技术特征：
1.梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)质粒dna纯化：取培养完成的菌液进行细胞裂解，裂解后采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化质粒dna；(2)mrna纯化：纯化质粒dna经体外转录、加帽加尾核苷酸修饰得到目标mrna后，加入dna酶，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化mrna；(3)mrna包封或装载后纯化：纯化mrna包封或装载后，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到mrna疫苗。2.根据权利要求1所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(1)-(3)中，梯度孔结构中空纤维超滤膜材质分别为聚偏氟乙烯pvdf、聚醚砜pes、聚砜psf、磺化聚醚砜spes、磺化聚砜spsf、改性聚醚砜mpes、改性聚砜mpsf、聚丙烯腈pan中的至少一种，梯度孔结构中空纤维超滤膜切割分子量范围为50kda-750kda。3.根据权利要求1所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(1)-(3)中，分别采用内压式中空纤维式膜组件进行过滤，组件中梯度孔结构中空纤维超滤膜直径为0.1-4mm，内外径之比为1.2-4；过滤方法为切向流过滤或死端过滤；死端过滤压力为0.05-0.3mpa，切向流过滤流速为15-150l/(h﹒m2)；步骤(1)-(3)任一步骤过滤后均通过试剂i进行反冲洗；反冲洗所用试剂i，包括盐酸缓冲液tris-hcl、磷酸缓冲液tris-h3po4、乙二胺四乙酸缓冲液tris-edta、乙酸缓冲液tris-ch3cooh中的至少一种，试剂i的浓度范围0.1mol/l～1mol/l，ph范围7-10。4.根据权利要求1所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(1)中，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤去除细胞碎片、蛋白质、宿主基因组dna、rna和内毒素；步骤(2)中，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤去除酶、游离核苷酸、核糖核苷三磷酸酯、反应体系中的免疫原性杂质、外源rna片段、dsrna及dna小片段；步骤(3)中，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤去除未包封或未装载的mrna以及其他杂质。5.根据权利要求4所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，
步骤(1)中，细胞裂解后对蛋白质进行变性沉淀，抽取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤除去细胞碎片和内毒素，获得浓缩液i；对浓缩液i中的宿主基因组dna进行沉淀，抽取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液ii；对浓缩液ii中的rna进行沉淀，抽取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液iii；对浓缩液iii中的质粒dna进行沉淀，沉淀出的质粒dna复溶过滤2-3次，采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，取最终浓缩液得到纯化质粒dna。6.根据权利要求5所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞裂解所用试剂为试剂ii，包括氢氧化钾koh、氢氧化钠naoh、柠檬酸钠、甲醇钠ch3ona、乙醇钾ch3cook中的至少一种，试剂ii浓度为0.01-5mol/l，处理时间为5-200min；沉淀蛋白质所用试剂包括试剂i，试剂i包括盐酸缓冲液tris-hcl、磷酸缓冲液tris-h3po4、乙二胺四乙酸缓冲液tris-edta、乙酸缓冲液tris-ch3cooh中的至少一种，试剂i的ph范围7-10，处理时间5-120min；沉淀宿主基因组dna所用试剂包括试剂iii，试剂iii包括pvpk15、pvpk30、pvpk60、pvpk90、pvpk120、聚乙烯醇pva、乙二醇中的至少一种，试剂iii浓度0.001-1mol/l，试剂iii处理时间10-60min；沉淀rna所用试剂包括试剂iv，试剂iv包括氯化钙cacl2、氯化钠nacl、硝酸钠nano3、氯化钡bacl2、硝酸钾kno3、硝酸钙ca(no3)2的至少一种，试剂iv浓度为0.01-5mol/l，试剂iv处理时间为10-180min；浓缩液iii沉淀质粒dna所用试剂包括试剂v，试剂v包括peg200、peg400、peg800、peg1000、peg2000、peg4000、peg8000、peg10000、peg20000中的至少一种，试剂v浓度为0.01-5mol/l，试剂v处理时间10-60min。7.根据权利要求4所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(2)中，目标mrna溶液直接采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤除去游离核苷酸、核糖核苷三磷酸酯、反应体系中的免疫原性杂质，获得浓缩液iv；获得浓缩液iv加入dna酶处理后，对酶及蛋白质进行盐析，盐析后取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液v；对浓缩液v中的外源rna进行沉淀，沉淀后取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液vi；对浓缩液vi中的dsrna进行沉淀，沉淀后取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液vii；对浓缩液vii中的mrna进行盐析，直接采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液，浓缩液中的mrna复溶过滤2-3次，取最终浓缩液得到纯化mrna。
8.根据权利要求7所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(2)中，盐析酶所用试剂包括试剂vi，试剂vi包括十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基磺酸钠、十六烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠中的至少一种，试剂vi浓度为0.01-5mol/l，试剂vi处理时间为10-60min；沉淀外源rna所用试剂包括试剂vii，试剂vii包括秋水仙碱、2-羟基乙胺、三异丙醇胺、叔丁胺、异丁胺中的至少一种，试剂vii浓度为0.01-2mol/l，试剂vii处理时间10-40min；沉淀dsrna所用试剂包括试剂viii，试剂viii包括乙二醇、乙醇、正丁醇、丙三醇、丙酮、丙醇中的至少一种，试剂viii为浓度为0.01-5mol/l，试剂viii为处理时间10-100min；盐析mrna所用试剂包括试剂ix，试剂ix包括氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵中的至少一种，试剂ix为浓度为0.01-5mol/l，试剂ix处理时间为10-180min。9.根据权利要求4所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(3)中，mrna包封或装载后的溶液直接采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤除去其他小分子杂质，获得浓缩液viii；对浓缩液viii未包封或未装载的mrna进行盐析，盐析后取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液，即为纯化后的包封/转载mrna。10.根据权利要求9所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mrna疫苗的工艺方法，其特征在于，步骤(3)中，盐析未包封或未装载的mrna所用试剂包括试剂x，试剂x包括四甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、亚精胺中的至少一种，试剂x浓度为0.01-5mol/l，试剂x处理时间为10-100min。
技术总结
本发明梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，属于疫苗生产纯化技术领域，包括如下步骤：(1)质粒DNA纯化：取培养完成的菌液进行细胞裂解，裂解后采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化质粒DNA；(2)mRNA纯化：纯化质粒DNA经体外转录、加帽加尾核苷酸修饰得到目标mRNA后，加入DNA酶，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化mRNA；(3)mRNA包封或装载后纯化：纯化mRNA包封或装载后，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到mRNA疫苗。本发明方法可减少有机溶剂的使用，并且有利于实现mRNA疫苗的大规模连续化低成本纯化。mRNA疫苗的大规模连续化低成本纯化。mRNA疫苗的大规模连续化低成本纯化。
技术研发人员：张磊 张一琛 李曼晴
受保护的技术使用者：天津鼎芯膜科技有限公司
技术研发日：2022.11.07
技术公布日：2023/3/7