脂质纳米颗粒及其应用

本发明涉及医药，尤其涉及一种脂质纳米颗粒及其应用。

背景技术：

1、通过序列设计，信使核糖核酸(mrna)理论上可以表达任何蛋白质，如抗原、治疗性蛋白、基因编辑元件等，因此它可被用于疫苗研制、疾病治疗、基因编辑等诸多领域。此外，由于mrna生产工艺简单、成本低、周期短等特点，在临床转化中也备受青睐。2020年底，mrna新冠疫苗的研发成功将该药物的优势发挥的淋漓尽致，制药优势渐显。由于mrna最终需要在细胞质中才能发挥作用，因而在实际应用中非常依赖递送载体，而脂质纳米颗粒(lnp)被认为是最佳选择之一。

2、传统lnp由可离子化阳离子脂质、聚合物结合脂质、胆固醇和辅助磷脂四种脂质组成。其中，可电离阳离子脂质是关键成分，其酸解离常数(pka)决定了lnp的电离行为和表面电荷，并进一步影响lnp的稳定性和毒性；可离子化阳离子脂质通常包含有叔胺头部和疏水尾巴结构，该脂质在酸性(如，ph 4.0)缓冲液中能被质子化，进而完成对mrna的包裹，之后通过调整溶液到中性环境(如，ph 7.4)可将其脱质子化恢复至不带电荷状态。一旦lnp进入到细胞的内涵体/溶酶体(ph 4-5)环境中，可离子化阳离子脂质可再次被质子化，从而促进被包裹的mrna释放到细胞质中完成蛋白表达。聚合物结合脂质通常是聚乙二醇(peg)脂质，主要作用是减少纳米颗粒聚集，减少单核吞噬细胞吞噬，延长lnp在体内的循环时间。胆固醇和辅助磷脂属于辅助成分，有助于促进lnp与细胞膜的融合，对lnp的递送效率和稳定性起到重要的调节作用。其中最常用的辅助磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)，辅助磷脂的共性通常都包括一个亲水性磷脂酰头部和疏水性碳链尾部。目前，fda已经正式批准三款rna-lnp药物，包括第一款问世的sirna药物(onpattro)和首次问世的mrna疫苗(两款新冠疫苗)。这些rna药物研发史上里程碑事件足以表明，lnp是当前递送rna药物最佳选择之一。当前成功的案例中，可以把mrna递送到肝脏、肌肉中，而在其他脏器和细胞的靶向递送相对困难，因此实现器官、细胞的精准递送能够极大程度拓宽mrna药物的应用前景。已有一些研究表明，通过化学结构改造、lnp制剂优化可实现mrna的肝、肺、脾靶向递送，但尚且做不到特定组织内的细胞靶向递送。

3、microrna(mirna)是一种小的非编码rna分子，它在基因调控中起着重要的作用。mirna参与各种生物过程，包括发育、分化和疾病进展。mirna通过结合mrna分子并抑制其转化为蛋白质，或促使其降解来发挥功能。这种基因表达的调控使mirna能够控制多个基因的活动。不同细胞类群含有的mirna种类、以及丰度区别很大，这一特性为调控外源导入的mrna表达提供了可能，有望实现mrna的组织器官和细胞靶向递送和疾病治疗。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明提供了一种组织器官和细胞双重特异性递送的新型mrna-lnp技术，并在黑色素瘤肺转移小鼠模型中实现了肿瘤细胞特异性递送和治疗的概念验证。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种脂质纳米颗粒，包含可离子化阳离子脂质(ionizable cationic lipid)、聚合物结合脂质和靶向性功能脂质；所述聚合物结合脂质选自peg或其衍生物修饰的脂质，优选为dmg-peg；所述聚合物结合脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比为0.5-3.0％，优选为0.8-2.8％，更优选为0.9-2.6％。

4、进一步地，在本发明所述脂质纳米颗粒的组成成分中，所述聚合物结合脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比更优选为1-2.5％。可选地，所述聚合物结合脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比为1-1.4％、1.2-1.6％、1.4-1.8％、1.6-2.0％、1.8-2.2％、2.0-2.4％、2.1-2.5％、2.2-2.5％、2.3-2.5％或2.4-2.5％。

5、优选地，所述脂质纳米颗粒的组成成分不包含辅助磷脂。所述辅助磷脂通常包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)中的一种。上述辅助磷脂相同点是均为双亲性脂质(含有亲水性磷脂头部和疏水性碳链尾部)，其中pc表示磷脂酰胆碱，pe表示磷脂酰乙醇胺。基于此，领域内也有其他辅助磷脂被应用在lnp中，包括有dopc,dppc,dmpc，dspe等，这些辅助磷脂主要不同点为疏水尾部的长短以及不饱和键的数量。本发明提供的脂质纳米颗粒成分简单，具有递送效率高、特异靶向性表现良好的优点。

6、在本发明中，所述可离子化阳离子脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比优选为为45-85％，更优选为49-82％。

7、进一步地，在本发明所述脂质纳米颗粒的组成成分中，所述可离子化阳离子脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比更优选为49-82％。可选地，所述可离子化阳离子脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比为49-59％、54-64％、59-69％、64-74％、69-79％或74-82％。

8、优选地，所述可离子化阳离子脂质选自sm102、c12-200或alc-0315中的至少一种。

9、更优选地，所述可离子化阳离子脂质选自sm102。

10、在本发明中，所述靶向性功能脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比优选为10-60％，更优选为16-50％。

11、进一步地，在本发明所述脂质纳米颗粒的组成成分中，所述靶向性功能脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比更优选为16-49％。可选地，所述靶向性功能脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比为16-27％、21-32％、27-38％、32-43％或38-49％。

12、优选地，所述靶向性功能脂质选自18pa、dotap、胆固醇、epc、dotma、ddab、18ps、18pg、β-sitosterol或campesterol中的至少一种。

13、更优选地，所述靶向性功能脂质选自dotap、胆固醇、18pa中的一种。

14、进一步的，在本发明优选的实施方式中，所述脂质纳米颗粒由可离子化阳离子脂质、聚合物结合脂质和靶向性功能脂质组成。该脂质纳米颗粒成分简单，效率高，便于优化，且靶向性表现最优，显著高于常规lnp。

15、在本发明更为具体的优选实施方式中，所述脂质纳米颗粒的组成为：peg脂质1-2.5mol％，且所述可离子化阳离子脂质和所述靶向性功能脂质的摩尔比为1-5:1。

16、更优选地，所述脂质纳米颗粒的组成为如下所列组成中的一种：

17、组成a：peg脂质1-2.5mol％，且sm102和dotap的摩尔比为1-5:1；

18、组成b：peg脂质1-2.5mol％，且sm102和18pa的摩尔比为2-5:1；

19、组成c：peg脂质1-2.5mol％，且sm102和胆固醇的摩尔比为1-3:1。

20、第二方面，本发明提供了所述脂质纳米颗粒作为药物递送载体的应用。

21、优选地，所述药物递送载体的靶向器官包括肝、肺或脾中的至少一种。

22、优选地，当所述脂质纳米颗粒中的靶向性功能脂质为包含季铵基团脂质时，所述药物递送载体的靶向器官为肺；更优选地，所述靶向性功能脂质为dotap、epc、dotma中至少一种。

23、或者，当所述脂质纳米颗粒中的靶向性功能脂质为胆固醇及其类似物时，所述药物递送载体的靶向器官为肝；更优选地，所述靶向性功能脂质为胆固醇、β-sitosterol、campesterol中至少一种。

24、或者，当所述脂质纳米颗粒中的靶向性功能脂质为带有负电荷脂质时，所述药物递送载体的靶向器官为脾；更优选地，所述靶向性功能脂质为18pa、18pg、18ps中至少一种。

25、第三方面，本发明提供了一种核酸药物，所述核酸药物包含所述脂质纳米颗粒，还包含功能性mrna。

26、在本发明中，所述功能性mrna优选用于表达荧光报告蛋白、基因编辑蛋白、肿瘤杀伤蛋白、具有治疗性功能蛋白。

27、优选地，所述报告蛋白的蛋白质序列包括seq id no：01；

28、或者，所述基因编辑蛋白的蛋白质序列包括seq id no：02；

29、或者，所述肿瘤杀伤蛋白为中性粒细胞弹性蛋白酶elane，elane变体，及其下游效应蛋白；所述肿瘤杀伤蛋白的蛋白质序列选自seq id no：03、seq id no：04、seq id no：05或seq id no：06。

30、更优选地，所述肿瘤杀伤蛋白的氨基酸序列为seq id no：03(helane)。helane是在已知helane全长(helane-fl)基础上进行的截短序列，具有更强、更明显的癌细胞选择杀伤性。

31、第四方面，本发明提供了一种靶向递送平台，所述靶向递送平台包含所述核酸药物，且所述核酸药物的功能性mrna中还包含mirna靶向结合位点(mirna target site，mirts)；所述mirts具有抑制所述功能性mrna表达或促进所述功能性mrna降解的功能。

32、优选地，所述mirts的核苷酸序列包括seq id no：07；

33、或者，所述mirts的核苷酸序列包括seq id no：08；

34、或者，所述mirts的核苷酸序列包括seq id no：09；

35、或者，所述mirts的核苷酸序列包括seq id no：10。

36、在本发明中，所述靶向递送平台用于实现特定组织器官和细胞的mrna递送和表达。其中，包含seq id no：07，seq id no：08，seq id no：09，seq id no：10位点的mrna用于降低在脾脏表达；包含seq id no：08位点的mrna用于降低在正常脾脏和肺部的表达，但在肿瘤细胞中维持正常表达。包含seq id no：08位点的mrna通过表达肿瘤杀伤蛋白实现肺部肿瘤细胞精准递送和杀伤。

37、本发明所述靶向递送平台将脂质纳米颗粒的组织器官靶向性、mirts的细胞靶向性和mrna的选择杀伤特性结合起来，实现了组织器官和细胞的双重特异性递送及治疗作用。

38、第五方面，本发明提供了所述脂质纳米颗粒，或者所述核酸药物，或者所述靶向递送平台在组织和细胞靶向递送(尤其是精准递送功能性mrna在特定组织和细胞中表达)的应用。

39、在本发明中，所述应用进一步可用于蛋白替换治疗、基因编辑治疗、抗肿瘤治疗。

40、优选地，所述应用包括将所述脂质纳米颗粒用于癌症相关疾病的治疗。

41、更优选地，所述癌症包括肝、肺、脾组织中的原位或者转移癌症的治疗。

42、有益效果：

43、本发明提供了一种脂质纳米颗粒及其应用。所述脂质纳米颗粒包含可离子化阳离子脂质、聚合物结合脂质和靶向性功能脂质；所述聚合物结合脂质选自peg或其衍生物修饰的脂质；所述聚合物结合脂质占所述脂质纳米颗粒的摩尔百分比为0.5-3.0％。本发明提供的脂质纳米颗粒具有成分简单，效率高，便于优化的优点，且靶向性表现优异，显著高于常规lnp。将本发明所述脂质纳米颗粒应用于药物递送载体，具有显著技术优势，前景广阔。