肌肉靶向复合物及其用于治疗弗里德赖希共济失调的用途的制作方法

本技术涉及被设计为靶向fxn rna的寡核苷酸和涉及用于将该寡核苷酸递送至细胞(例如，肌细胞)的靶向复合物，及其用途，特别是与疾病治疗相关的用途。

背景技术：

1、弗里德赖希共济失调(friedreich’s ataxia)是一种罕见的常染色体隐性疾病，其导致肌肉组织和神经系统的进行性损伤。该疾病的标志包括严重的心脏病，例如肥厚型心肌病、心肌纤维化和心力衰竭，以及脊髓和周围神经系统中的神经纤维变性。弗里德赖希共济失调是由编码共济蛋白(frataxin)的fxn基因中的突变引起的，共济蛋白是被提出在铁稳态中发挥作用的蛋白质。特别地，患有该疾病的对象具有扩增的三核苷酸gaa序列，其导致降低的共济蛋白水平。弗里德赖希共济失调是遗传性共济失调的最常见形式，患病率为每50,000人中约1人。在最严重的情况下，患有该疾病的对象可能到10至20岁以后无法自由行走，并且许多对象具有缩短的预期寿命。在弗里德赖希共济失调中，fxn表达的降低可能归因于表观遗传沉默和/或剪接掉包含扩增的gaa重复的fxn前体mrna的第一个内含子的能力降低。除了减轻(combat)疾病症状的支持性护理之外，目前没有可用于弗里德赖希共济失调的有效治疗。

技术实现思路

1、根据一些方面，本公开内容提供了被设计为靶向fxn rna的寡核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了与fxn rna互补的寡核苷酸，所述fxn rna可用于通过阻断包含扩增的gaa重复的fxn rna来提高功能性fxn的水平，例如在患有或怀疑患有弗里德赖希共济失调的对象中。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导rna酶h介导的包含扩增的gaa重复的fxn rna的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为抑制包含扩增的gaa重复的fxn rna与染色体dna形成rna环(r-环)。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为通过抑制包含扩增的gaa重复的fxn rna与染色体dna之间的rna环(r-环)的形成来增强fxn蛋白水平。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的生物利用度和/或血清稳定性特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的结合亲和力特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的毒性特征。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有低补体激活和/或细胞因子诱导特性。

2、在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸与其他分子(例如，靶向剂，例如，肌肉靶向剂)缀合。因此，在一些方面中，本公开内容提供了靶向特定细胞类型以用于将寡核苷酸递送至那些细胞的复合物。例如，在一些实施方案中，本公开内容提供了靶向肌细胞以用于将寡核苷酸递送至肌细胞的复合物。在一些实施方案中，本文中提供的复合物对于递送分子载荷特别有用，所述分子载荷通过降低包含扩增的疾病相关重复的fxn rna的水平来提高功能性fxn蛋白的表达或活性，例如，在患有或怀疑患有弗里德赖希共济失调的对象中。在一些实施方案中，本文中提供的复合物包含与肌细胞表面上的受体特异性结合以用于将分子载荷递送至肌细胞的肌肉靶向剂(例如，肌肉靶向抗体)。在一些实施方案中，复合物通过受体介导的内化被摄取到细胞中，然后分子载荷可被释放以在细胞内部执行功能。例如，经工程化以递送寡核苷酸的复合物可释放该寡核苷酸，使得该寡核苷酸可阻断肌细胞中的突变体fxn。在一些实施方案中，通过对连接复合物的寡核苷酸和肌肉靶向剂的共价接头进行内体切割而释放该寡核苷酸。

3、本公开的内容一些方面提供了复合物，所述复合物包含与配置成用于提高fxn表达的寡核苷酸共价连接的肌肉靶向剂，其中所述寡核苷酸包含与包含疾病相关的扩增gaa重复的fxn rna的重复区的互补区，其中所述重复区包含如seq id no：162至164中任一者所示的靶序列，并且其中所述互补区的长度为至少12个核苷酸。

4、在一些实施方案中，肌肉靶向剂是抗转铁蛋白受体1(tfr1)抗体。

5、在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含seq id no：165至176中任一者的至少16个连续核苷酸，其中每个u任选且独立地是t。在一些实施方案中，寡核苷酸包含seq id no：165至176中任一者的核苷酸序列，并且其中每个u任选且独立地是t。

6、在一些实施方案中，寡核苷酸包含5’-x-y-z-3’构型，其中x包含3至5个连接的核苷，其中x中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷；y包含6至14个连接的2’-脱氧核糖核苷，其中y中的每个胞苷任选且独立地是5-甲基-胞苷；并且z包含3至5个连接的核苷，其中z中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷。

7、在一些实施方案中，寡核苷酸包含seq id no：165至167中任一者的核苷酸序列，其中x包含5个连接的核苷，并且x中的每个核苷是2’-moe修饰的核苷；y包含10个连接的2’-脱氧核糖核苷，其中y中的每个胞苷任选且独立地是5-甲基-胞苷；并且z包含5个连接的核苷，并且z中的每个核苷是2’-moe修饰的核苷。

8、在一些实施方案中，寡核苷酸包含seq id no：165至167中任一者的核苷酸序列，其中x包含5个连接的核苷，其中x中的每个核苷是lna核苷；y包含10个连接的2’-脱氧核糖核苷，其中y中的每个胞苷任选且独立地是5-甲基-胞苷；并且z包含5个连接的核苷，其中z中的每个核苷是lna核苷。

9、在一些实施方案中，寡核苷酸包含seq id no：171至173中任一者的核苷酸序列，其中x包含3个连接的核苷，其中x中的每个核苷是lna核苷；y包含14个连接的2’-脱氧核糖核苷，其中y中的每个胞苷任选且独立地是5-甲基-胞苷；并且z包含3个连接的核苷，其中z中的每个核苷是lna核苷。

10、在一些实施方案中，寡核苷酸包含seq id no：168至170中任一者的核苷酸序列，并且其中寡核苷酸的每个核苷是2’-moe修饰的核苷。

11、在一些实施方案中，寡核苷酸包含seq id no：168至170中任一者的核苷酸序列，并且其中寡核苷酸中的每个t是lna核苷，并且寡核苷酸中的每个c是5-甲基-脱氧胞苷。

12、在一些实施方案中，寡核苷酸包含seq id no：174至176中任一者的核苷酸序列，并且其中寡核苷酸中的每个c是lna核苷，并且每个t是脱氧胸苷。

13、在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

14、在一些实施方案中，寡核苷酸选自：

15、

16、其中“xdc”表示5-甲基-脱氧胞苷；“dn”表示2’-脱氧核糖核苷；“+n”表示lna核苷；“on”表示2’-moe修饰的核糖核苷；“oc”表示5-甲基-2’-moe-胞苷；“+c”表示5-甲基-2’-4’-双环-胞苷(2’-4’亚甲基桥)；“ou”表示5-甲基-2’-moe-尿苷；“+u”表示5-甲基-2’-4’-双环-尿苷(2’-4’亚甲基桥)；“*”表示硫代磷酸酯核苷间键联。

17、在一些实施方案中，抗ttr1抗体包含表2中列出的任何抗tfr1抗体的重链互补决定区1(heavy chain complementarity determining region 1，cdr-h1)、重链互补决定区2(heavy chain complementarity determining region 2，cdr-h2)、重链互补决定区3(heavy chain complementarity determining region 3，cdr-h3)、轻链互补决定区1(light chain complementarity determining region 1，cdr-l1)、轻链互补决定区2(light chain complementarity determining region 2，cdr-l2)、轻链互补决定区3(light chain complementarity determining region 3，cdr-l3)。

18、在一些实施方案中，抗tfr1抗体包含表3中列出的任何抗tfr1抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)。在一些实施方案中，抗tfr1抗体是fab。在一些实施方案中，fab包含表5中列出的任何抗tfr1 fab的重链和轻链。

19、在一些实施方案中，肌肉靶向剂和寡核苷酸通过接头共价连接。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸-瓜氨酸序列。

20、本公开内容的一些方面提供了提高肌细胞中fxn表达的方法，所述方法包括使所述肌细胞与有效量的用于促进所述寡核苷酸内化到所述肌细胞中的本文中所述的复合物接触。

21、本公开内容的一些方面提供了治疗弗里德赖希共济失调(fa)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的本文中所述复合物，其中所述对象具有包含疾病相关gaa重复的突变体fxn等位基因。

22、在一些实方案中，施用所述复合物导致fxn蛋白水平提高。

23、本公开内容的一些方面提供了选自以下的寡核苷酸：

24、

25、

26、其中“xdc”表示5-甲基-脱氧胞苷；“dn”表示2’-脱氧核糖核苷；“+n”表示lna核苷；“on”表示2’-moe修饰的核糖核苷；“oc”表示5-甲基-2’-moe-胞苷；“+c”表示5-甲基-2’-4’-双环-胞苷(2’-4’亚甲基桥)；“ou”表示5-甲基-2’-moe-尿苷；“+u”表示5-甲基-2’-4’-双环-尿苷(2’-4’亚甲基桥)；“*”表示硫代磷酸酯核苷间键联。

27、还提供了组合物，其包含钠盐形式的本文中所述的寡核苷酸。