RNA构建体及其用途的制作方法

背景技术：

1、使用rna多核苷酸作为治疗剂是一个新兴的领域。

技术实现思路

1、本公开确定了某些可能与rna疗法相关的挑战。

2、例如，在一些实施方案中，本公开确定了在表达rna治疗剂编码的多肽时可能遇到的某些问题的来源。其中，本公开提供用于提高编码有效负载的rna的翻译效率和/或rna编码的多肽有效负载的表达的技术。在一些实施方案中，可以用rna多核苷酸提高翻译效率和/或rna编码的有效负载的表达，所述rna多核苷酸包含：cap1结构(例如，m27,3’-ogppp(m12’-o)apg帽)；包含本文公开的帽近端序列的5’utr，以及编码有效负载的序列。在不希望受理论束缚的情况下，本公开提出通过真核翻译起始因子4e(eif4e)，而不是具有三角形四肽重复序列-1(ifit1)的ifn-诱导蛋白优先结合至包含cap1结构，例如m27,3’-ogppp(m12’-o)apg帽，和/或包含本文公开的帽近端序列的5’utr的rna，可以实现提高翻译效率和/或多肽有效负载表达。例如，在一些实施方案中，提出eif4e可以与ifit1竞争结合至基于5’帽结构的rna多核苷酸。此外，本公开提供某些可能有利于eif4e结合的技术，至少相对于ifit1结合，和/或可能以其他方式增强翻译。

3、在一些实施方案中，本公开指出，靠近5’帽(例如，5’cap1结构)的特定序列的特性可以影响相关有效负载的翻译效率。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本公开提出，eif4e与ifit1竞争结合至rna多核苷酸，这是基于5’帽下游的一个或多个核苷酸的特性，例如，如本文公开的帽近端序列。在一些实施方案中，本公开证实，5’帽(例如，5’cap 1结构)下游的agaau或agcac序列可以提高翻译。本公开提出，这种序列(例如，agaau或agcac)的存在可以增加eif4e结合，至少相对于ifit1而言。

4、可选地或额外地，本公开记录了在编码有效负载的rna多核苷酸中避免(例如，确保不存在)自杂交序列(在某些情况下，其可以称作自互补序列)的某些优点。例如，本公开证实，这种不存在可以提高相关的(例如，rna编码的)有效负载的翻译(例如，翻译效率)，和/或对于相关的(例如，rna编码的)有效负载的翻译(例如，翻译效率)是必需的，和/或对于由此编码的多肽表达是必需的。在不希望受理论束缚的情况下，据信自杂交序列(特别是与kozak序列、5’utr元件和/或3’utr元件内的序列或者包含一个或多个kozak序列、5’utr元件和/或3’utr元件的序列杂交的序列)会干扰翻译的一个或多个方面。例如，在一些实施方案中，有人提出这种自杂交可以通过自杂交至所述rna多核苷酸中的互补序列来抑制转录和/或翻译因子与rna多核苷酸的结合。

5、进一步可选地或额外地，在一些实施方案中，本公开定义了特定脂质组分，和/或其比例，所述组分在向受试者给药(例如，通过注射，如通过肌肉内注射或通过静脉内注射)时可能在递送核酸，特别是rna(例如，治疗性rna或其他编码多肽的rna)中特别有用或有效。例如，在一些实施方案中，本公开证实，脂质alc-0315对于如本文所述的递送异常和特别有用。

6、本文特别公开了一种组合物或药物制品，其包含rna多核苷酸，所述rna多核苷酸包含：(i)5’帽，是或包含cap1结构，例如，如本文公开的；(ii)包含帽近端序列的5’utr序列，例如，如本文公开的；以及(iii)编码有效负载的序列。本文还公开了制备和使用它们的方法，例如，在受试者中诱导免疫应答。

7、本文提供一种包含rna多核苷酸的组合物或药物制品，所述rna多核苷酸包含：

8、包含cap1结构的5’帽；包含rna多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

9、(i)所述cap1结构包含m7g(5')ppp(5')(2'omen1)pn2，其中n1是rna多核苷酸的+1位置，n2是rna多核苷酸的+2位置，并且其中n1和n2各自独立地选自：a、c、g或u；并且

10、(ii)所述帽近端序列包含cap1结构的n1和n2，以及：

11、(a)选自以下的序列：a3a4x5(seq id no:1)；c3a4x5(seq id no:2)；a3c4a5(seq idno:3)和a3u4g5(seq id no:4)；或者

12、(b)包含x3y4x5(seq id no:7)的序列；

13、其中x3(在seq id no:7中+3位置的核苷酸x)或x5(在seq id no:1或seq id no:2中+5位置的核苷酸x)各自独立地选自a、g、c或u；以及

14、其中y4(在seq id no:7中+4位置的核苷酸y)不是c。

15、本公开还提供一种组合物或药物制品，其包含rna多核苷酸，所述rna多核苷酸包含：5’帽；包含rna多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

16、(i)所述5’帽包含cap1结构，所述cap1结构包含g*ppp(m12'-o)n1pn2，其中：

17、n1是rna多核苷酸的+1位置，n2是rna多核苷酸的+2位置，并且其中n1和n2各自独立地选自a、c、g或u；以及

18、g*包含以下结构：

19、

20、其中代表g*与ppp基团的第一个磷原子结合的键，r1是ch3，r2是oh或o-ch3，并且r3是o-ch3；以及

21、(ii)所述帽近端序列包含cap1结构的n1和n2，以及：

22、(a)选自以下的序列：a3a4x5(seq id no:1)；c3a4x5(seq id no:2)；a3c4a5(seq idno:3)和a3u4g5(seq id no:4)；或者

23、(b)包含x3y4x5(seq id no:7)的序列；

24、其中x3(在seq id no:7中+3位置的核苷酸x)或x5(在seq id no:1或seq id no:2中+5位置的核苷酸x)各自独立地选自a、g、c或u；以及

25、其中y4(在seq id no:7中+4位置的核苷酸y)不是c。

26、本文还提供一种组合物或药物制品，其包含rna多核苷酸，所述rna多核苷酸包含：

27、包含cap1结构的5’帽；包含rna多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

28、(i)所述cap1结构包含m7(3’omeg)(5')ppp(5')(2'omea1)pg2，其中a1是rna多核苷酸的+1位置，并且g2是rna多核苷酸的+2位置；以及

29、(ii)所述帽近端序列包含cap1结构的a1和g2，以及包含以下的序列：分别在rna多核苷酸的+3、+4和+5位置的a3a4u5。

30、本公开提供一种组合物或药物制品，其包含编码基因产物的加帽rna多核苷酸，所述rna多核苷酸包含式：

31、

32、其中r1是ch3，r2是oh或o-ch3，并且r3是o-ch3，

33、其中b1是任何核碱基，优选a；b2是任何核碱基，优选g；b3是任何核碱基，优选a或c；b4是任何核碱基；并且b5是任何核碱基，以及

34、其中，当向受试者给药rna多核苷酸时，在给药后约6小时和在给药后约48小时，编码的基因产物的表达水平相差不超过5倍。

35、本文提供一种包含本文公开的rna多核苷酸的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本文公开的组合物或药物制品。

36、本文还提供一种制造药物组合物的方法，例如，包含本文公开的rna多核苷酸，所述方法是通过将rna多核苷酸与脂质组合以形成包封所述rna的脂质纳米颗粒。

37、本公开提供一种适合产生cap1加帽rna的核酸模板，其中从所述核酸模板的模板链转录的前五个核苷酸包含序列n1pn2pn3pn4pn5，其中n1是任何核苷酸，优选t；n2是任何核苷酸，优选c；n3是任何核苷酸，优选t或g；n4是任何核苷酸；并且n5是任何核苷酸。在一些实施方案中，dna模板包含：5’utr、编码有效负载的序列、3’utr和polya序列。

38、本文提供体外转录反应体系(reaction)，包括：

39、(i)模板dna，其包含与本文公开的rna多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；

40、(ii)聚合酶；以及

41、(iii)rna多核苷酸。

42、本文还提供一种从提供的体外转录反应体系分离的rna多核苷酸。

43、本公开提供一种制备加帽rna的方法，所述方法包括，在帽结构的存在下转录核酸模板，其中所述帽结构包含g*ppp(m12'-o)n1pn2，

44、其中n1与核酸模板的+1位置互补，n2与核酸模板的+2位置互补，并且n1和n2独立地选自a、c、g或u，

45、其中核酸模板的+3位置是任何核苷酸，优选t或g；核酸模板的+4位置是任何核苷酸；并且核酸模板的+5位置是任何核苷酸，

46、其中g*包含以下结构：

47、

48、其中代表g*与ppp基团的第一个磷原子结合的键，r1是ch3，r2是oh或o-ch3，并且r3是o-ch3。

49、本文还提供一种包含dna多核苷酸的组合物，所述dna多核苷酸包含与本文提供的rna多核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，本文公开的dna多核苷酸可以用来转录本文公开的rna多核苷酸。

50、本公开提供一种方法，包括：向受试者给药药物组合物，所述药物组合物包含配制在脂质纳米颗粒(lnp)或脂质复合体(lipoplex)(lpx)颗粒中的本文公开的rna多核苷酸，例如，如本文公开的。

51、本文还提供一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药药物组合物，所述药物组合物包含配制在脂质纳米颗粒(lnp)或脂质复合体(lpx)颗粒中的本文公开的rna多核苷酸，例如，如本文公开的。

52、本文提供一种对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法通过施用药物组合物，所述药物组合物包含配制在脂质纳米颗粒(lnp)或脂质复合体(lpx)颗粒中的本文公开的rna多核苷酸，例如，如本文公开的。

53、本公开提供一种减少与rna多核苷酸的ifit1相互作用的方法，所述rna多核苷酸包含5’帽以及包含rna多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，所述方法包括以下步骤：

54、提供rna多核苷酸的变体，其与亲本rna多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代，以及

55、确定相对于亲本rna多核苷酸，所述变体与ifit1的相互作用减少。

56、本文还提供一种制备多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

57、提供rna多核苷酸，其包含5’帽，包含rna多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列；

58、其中rna多核苷酸的特征在于，当在给药rna多核苷酸或包含rna多核苷酸的组合物的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高和/或表达持续时间增加。

59、本文提供一种增加rna多核苷酸可译性的方法，所述rna多核苷酸包含5’帽，包含rna多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列，所述方法包括以下步骤：

60、提供rna多核苷酸的变体，其与亲本rna多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代；以及

61、确定所述变体的表达相对于亲本rna多核苷酸的表达有增加。

62、本文提供一种治疗性rna，其包括含有cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：

63、在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在rna多核苷酸的+1位置的x，在rna多核苷酸的+2位置的x，在rna多核苷酸的+3位置的x，在rna多核苷酸的+4位置的x，以及在rna多核苷酸的+5位置的x，当以lnp制剂向受试者给药时，证实增加rna的表达。在一些实施方案中，x选自a、c、g或u。

64、本公开提供一种治疗性rna，其包括含有cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在rna多核苷酸的+1位置的x，在rna多核苷酸的+2位置的x，在rna多核苷酸的+3位置的c，在rna多核苷酸的+4位置的a，以及在rna多核苷酸的+5位置的x，当以lnp制剂向受试者给药时，证实增加rna的表达。在一些实施方案中，x选自a、c、g或u。

65、本文还提供治疗性rna，其包括含有cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在rna多核苷酸的+1位置的a，在rna多核苷酸的+2位置的g，在rna多核苷酸的+3位置的a，在rna多核苷酸的+4位置的a，以及在rna多核苷酸的+5位置的u，当以lnp制剂向受试者给药时，证实增加rna的表达。

66、本公开提供一种增加rna多核苷酸翻译的方法，所述rna多核苷酸包括含有cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在rna多核苷酸的+1位置的x，在rna多核苷酸的+2位置的x，在rna多核苷酸的+3位置的a，在rna多核苷酸的+4位置的a，以及在rna多核苷酸的+5位置的x。在一些实施方案中，x选自a、c、g或u。

67、本文提供一种增加rna多核苷酸翻译的方法，所述rna多核苷酸包括含有cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在rna多核苷酸的+1位置的x，在rna多核苷酸的+2位置的x，在rna多核苷酸的+3位置的c，在rna多核苷酸的+4位置的a，以及在rna多核苷酸的+5位置的x。在一些实施方案中，x选自a、c、g或u。

68、本文还提供一种增加rna多核苷酸翻译的方法，所述rna多核苷酸包括含有cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在rna多核苷酸的+1位置的a，在rna多核苷酸的+2位置的g，在rna多核苷酸的+3位置的a，在rna多核苷酸的+4位置的a，以及在rna多核苷酸的+5位置的u。

69、本文还提供一种为包含5’帽、帽近端序列和有效负载序列的rna多核苷酸提供框架的方法，所述方法包括以下步骤：

70、评价rna多核苷酸的至少两个变体，其中：

71、每个变体包括相同的5’帽和有效负载序列；以及

72、所述变体在帽近端序列的一个或多个特定残基处彼此不同；

73、其中所述评价包括确定有效负载序列的表达水平和/或表达持续时间；以及

74、选择5’帽和帽近端序列的至少一个组合，所述组合相对于至少一个其他组合表现出升高的表达。