疫苗组合物的制作方法
【专利说明】疫苗组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及疫苗组合物和所述组合物在保护人类受试者免于登革热病的方法中 的用途。
[0002] 发明背景 登革热是继疟疾之后的第二最重要的感染性热带病，世界人口中大约有一半生活在有 流行病传播风险的地区。估计每年有5千万-1亿例登革热病，导致500, 000名患者因登革 出血热（DHF)住院，并导致约25, 000例死亡。
[0003] 登革热病感染流行于100多个热带国家，这些国家中有60个已证实有登革出血热 (DHF) (Gubler, 2002， TRENDSinMicrobiology, 10: 100-103)。
[0004] 登革热病是由黄病毒属的4种在抗原上截然不同但密切相关的登革热病毒血清 型引起的（Gubler等，1988，载于：Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM 编辑，Boca Raton (FL) : CRC Press: 223-60 ;Kautner 等，1997，J. of Pediatrics, 131: 516-524 ;Rigau_Perez等，1998，Lancet, 352: 971-977 ;Vaughn等， 1997，J. Infect. Dis.，176: 322-30)。
[0005] 登革热病通常通过被登革热病毒感染的埃及伊蚊（Jeofes 吸血时注入该 病毒而传播。在4-10天的潜伏期后，疾病突然开始，并接着以下3个阶段：发热（2-7天）、危急（24-48小时一期间可能出现严重的并发症）和恢复（48-72小时）。在危急期，可能出 现危及生命的并发症，例如出血、休克和急性器官损害。适当管理这些不可预测的结局可降 低病死率。在7-10天之后完成登革热的医治，但是长期虚弱是正常的。通常观察到白细胞 和血小板数减少。
[0006] 登革出血热（DHF)是登革热病毒感染的潜在致死并发症。除有极度嗜睡和困倦 以外，DHF的特征还在于高烧和登革热病的症状。血管通透性增加和稳态异常可导致血容 量降低、低血压，以及在严重情况下低血容量性休克和内出血。两个因素在DHF的发生中 似乎起主要作用一快速病毒复制伴尚水平的病毒血症（该病的严重程度与病毒血症水平 有关；Vaughn等，2000，J. Inf. Dis.，181: 2-9)和主要炎性反应伴高水平炎性介质 释放（Rothman 和 Ennis, 1999，Virology, 257: 1-6 ;Alan L. Rothman. 2011，Nature Reviews Immunology, 11: 532-543)。在无治疗的情况下，DHF的死亡率可达10%，但在可 获得治疗的大多数中心区，死亡率〈1%。
[0007] 登革热休克综合征（DSS)是DHF的常见进展，并且常常是致死的。DSS产生于导致 血浆渗漏进入血管外腔隙的泛发性血管炎。DSS的特征是脉量快且差、低血压、四肢发冷和 烦燥。
[0008] 在亚洲，主要在儿童中观察到DHF和DSS，患有DHF儿童中约90%小于15岁 (Malavige 等，2004，Postgrad Med. J.，80: 588-601 ;Meulen 等，2000，Trop. Med Int. Health，5:325-9)。相比之下，在加勒比海和中美洲的爆发主要累及成人（Malavige 等，2004，Postgrad Med. J., 80: 588-601)。
[0009]登革热病毒的4种血清型具有约60-80%序列同源性。被一种登革热血清型感 染提供持久的同源免疫但有限的异源免疫（Sabin，1952，Am. J. Trop. Med. Hyg.，I: 30-50)。因此，被一种登革热血清型感染的个体之后可能被不同的血清型感染。在过去，曾 认为产生于不同登革热病毒血清型的第二次感染在理论上是发生DHF的风险因素，因为显 示DHF的大部分患者之前曾暴露于其它4种登革热病毒血清型的至少一种。
[0010] 至今，没有针对登革热病的特效治疗。对登革热病的治疗是针对症状的，卧床休 息，通过退热药和镇痛药控制发烧和疼痛及大量饮水。DHF的治疗需要平衡液体丢失、置换 凝血因子和输注肝素。
[0011] 由于登革热预防措施（例如蚊虫控制和个人防护免叮咬）的功效有限，难于实施 而且昂贵，因此安全和有效的登革热疫苗可能是最佳的预防方式。然而，没有目前可获得的 经许可的该类型的疫苗。
[0012] 因此需要开发当用于保护人类受试者免于登革热病的方法时证实是有功效的疫 苗组合物。
[0013] 发明概沐 本发明涉及用于保护人类受试者免于登革热病的方法的疫苗组合物，其中所述组合物 包含： (i) 选自以下的登革热抗原： (a) 活的减毒登革热病毒； (b) 灭活的登革热病毒； (c) 活的减毒或灭活的嵌合登革热病毒； (d) 登革热病毒样颗粒（VLP);和 (e) (a)-(d)的两种或更多种的组合； 或 (ii) 能够在人细胞中表达登革热抗原的核酸构建体或病毒载体，所述登革热抗原是 登革热VLP。
[0014] 本发明还涉及本发明的疫苗组合物在用于制备保护人类受试者免于登革热病的 药物中的用途。
[0015] 本发明还涉及保护人类受试者免于登革热病的方法，其中所述方法包括给予所述 人类受试者有效量的本发明的组合物。
[0016] 另外，本发明涉及包括本发明的组合物和在保护人类受试者免于登革热病的方法 中使用所述组合物的使用说明书的药盒。
[0017] 附图描沐 图1说曰月YF-VAX cDNA通过RT-PCR构建和克隆。
[0018] 定义 本文所用术语"登革热病"是指在被4种登革热病毒血清型的任何一种感染之后个体 出现的临床症状。自1970以来，按照世界卫生组织准则，临床登革热被归类为：（i)登革热 (dengue fever)，或（ii)登革出血热（World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 第2版.Geneva: WHO, 1997 ； ISBN 92 4 154500 3)。2009年，WHO颁布了新的准则，将临床登革热归类为：⑴发出警告 标志或无警告标志的登革热，或（ii)严重登革热。两种分类见Srikiatkachorn等，Clin. Infect. Dis. (2011) 53(6): 563的图1和2。按照较早的分类，登革热的特征为选自以 下的至少两种症状：头痛、关节痛、眶后痛、皮瘆、肌痛、出血现象和白细胞减少以及支持性 血清学或在与其它已证实的登革热病情的相同地点和时间出现过。当发热、出血现象、血小 板减少和血浆渗漏的证据所有这些全被观察到时，证实已发展成为登革出血热。按照较新 的分类，登革热的诊断要求存在发热和选自恶心、呕吐、皮瘆、疼痛的至少两种临床症状、阳 性止血带试验或选自以下的任何警告标志：腹部疼痛和触痛、持续呕吐、临床流体蓄积、粘 膜出血、嗜眠或烦燥、肝增大超过2 cm或血细胞比容增加同时伴血小板计数快速降低。当 观察到以下任何事件时，诊断为重度登革热：导致休克或呼吸窘迫的严重血浆渗漏、由临床 医生评价为严重出血或严重器官受累。
[0019] 本文所用术语"登革出血热或DHF"是指病毒学上已证实的登革热病，其中发热、出 血现象、血小板减少和血浆渗漏的证据全都被观察到。还根据其严重程度可进一步定义本 文所用的DHF。例如，DHF可定义为I级、II级、III级或IV级（World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 第2片反. Geneva: WHO, 1997 ;ISBN 92 4 154500 3)。I级定义为发热伴发非特异性全身症状；唯一 的出血现象是阳性止血带试验和/或易瘀伤。II级定义为除I级患者的表现以外的自发性 出血，通常呈皮肤或其它出血形式。III级定义为表现为脉搏急速微弱和脉压缩小或低血压 的循环衰竭，伴以存在皮肤湿冷和烦燥。IV级定义为无可检测血压或脉搏的深度休克。本 领域技术人员应了解，在本发明的实践中，例如防止DHF的方法，所述DHF不必是病毒学上 已证实的。
[0020] 本f所用术语"病毒学hP,证实的登革热"是指由通过例如反转录酶聚合酶链式 反应（RT-PCR)或登革热非结构I (NSl)蛋白酶联免疫吸附测定法（ELISA)证实的登革热 病毒诱导的急性发热发作。在RT-PCR方法中，血清样品通过Callahan等人的方法测试（J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 4119)。简单地说，使用商用试剂盒，从血清中提取RNA以 弃去潜在的Taq聚合酶抑制剂或干扰因子。然后用来自登革热NS5基因序列的血清型特异 性引物进行RT-PCR反应。结果表示为与含有已知浓度的整合至质粒的病毒基因组血清型 特异性核酸序列的标准品比较的Iog ltlGEQ (基因组当量）/mL的浓度。在ELISA方法中，将 50 yL的患者血清、阳性对照、阴性对照或截止值对照（cut-off control) 1:2稀释于样品 稀释剂中，并与100 U L稀的辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗NSl单克隆Ab (MAb)混合。 加入稀的血清和缀合物以俘获抗NSl MAb包被的微孔，将板在37°C下孵育90分钟。当NSl 存在于血清中时，形成俘获MAb/NSl/HRP标记的MAb复合物。通过阳性孔中的比色反应检 测复合物，所述比色反应通过加入160 UL 3, 3'，5, 5'四甲基联苯胺（TMB)底物并在室温 下避光孵育30分钟来诱导。加入100 y L终止溶液（IN H2SO4)终止反应，并读板。通过试 验样品的平均光密度（OD)除以截止值对照的平均OD (-式四份测试），求出各样品的样品 比率。样品比率〈〇. 5、0. 5-〈1. 0和彡1分别表示阴性、不明确和阳性结果。
[0021] 本f所用术语"病毒学h P,证实的重度登革热"是指如1997 WHO分类定义的登革 出血热（DHF)，且其进一步的特征为下列另外列举的症状：需要输血的出血、毛细血管通透 性的客观证据、循环衰竭的征兆或脏象。
[0022] 本文所用术语"登革热休克综合征"是指上文定义的最严重的DHF并发症。按照 1997 WHO分类，DSS相当于III级和IV级的DHF。
[0023] 术语"登革热病毒"、"登革热病毒"和"DEN"可互换伸用。它们是指属于黄病毒 科（flaviviridae)黄病毒属的正单链RNA病毒。有4种不同血清型的登革热病毒（血清 型1、2、3和4)，它们具有约60-80%序列同源性。基因组的组构包含下列元件：5'非编码区 (NCR)、编码结构蛋白（衣壳（C)、前膜（prM)和包膜（E))的区域和编码非结构蛋白（NS1-N S2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)的区域和3' NCR。登革热病毒基因组编码不间断编码区， 其翻译为进行翻译后加工的单一多蛋白。
[0024] 在本发明的情况下，"疫苗登革热病毒"是指通过将疫苗登革热病毒给予免疫活性 受试者能够诱导针对所述疫苗登革热病毒来自于其中的登革热病毒血清型的中和抗体的 病毒。可用于本发明方法的疫苗登革热病毒的实例包括灭活登革热病毒、活的减毒登革热 病毒和活的减毒或灭活嵌合登革热病毒。用于本发明的疫苗登革热病毒的血清型包括血清 型1、2、3和4。优选用于本发明的疫苗登革热病毒是活的减毒嵌合登革热病毒。
[0025] 本文所用表述"灭活病毒"是指在允许复制相应的野生型病毒的细胞中不能复制 到任何有效程度的病毒。病毒可通过本领域技术人员熟知的多种方法灭活。用于灭活病毒 的方法的实例包括化学处理或照射处理（包括热或通常呈X射线或紫外辐射形式的电磁辐 射）。
[0026] 本文所用的术语"灭活登革热病毒"是指含有全部登革热结构蛋白(env、前膜/膜 蛋白和衣壳蛋白）和灭活病毒RNA的灭活野生型病毒。灭活的登革热病毒也可指灭活的嵌 合登革热病毒。灭活登革热病毒描述于例如美国专利号6, 254, 873。
[0027] 本f所用术语"活的减毒病毒或LAV"是指不能诱导特征在于与相应的野牛塑病毒 相关的相同组症状的疾病状态的病毒。活的减毒病毒的实例是本领域众所周知的。可通过 例如重组DNA技术、位点定向诱变、遗传操作、复制型细胞的系列传代、化学诱变处理或电 磁辐射，自野生型病毒制备活的减毒病毒。
[0028] 本f所用术语"活的减毒登革热病毒"是指通讨导致毒力减弱和无法诱导特征在 于与相应的野生型登革热病毒有关的相同组症状的疾病状态的遗传修饰，来源于有毒的野 生型登革热病毒的活的登革热病毒。可用于本发明实践中的活的减毒登革热病毒的实例包 括 VDV-l、VDV-2 和描述于例如以下申请的毒株：WO 02/66621、W0 00/57904、W0 00/57908、 TO 00/57909、W0 00/57910、W0 02/0950075 和 WO 02/102828。可用于本发明方法的血清型 1的活的减毒登革热病毒包括VDV-1。可用于本发明方法的血清型2的活的减毒登革热病 毒包括VDV-2和LAV-2。
[0029] "Y2Y"和"Vero登革热痔苗'，在本文中可互换使用，并命名为能够在Vero细胞中 复制并能够在人中诱导特异性体液反应（包括诱导中和抗体）的活的减毒登革热病毒。
[0030] DEN-I 16007/PDK13毒株，亦称"LAV1"，来源于通过原代狗肾（TOK)细胞进行11 次传代的野生型DEN-I (登革热病毒血清型1) 16007毒株（DEN-1 16007/roKll)。LAVl描 述于Mahidol University名下的专利申请EPl 159968,并提交给国家微生物培养物保藏 中心（National Microorganisms Cultures Collection，CNCM)，编号为 1-2480。"VDV-1" 是通过对Vero细胞的后续适应而来源于LAVl的病毒；在这一方面，从LAVl提取RNA并纯 化后，转染至Vero细胞。随后通过板纯化，在Vero细胞中扩增，获得VDV-I毒株。与DEN-I 16007/PDK13毒株（通过PDK细胞13次传代）相比，VDV-I毒株具有14个另外的突变。用 于制备和表征VDV-I毒株的方法描述于Sanofi-Pasteur和疾病控制与预防中心（Center for Disease Control and Prevention)名下的以编号W006/134433提交的国际专利申请。
[0031] DEN-2 16681/PDK53毒株，亦称为"LAV2"，获自野生型毒株DEN-2 (登革热病毒血 清型2) 16681，其通过PDK细胞进行50次传代（DEN-2 16681/PDK50KLAV2描述于Mahidol University名下的专利申请EP1159968,并提交给国家微生物培养物保藏中心（CNCM)，编 号为1-2481。"VDV-2"是通讨对Vero细胞的后续适应而来源于LAV2的毒株；在这一方面， 自LAV2提取RNA并纯化后，转染至Vero细胞。随后通过板纯化和在Vero细胞中扩增来获 得VDV-2毒株。与DEN-2 16681/PDK53毒株（通过PDK细胞53次传代）相比，VDV-2毒株 具有10个另外的突变，包括4个沉默突变。用于制备和表征VDV-2毒株的方法描述于以 Sanofi-Pasteur和疾病控制与预防中心（Center for Disease Control and Prevention) 的名义以编号W006/134443提交的国际专利申请。VDV-2毒株的完整核酸序列如SEQ ID NO: 24所示。VDV-2毒株M蛋白的序列如SEQ ID NO: 27所示，VDV-2毒株E蛋白的序列 如 SEQ ID NO: 26 所示。
[0032] 通过在Vero细胞中扩增制备VDV 1和2毒株。收获所产生的病毒，并通过过滤从 细胞碎片中澄清。通过用酶处理消化DNA。通过超滤清除杂质。可通过浓缩方法提高感染 滴度。在加入稳定剂后，毒株在用前以冻干或冷冻形式保存，然后在需要时重构。
[0033] 在本发明的情况下，"登革热嵌合体或嵌合登革热病毒"意指这样的受体黄病毒， 其中遗传骨架通过编码受体黄病毒的PrM和E蛋白的序列用登革热病毒的相应序列交换 而被修饰。受体黄病毒通常可被减毒。受体黄病毒可以是黄热病（YF)病毒，例如减毒的 YF 17D、YF 17DD和YF 17D204 (YF-VAX?)病毒；如果这样的话，所述嵌合体被称为YF/登 革热嵌合体。受体黄病毒还可以是登革热病毒，如果这样的话，它被称为登革热/登革热嵌 合体，特征为PrM和E蛋白的登革热病毒血清型与特征为遗传骨架的受体登革热病毒血清 型相同或不同。当血清型是相同的时，受体登革热病毒和PrM和E蛋白编码序列来源于其 中的登革热病毒是相同血清型的两种不同的病毒毒株。为了用于本发明，嵌合登革热病毒 通常是YF/登革热嵌合体。嵌合登革热病毒优选是灭活或活的减毒嵌合登革热病毒。有利 的是，本发明的活的减毒嵌合登革热病毒的受体黄病毒是YF 17D或YF 17D204。按照一个 实施