人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液及其制备方法与应用

本发明属于水凝胶，具体涉及一种人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液及其制备方法与应用，尤其涉及该人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液在制备人参外泌体水凝胶中的应用。

背景技术：

1、由于植物来源的细胞外囊泡具有安全性、经济性和良好的生物相容性，近年来相关研究不断推进，人们从许多植物中分离出囊泡样纳米颗粒，包括人参、生姜、西兰花、苦瓜、葡萄、葡萄柚、柠檬、橙子等。其中，多项研究显示，人参源性囊泡样纳米颗粒（gdvlns）在多种疾病类型中具有出色的治疗效果。

2、现有技术中，植物源性囊泡样纳米颗粒的获取方法，主要包括组织破坏法和组织浸润离心法。前者通过在搅拌器中破碎植物组织并使所得到的汁液超高速离心以除去细胞碎片来提取纳米颗粒；后者是利用真空或压力将囊泡从隔离缓冲液（vib）渗透到植物细胞的外质体空间中，离心后得到外质体。

3、针对于gdvlns，通常采用密度梯度纯化法获取，过程为：先收集植物组织，洗净后将其研磨或匀浆，制成细胞悬液，通过低速离心，去除较大的细胞碎片和杂质，得到的上清液在更高转速下，进一步沉淀外泌体等较小的囊泡结构，得到外泌体粗提物；然后利用蔗糖和重水来制备密度梯度溶液，形成从低到高的连续或不连续的密度梯度；再将外泌体粗提物加在密度梯度溶液的顶部，使用超速离心机进行离心，在离心力的作用下，外泌体将依据自身密度在梯度溶液中迁移，直至到达与其密度相等的位置，从而与其他密度不同的杂质分离开来，离心结束后，可观察到在密度梯度溶液中形成的不同条带或分层，外泌体通常位于某一特定的密度区域，如蔗糖密度梯度离心时，外泌体常集中在密度为1.13g/ml-1.21g/ml的区域；最后使用注射器或移液器小心地吸取该区域的溶液，收集含有外泌体的组分，再用适量的缓冲液进行稀释，然后通过高速离心，沉淀外泌体，去除残留的梯度介质和杂质，得到纯化的外泌体。

4、但是，密度梯度纯化法通常采用重水蔗糖溶液作为隔离缓冲液，存在以下缺点：

5、重水蔗糖溶液与gdvlns的渗透压相差较大，影响外泌体的稳定性，导致其结构改变或功能丧失；

6、重水在某些实验中可能对细胞或生物样本产生毒性，影响实验结果；

7、重水的成本相对较高，可能增加实验的整体费用。

8、此外，密度梯度纯化法在超高速离心富集囊泡纳米颗粒时，囊泡纳米颗粒易受到离心力冲击，导致囊泡的形态和结构发生变化，可能影响到后续的实验研究，并且在弃去上清液后，管底牢固附着的囊泡颗粒并不利于收集，若在收集过程中反复用液体吹打不仅影响囊泡的完整性，还容易导致结块和产率降低。

技术实现思路

1、本发明为解决现有技术中，gdvlns的获取方法影响gdvlns的结构、形态和功能，稳定性差，且成本高，产品不易收集等技术问题，提供一种人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液及其制备方法与应用。

2、第一方面，本发明提供一种人参源性囊泡样纳米颗粒的制备方法，步骤如下：

3、步骤一、gdvlns混悬液的分离

4、先将清洁的新鲜人参在含有蛋白抑制剂的缓冲液中进行细胞破碎，破碎后的混合物经一次离心后，得到一次上清液，再经二次离心后，得到二次上清液，最后向二次上清液中滴加碘克沙醇，经三次离心后，弃上清，得到粗人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液；

5、步骤二、gdvlns混悬液的纯化

6、先将粗人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液加入多层不同浓度的含有碘克沙醇的缓冲液中，一次离心后，收集浓度为20v/w%的含有碘克沙醇的缓冲液中的黄色混悬液，再将黄色混悬液加入稀释缓冲液中，滴加碘克沙醇，二次离心后，弃上清，得到纯化人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液；

7、所述不同浓度的浓度范围为5v/m%-40v/m%，多层不同浓度的含有碘克沙醇的缓冲液按照浓度由低到高从上至下分布。

8、优选的是，步骤一中，所述蛋白抑制剂为cocktail（商品化名称，含有aebsf、aprotinin、bestatin、e-64、leupeptin 和 pepstatin a的混合蛋白酶抑制剂）。

9、优选的是，步骤一中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

10、优选的是，步骤一中，所述清洁的新鲜人参、蛋白酶抑制剂、缓冲液的配比为100-150g:2-3ml:200-300ml。

11、优选的是，步骤一中，所述含有蛋白抑制剂的缓冲液与碘克沙醇的体积比为200-300:1。

12、优选的是，步骤一中，所述一次离心的温度为4℃，速度为800-1500xg，时间为15-20min。

13、优选的是，步骤一中，所述二次离心的温度为4℃，速度为10000-20000xg，时间为1-1.5h。

14、优选的是，步骤一中，所述三次离心的温度为4℃，速度为100000-200000xg，时间为1-1.5h。

15、优选的是，步骤二中，所述粗人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液的体积与多层不同浓度的含有碘克沙醇的缓冲液的总体积的比为1:10-30。

16、优选的是，步骤二中，所述多层不同浓度的含有碘克沙醇的缓冲液，从上至下依次为浓度5v/m%、10v/m%、20v/m%、40v/m%的含有碘克沙醇的缓冲液，每层含有碘克沙醇的缓冲液的体积相等。

17、优选的是，步骤二中，所述含有碘克沙醇的缓冲液中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

18、优选的是，步骤二中，所述黄色混悬液、稀释缓冲液和碘克沙醇的体积比为1:10-30:1。

19、优选的是，步骤二中，所述稀释缓冲液为磷酸盐缓冲液。

20、优选的是，步骤二中，所述一次离心的温度为4℃，速度为100000-200000xg，时间为1.5-2h。

21、优选的是，步骤二中，所述二次离心的温度为4℃，速度为100000-200000xg，时间为1-1.5h。

22、第二方面，本发明还提供上述制备方法制备的人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液。

23、第三方面，本发明还提供上述人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液在制备促进皮肤伤口愈合的药物中的应用。

24、第四方面，本发明还提供一种人参外泌体水凝胶，包括10-15ml：3-4.5g的gdvlns混悬液和pf-127（泊洛沙姆f127）粉末。

25、第五方面，本发明还提供上述人参外泌体水凝胶的制备方法，按配比将gdvlns混悬液和预冷的pf-127粉末混合，在4℃下，搅拌至pf-127粉末完全溶解，生成人参外泌体水凝胶。

26、优选的是，所述预冷温度为4℃。

27、优选的是，所述搅拌速度为600-8000xg。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

29、本发明的人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液的制备方法中，采用碘克沙醇分离和纯化gdvlns，离心液具有更加明显的gdvlns层，得到的gdvlns维持了更好的形态，以及更干净的背景，显示出更好的提取效果。

30、本发明的人参源性囊泡样纳米颗粒混悬液对巨噬细胞的m1型极化造成影响，显示出较好的抗炎效果，能够促进皮肤伤口愈合。

31、本发明的人参外泌体水凝胶，能够促进皮肤伤口愈合，具有良好的伤口愈合效率。