，亚洲和非洲超过25个国家将小米作为主食。小米中富含多酚、蛋白质、膳食纤维和微量营养素，这使得它比大米和小麦等一些常见的谷物更有营养。有研究报道小米多酚有许多有益健康的特性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌和抑制血小板聚集活性。研究小米多酚的提取对天然植物材料生物活性化合物应用的研究具有重要意义。
3.在活性物质的提取过程中，常使用传统的有机溶剂作为提取剂，如甲醇，乙醇，丙酮等。但通过使用传统的有机溶剂对小米多酚的提取率低，且其毒性较高，生物降解性差，大量使用会造成环境污染，如何能有效、无毒提取小米多酚是亟需解决的技术问题。
4.低共熔溶剂由于其成本低、绿色、生物可降解性好、得率高，正在作为有机溶剂在天然产物提取中的替代溶剂。然而低共熔溶剂的蒸汽压较低，不能通过常规减压浓缩法将所提取的化合物从低共熔溶剂中分离出来。目前，现有技术中，大孔树脂柱色谱常被应用于目标化合物的分离。但大孔树脂生产成本高，操作复杂、耗时。因此开发一种可实现生物活性化合物的绿色、高效提取，及目标物从提取剂中简单、快速、高效回收的低共熔溶剂作为萃取剂具有重要的实际意义。


技术实现要素：

5.(一)要解决的技术问题
6.为了解决现有技术提取剂提取得率低，毒性较高，生物降解性差，可能会造成环境污染，提取物不易从提取剂中回收等问题，本发明提供一种绿色可持续提取小米多酚的方法。
7.(二)技术方案
8.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
9.一种绿色可持续提取小米多酚的方法，其包括如下步骤：
10.s1、将小米与水混合，将混合后的样品放置在超高压容器中，进行超高压预处理，然后干燥，用粉碎机粉碎，过筛；
11.s2、将过筛后的小米粉末加入含有β-环糊精的亲水性可切换低共熔溶剂，进行提取，一次离心后，收集上清液，得到小米多酚提取液；
12.s3、将小米多酚提取液加入酸溶液，进行二次离心，出现两相分离，上层为疏水低共熔溶剂相，下层为含有小米多酚的水相，将下层收集冻干获得小米多酚固体。
13.如上所述的方法，优选地，为了循环使用可切换低共熔溶剂，还包括s4、将步骤s3中上层的疏水低共熔溶剂相加入碱，转化为亲水性的可切换低共熔溶剂，可进行重复提取
利用。
14.如上所述的方法，优选地，在步骤s1中，所述小米与水混合按质量比1:0.5～3的比例进行。
15.如上所述的方法，优选地，在步骤s1中，所述超高压预处理的条件是压力为300～500mpa，时间为5～20min。
16.进一步地，所述小米与水混合按质量比优选1:1的比例进行，所述超高压预处理优选压力为500mpa，时间为15min。
17.如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，所述可切换低共熔溶剂为辛酸与芳樟醇、壬酸与芳樟醇或癸酸与芳樟醇的混合液，混合比例按摩尔比为3～1：1～3，亲水性是指其ph值为8.5～9.5。优选地，所述混合比例按摩尔比为2:1、1:1或1:2进行。
18.进一步地，所述可切换低共熔溶剂最优选为按摩尔比为1:1的辛酸与芳樟醇混合液。
19.如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，β-环糊精在可切换低共熔溶剂中的浓度为10～30g/l。进一步地，优选β-环糊精的浓度为12～20g/l，最优选为16g/l。
20.如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，提取采用研磨或水浴进行，所述研磨的频率为30hz，研磨的时间为60～120s；所述水浴的温度为 50℃，时间120min。
21.进一步地，所述提取优选采用研磨时间为80s。
22.如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，小米粉末与可切换低共熔溶剂按单位为g与ml时的比为1:10～50进行；
23.所述一次离心为5000～7000rpm，离心1～3min。
24.进一步地，优选所述小米粉末与可切换低共熔溶剂按单位为g与ml 时的比为1:10进行。
25.如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述酸溶液为盐酸或硫酸或碳酸溶液，使得ph为6～7即可，所述二次离心为7000～10000rpm，时间为2～10min。
26.进一步优选地，在步骤s3中，盐酸溶液的添加量按疏水低共熔溶剂与盐酸溶液的体积比1:3加入，盐酸溶液的浓度为1mol l-1
；
27.如上所述的方法，优选地，在步骤s4中，碱为氢氧化钠、氨水、碳酸氢钠、氢氧化钾的固体或溶液加入合成的可转换的低共熔溶剂溶液中，调节ph至8.5～9.5，即转化为亲水性的可切换低共熔溶剂。
28.进一步优选地，在步骤s4中，碱为naoh溶液，添加量按疏水低共熔溶剂与naoh溶液的体积比1:4加入，碱浓度为1mol l-1
。
29.辛酸和芳樟醇的混合溶剂在提取小米多酚中的应用。
30.如上所述的应用，优选地，辛酸和芳樟醇按2:1、1:1或1:2混合，加碱转换为亲水性低共熔溶剂，并添加有浓度为16g/l的β-环糊精，ph为 8.5～9.5时，作为提取小米多酚的提取剂进行提取小米多酚。
31.(三)有益效果
32.本发明的有益效果是：
33.本发明提供的一种绿色可持续提取小米多酚的方法，采用物理的非热加工技术即超高压技术，对小米进行超高压预处理，破坏了小米的细胞结构，使小米中的多酚类物质更
容易溶出，采用亲水性可切换低共熔溶剂作为提取剂，β-环糊精作为辅助提取剂，研磨提取小米多酚，大大提高了小米多酚的得率，是传统乙醇提取法的十倍多，大大提高了提取效率。
34.本发明提供的绿色可持续提取小米多酚的方法中，使用具有可转换性质的低共熔溶剂作为提取剂，只需转换溶液的ph就可以实现提取剂亲水疏水性的转换，使得提取剂在亲水状态提取小米多酚，疏水状态出现水相和低共熔溶剂相的分离，多酚从提取剂中分离回收，解决了传统方法中低共熔溶剂的蒸汽压较低，不能通过常规减压浓缩法将所提取的化合物从低共熔溶剂中分离出来的问题。
35.本发明提供的绿色可持续提取小米多酚的方法，使用后的溶剂，利用提取剂可转换的性质，使提取剂从提取液中得到回收，并用于提取新的小米样品，如此循环五次，提取剂的多酚得率没有显著下降，实现了提取剂循环回收再利用的问题，大大节约了生产成本。
附图说明
36.图1为不同超高压预处理的压力对小米多酚得率的影响结果；
37.图2为不同超高压预处理的时间对小米多酚得率的影响结果；
38.图3为不同的提取剂种类对小米多酚得率的影响结果；
39.图4为不同的低共熔溶剂摩尔比对小米多酚得率的影响结果；
40.图5为不同料液比对小米多酚得率的影响结果；
41.图6为不同提取方式对小米多酚得率的影响结果；
42.图7为不同提取时间对小米多酚得率的影响结果；
43.图8为不同β-环糊精的浓度对小米多酚得率的影响结果；
44.图9为新的和回收的低共熔溶剂提取小米多酚的得率。
具体实施方式
45.本发明通过大量实验研究发现，先对小米进行超高压预处理，再选择辛酸与芳樟醇合成的可转换的低共熔溶剂作为提取剂，β-环糊精辅助研磨提取小米多酚，实现多酚提取得率的提高。然后利用可转换低共熔溶剂的特性，将亲水性低共熔溶剂转换为疏水性，实现小米多酚的回收。最后将回收到的疏水低共熔溶剂转化为亲水性，重复提取新的小米样品，实现低共熔溶剂的循环利用。
46.本发明采用可转换的低共熔溶剂结合超高压预处理提取回收小米多酚，并且对可切换低共熔溶剂进行回收及重复利用。本发明创新性的建立通过提取剂可以在改变其酸碱性条件(ph)下实现亲水疏水性的转换，使得提取剂在亲水状态提取小米多酚，疏水状态分离小米多酚和提取剂，多酚得到回收，并且提取剂被回收和可进行新一轮的提取利用，最后实现可持续利用提取小米多酚。解决了目前很多现有技术面临的提取成本高、不绿色、得率低以及所提取的化合物不能通过常规减压浓缩法从低共熔溶剂中分离出来的问题。
47.本发明提供的超高压预处理结合可切换低共熔溶剂绿色可持续提取小米多酚的方法，包括如下步骤：
48.s1、样品预处理：将小米与蒸馏水混合，用真空封口机封入聚乙烯塑料袋中。然后将混合好的样品放置在超高压容器中，进行超高压预处理，然后冻干，用粉碎机粉碎，过筛；
49.s2、小米多酚的提取：将过筛后的小米粉末加入含有β-环糊精的亲水性低共熔溶剂，使用研磨仪研磨提取，进行第一次离心，收集上清液，得到小米多酚提取液；
50.s3、在小米多酚提取液中加入酸溶液，使得亲水性低共熔溶剂转换为疏水性，实现两相分离，此时上层疏水相的ph值范围为6-7，进行第二次离心，低共熔溶剂转换为疏水性，两相分离，上层为疏水低共熔溶剂相，下层为水相，提取液中的小米多酚被回收到水相中，对下层的水相进行真空冷冻干燥，得到小米多酚固体；
51.s4、提取剂的回收再利用：取第三步相分离回收到的上层疏水性低共熔溶剂，继续加入碱，使低共熔溶剂为碱性条件优选ph值为8.5～9.5，转换为亲水性低共熔溶剂，可用于提取新的小米样品，然后继续进行提取剂的回收及重复提取试验实现回收再利用。
52.如上所述的方法，可切换低共熔溶剂的制备：优选的以三种饱和脂肪酸辛酸，壬酸，癸酸作为氢键受体，以芳樟醇作为氢键供体，在以适当的摩尔比混合，用磁力搅拌器搅拌至混合物变成均匀透明澄清的液体，制成三种可切换低共熔溶剂(辛酸-芳樟醇，壬酸-芳樟醇，癸酸-芳樟醇)。将碱可为氢氧化钠、氨水、碳酸氢钠、氢氧化钾等固体或溶液加入合成的可转换的低共熔溶剂溶液中，调节ph至8.5～9.5，溶液转换为均匀的水相，没有出现分相，说明疏水低共熔溶剂转换为亲水性，进一步地，优选加入1mol l-1
的氢氧化钠溶液，按疏水低共熔溶剂：氢氧化钠溶液的体积比为1:4加入，使其转换为亲水性提取溶剂，然后向其中加入浓度为16g l-1
β-环糊精。
53.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
54.实施例1超高压预处理条件优化
55.a.预处理压力的优化
56.(1)实验方法：将小米样品(300g)与蒸馏水(300g)混合，用真空封口机封入聚乙烯塑料袋中。然后将混合好的样品放置在超高压容器中，以(0，300，400，500，600mpa)的压力预处理15min。真空冷冻干燥(24h)后，粉碎，过40目筛。
57.准确称取上述处理后的过筛的小米粉末0.1g于2ml离心管中，加入提取剂：含有浓度为16mg ml-1
的β-环糊精的亲水性低共熔溶剂1ml，使用研磨仪提取，(研磨频率为30hz)提取时间为80s，然后在7000rpm 下离心2min，收集上清液，得到小米多酚提取液，最后以没食子酸为标准品，采用福林酚法测定提取液中多酚的得率。
58.其中，提取剂(亲水性低共熔溶剂)的制备方法为将辛酸和芳樟醇按摩尔比1:1混合，形成均匀透明澄清的液体，即合成低共熔溶剂辛酸
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芳樟醇，向其中加入氢氧化钠使得其ph＝8.5～9.5。取1ml上述合成好的低共熔溶剂，并向其中加入16mgβ-环糊精，使β-环糊精的浓度为16mgml-1
。
59.先前通过预实验，研究发现如以薄荷醇、松油醇、香茅醇、香叶醇作为氢键供体合成的低共熔溶剂不具有可转化的性质；羟丙基-β-环糊精会影响福林酚法的测定，也不能用于提取小米多酚。研究发现不加β-环糊精其小米多酚的得率低于添加有β-环糊精的得率。
60.福林酚法测定的具体操作：
61.取50μl小米多酚提取液于比色管中，加入50μl福林酚试剂，摇匀后避光静置2min，再加12％的碳酸钠溶液100μl，蒸馏水定容至5ml，避光静置2h，同法制成空白对照，最后于760nm波长处检测其吸光值。
62.准确称取没食子酸标准品5.0mg，用提取剂溶解，配制成不同浓度的没食子酸标准溶液(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0mg ml-1
)，分别取 50μl不同浓度的没食子酸标准溶液，并按上述测定的步骤进行，最后于 760nm波长处检测其吸光值，以没食子酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制成没食子酸标准曲线。将待测样品的吸光度值代入没食子酸标准曲线，获得多酚的质量浓度，再根据公式(1)计算得到多酚得率。
63.小米多酚得率(mg g-1
)＝ncv/m
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(1)
64.式中：n为稀释倍数；本实施例中n为100；
65.c为多酚的质量浓度，mg ml-1
；
66.v为提取液的体积，ml；
67.m为小米粉的质量，g。(2)实验结果：如图1所示。
68.结果说明超高压预处理的不同压力条件(0，300，400，500，600mpa) 对小米多酚得率的影响。当压力的不断升高，小米多酚得率不断增加，压力达到500mpa时，小米多酚得率达到最高，继续升高压力，得率下降。这是因为超高压会对小米的细胞结构进行破坏，使小米中的多酚类物质更容易溶出，然而压力过高，可能使多酚类物质降解。因此优选超高压的压力为500mpa。
69.b.预处理时间的优化
70.(1)实验方法：与实施例1中a的方法相同，超高压的压力为500 mpa，不同之处在于分别进行不同时间的超高压预处理(0，5，10，15， 20min)。
71.(2)实验结果：如图2所示。
72.结果说明随着处理时间的增加，小米多酚的得率不断增加，在15min 时得率开始保持不变。这是因为随着超高压处理时间的不断延长，小米粉的细胞结构被更大程度的破坏，进一步延长处理时间，细胞结构被充分破坏，不会进一步促进目标物的溶出。因此优选超高压时间为15min。
73.实施例2可切换低共熔溶剂提取条件的优化
74.a.提取剂的种类
75.(1)实验方法：与实施例1中a的方法相同，不同之处在于分别采用不同种类的提取剂，提取剂分别选择三种可切换低共熔溶剂(辛酸-芳樟醇，壬酸-芳樟醇，癸酸-芳樟醇，均按摩尔比为3:1合成，配制同实施例1中，不同在于所用试剂不同。需要注意的是癸酸在室温下为固体，所以合成时需要进行加热，使得溶液成为透明，澄清，均匀的液体就证明低共熔溶剂合成)和乙醇。
76.(2)实验结果：如图3所示。
77.结果说明低共熔溶剂要显著高于采用乙醇提取小米多酚的得率，并且辛酸-芳樟醇提取小米多酚的能力最强。这可能与可转换低共熔溶剂的氢键相互作用和亲水性强弱有关。因此优选含β-环糊精的辛酸-芳樟醇作为提取剂。
78.b.低共熔溶剂的摩尔比
79.(1)实验方法：与实施例1中a的方法相同，在500mpa压力下，不同之处在于辛酸和芳樟醇分别采用不同的摩尔比(3：1，2：1，1：1， 1：2，1：3)合成低共熔溶剂。
80.(2)实验结果：如图4所示。
81.结果说明随着低共熔溶剂中辛酸：芳樟醇的摩尔比不断减小，得率逐渐升高，当摩
尔比为1：1时得率最高，然后得率下降。这可能是因为摩尔比会影响低共熔溶剂的表面张力和萃取过程中的解离程度。因此选择辛酸：芳樟醇为1：1的摩尔比。
82.c.料液比的优化
83.(1)实验方法：与实施例1中a的方法相同，在500mpa压力下，不同之处在于分别采用不同的料液比(即小米小米粉与亲水性低共熔溶剂按单位为g：ml)为1：5，1：10，1：20，1：30，1：40，1：50提取小米多酚。
84.(2)实验结果：如图5所示。
85.结果说明随着料液比的增加，小米多酚得率不断增加，在1：10g ml-1
时最高，然后没有显著提高，1:5时提取率最低这是因为提取剂不足会导致提取不充分。1:40时略有增高，但从节约成本考虑，因此优选小米粉与亲水性低共熔溶剂的料液比用量为1：10g ml-1
。
86.d.提取方式的优化
87.(1)实验方法：与实施例1中a的方法相同，在500mpa压力下，不同之处在于分别采用不同的提取方式(研磨提取：80s，超声提取：50℃， 15min，水浴提取：50℃，120min)。
88.(2)实验结果：如图6所示。
89.结果说明研磨提取小米多酚得率显著高于超声提取和水浴提取。研磨提取可以使提取剂与小米样品接触更充分，对目标物结构的破坏能力小，更易于快速高效提取。因此优选研磨提取法提取小米多酚。
90.e.提取时间的优化
91.(1)实验方法：与实施例1中a的方法相同，在500mpa压力下，不同之处在于研磨仪提取的时间分别采用不同的提取时间(20，40，60， 80，100，120s)。
92.(2)实验结果：如图7所示。
93.结果表明随着提取时间的延长，得率逐渐上升，提取时间为80s时得率最高，然后基本保持不变。这是因为当多酚得到充分提取，进一步延长提取时间，得率不变。从提取速率、成本等综合考虑，因此，确定最优选的提取时间为80s。
94.f.β-环糊精浓度的优化
95.(1)实验方法：与实施例1中a的方法相同，在500mpa压力下，不同之处在于分别采用不同的β-环糊精浓度(0，10，12，16，20，30mgml-1
)。
96.(2)实验结果：如图8所示。
97.结果表明随着β-环糊精浓度的增加，得率上升，β-环糊精浓度为16 mg ml-1
～30mg ml-1
时得率最高，16mg ml-1
开始然后保持不变。因此优选β-环糊精的浓度为16mg ml-1
。
98.实施例3小米多酚的回收
99.同实施例1中a的操作，在500mpa压力下，将得到的小米多酚提取液900μl于离心管中，然后加入540μl1 mol l-1
的hcl溶液(按提取液与hcl溶液体积比为5:3加入)，出现两相分离，且上层的疏水相体积与初始疏水低共熔溶剂体积几乎一致，可以根据上述现象证明转换完成此时上层的疏水相ph值为6-7，hcl的作用是将亲水低共熔溶剂转换为疏水低共熔溶剂，使提取液中的多酚被回收到水相中，同时低共熔溶剂也可被回收，用于新的提取。进一步离心(8000rpm，5min)，出现两相分离，出现互不相溶的两相，上层不溶于水，因此为疏水相，(根据转化前疏水低共熔溶剂的体积与上层相的体积几乎一致可以判断上层为疏水低共熔溶剂相)，下层为水相，提取液中的多酚被回收到水相中，将上下层分离，将水相真空
冷冻干燥24h(真空度是20pa以下，冷冻干燥冷阱温度是-30～-60℃)，得到小米多酚固体。
100.实施例4低共熔溶剂的回收及新的提取
101.(1)实验方法：取实施例3中，两相分离回收到的上层疏水性低共熔溶剂200μl于离心管中，继续加入800μl 1mol l-1
的naoh(添加量按疏水低共熔溶剂与naoh溶液的体积比1:4加入，浓度为1mol l-1
)，此时ph为9左右，转换为亲水性低共熔溶剂，用于提取新的小米样品(0.1 g)，重复上述操作用于提取新的小米样品。
102.(2)实验结果：如图9所示。
103.本实验考察了低共熔溶剂使用次数(1，2，3，4，5，6)对小米多酚得率的影响。结果显示，随着低共熔溶剂重复使用次数的增加，小米多酚的得率没有明显下降。因此，表明实验选定的可切换低共熔溶剂在小米多酚提取中具有良好的可循环性。
104.实施例5
105.将小米样品(300g)与蒸馏水(300g)混合，用真空封口机封入聚乙烯塑料袋中。然后将混合好的样品放置在超高压容器中，以500mpa 的压力预处理15min。真空冷冻干燥(24h)后，粉碎，过40目筛。
106.准确称取上述处理后的过筛的小米粉加入含有浓度为16mg ml-1
的β-环糊精的亲水性低共熔溶剂，加入比例为1：10(g：ml)，亲水性低共熔溶剂为将辛酸和芳樟醇按摩尔比1:1混合，形成均匀透明澄清的液体，合成低共熔溶剂辛酸-芳樟醇，向其中加入氢氧化钠使得其ph＝9；并向其中加入β-环糊精，使β-环糊精的浓度为16mg ml-1
，以研磨频率 30hz提取80s，然后在7000rpm下离心2min，收集上清液，得到小米多酚提取液。
107.按实施例1中方法测得提取液中小米多酚浓度，根据公式(1)计算小米多酚得率，得出小米多酚得率为5.4mg g-1
。
108.对比例1
109.现有技术中一般采用60％的乙醇作为提取剂超声提取小米多酚得率为0.5mg g-1
。具体操作如下：
110.将小米样品粉碎，过40目筛，准确称取0.1g粉末于2ml离心管中，加入60％的乙醇溶液1ml，超声提取15min，然后在5000rpm下离心2 min，得到小米多酚提取液。
111.按实施例1中方法测得提取液中小米多酚浓度，根据公式(1)计算小米多酚得率，得出小米多酚得率为0.5mg g-1
。
112.可见，现有技术中制备获得的小米多酚的得率为0.5mg g-1
左右，而本发明小米多酚的最佳得率为5.4mg g-1
。
113.而现有技术中应用的低共熔溶剂不能实现目标物与提取剂的简单快速分离，具体见实施例1中所述。
114.对比例2
115.本对比例是在实施例5的基础上，但不进行超高压处理，获得小米多酚得率为4.2mg g-1
。可见，采用超高压处理可有效提高小米多酚得率。
116.使用传统的乙醇提取小米多酚得率为0.5mg g-1
，本发明中的方法采用可转换低共熔溶剂提取的最佳得率为5.4mg g-1
，可见，本发明的方法大大提高了小米多酚的提取效率，且本发明选择用的可切换低共熔溶剂在小米多酚提取中具有良好的可循环性。
117.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任
何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。