疾病的治疗方法
【专利说明】疾病的治疗方法
[0001] 相关申请的夺叉参考
[0002] 本发明要求2012年12月19日提交的临时申请61/739, 524的优先权，并且在此 将其全部公开内容引入作为参考。 发明领域
[0003] 本发明涉及抑制血管通透性过高（vascular hyperpermeability)以及由其导致 的水肿和其它不良作用的方法。本发明还涉及调节内皮细胞的细胞骨架的方法。本发明的 方法包括根据动物的体脂含量向该动物给药达那唑（达那唑）化合物。
【背景技术】
[0004] 血管内皮位于所有血管内部。其作为血液与组织和器官的界面。内皮形成半渗透 屏障，其保持血液隔室的完整性，但是允许水、离子、小分子、大分子和细胞以经调节的方式 通过。该过程的失调将导致血管渗漏到皮下组织中。渗漏到组织中的液体会引起水肿，其 在多种疾病中可以引起严重且危及生命的后果。因此，非常需要用于减少水肿，尤其是在水 肿的最早期阶段减少水肿，以及生理学上恢复内皮屏障的方法。
[0005] 内皮是控制分子从血液到组织实质交换的重要看门人。其在很大程度上控制具 体的血管床到血源性分子（blood-borne molecule)的渗透。内皮细胞屏障的通透性和 选择性主要取决于不同血管床内的微脉管系统内的内皮的结构和类型。不同器官的微血 管床内的内皮细胞显示出结构上的分化，其可以被分成三个主要的形态学类型：窦状型 (sinusoidal)、开窗型（fenestrated)和连续型。
[0006] 窦状内皮（也称为"不连续内皮"）具有大的细胞间和细胞内间隙（gap)并且无基 底膜，其使得分子从毛细血管腔到组织及从组织到毛细血管腔的分子运输受到最小限度地 限制。在肝脏、脾脏和骨髓中发现了窦状内皮。
[0007] 开窗内皮（fenestrated endothelium)的特征在于存在大量60~80nm直径的被 称为窗的圆形的跨细胞的开口。在需要小分子快速交换的组织和器官中发现开窗内皮，包 括肾脏（肾小球、肾小管周围毛细血管和上行直小血管（ascending vasa recta))、胰腺、肾 上腺、内分泌腺和肠。这些窗被细小的膈覆盖，除了在发育成熟的、健康的肾小球中的那些。 参考 Ichimura 等人，J. Am. Soc. N印hrol.，19:1463-1471 (2008)。
[0008] 连续性内皮不含有窗或大的间隙。相反地，连续性内皮的特征在于未被中断的内 皮细胞单层。体内的大部分内皮为连续性内皮，且连续性内皮被发现位于或包围脑（血脑 屏障）、膈、十二指肠、脂肪、心脏、肾脏的一些区域（乳突微脉管系统、下行直小血管）、大血 管、肺部、肠系膜、神经、视网膜（血视网膜屏障）、骨骼肌、睾丸和身体的其它组织和器官。
[0009] 连续性内皮中的内皮运输随细胞旁途径和跨细胞的途径出现被认为是一种常识。 细胞旁途径是在内皮细胞之间，通过内皮细胞间连接（IEJ)的途径。在未受干扰的连续性 内皮中，通过扩散和对流来实现水、离子和小分子的细胞旁途径运输。大量水（最多40%) 也通过被称为水通道的水-运输膜通道跨细胞地跨越内皮细胞屏障。大量刺激可以破坏 IEJ组织，从而打开内皮屏障中的间隙。这些细胞间间隙的形成允许液体、离子、大分子（例 如蛋白质）和其它血浆成分以不受限制的方式通过内皮细胞之间。这种细胞旁途径-引起 的通透性过高产生水肿和其它不良作用，其能够最终导致组织和器官的损害。
[0010] 跨细胞途径负责大分子跨过内皮细胞的主动转运，所述大分子例如白蛋白和其 它血浆蛋白质，该过程被称作"转胞吞作用"。大分子的运输出现在被称作为细胞膜穴样 凹陷的小泡中。几乎所有的连续性内皮具有丰富的细胞膜穴样凹陷，除了位于脑和睾丸 中的连续性内皮具有很少的细胞膜穴样凹陷。转胞吞作用是多步过程，其涉及连续的来 自质膜的细胞膜穴样凹陷芽殖和裂变和跨细胞的易位，以及随后的与相对质膜（opposite plasmalemma)的对接和融合，在此细胞膜穴样凹陷通过胞吐作用向间质中释放它们的成 分。在正常的生理学条件下，转胞吞作用是选择性的并且受到了严密的调控。
[0011] 对于跨细胞途径的本质重要性的认识正在逐步深入。血浆蛋白质的转胞吞作用， 尤其是白蛋白（其代表65%的血浆蛋白质）的转胞吞作用受到格外的关注因为其具有调节 经血管的血液渗透压梯度的能力。可以认识到，随着增加的白蛋白和其它血浆蛋白质的转 胞吞作用高于基础水平，会增加它们的组织蛋白质浓度，随后会导致水跨过内皮屏障移动， 从而产生水肿。
[0012] 通过转胞吞作用也会运输低密度脂蛋白（LDL)跨过内皮细胞。在高脂血症中，已 经通过检测LDL转胞吞作用的显著增加来作为动脉粥样硬化形成的初期事件。LDL在内皮 下空间聚集，并陷入在扩张的基底膜（basal lamina)和细胞外基质中。在高脂血症中内皮 下脂蛋白聚集，随后的一连串事件会导致粥样斑块的形成。已有报道称晚期的粥样硬化病 变有时会伴随IEJ的打开以及LDL和白蛋白大量不受控制的通过。
[0013] 血管并发症是糖尿病的标志。在大血管水平，动脉粥样硬化过程的加速往往表现 为疾病。关于微血管病，视网膜、肾小球以及神经的微脉管系统的变化导致最多种的临床并 发症，但是，随着研宄数量的持续增加，显示糖尿病也会影响其它器官的微脉管系统，例如 肠系膜、皮肤、骨骼肌、心脏、脑、以及肺部，导致另外的临床并发症。在所有这些血管床中， 血管通透性的改变可能代表了糖尿病内皮功能障碍的特点。
[0014] 在连续性内皮中，在糖尿病的早期，对于血浆大分子的毛细管的通透性过高被解 释为跨内皮的囊泡运输的强化（即，由增强转胞吞作用引起）而不是IEJ的脱稳定化。此 外，已有报道称糖尿病患者的内皮细胞包括脑的那些内皮细胞，含有与正常相比数量增加 的细胞膜穴样凹陷，以及糖化的蛋白质、尤其是糖化的白蛋白，其会被内皮细胞吸收，并且 以比它们天然形式明显更快的速度进行胞转作用。此外，增强的大分子转胞吞作用是会持 续到超过糖尿病早期阶段的过程，并且如果不对该疾病进行治疗，可能是导致糖尿病患者 组织和器官水肿的原因。该水肿随后导致组织和器官的损害。在高血压中也已经报道了大 分子跨细胞运输的类似的增加。
[0015] 细胞旁途径-引起的通透性过高也是糖尿病和糖尿病血管并发症的原因。细胞旁 途径的IEJ包括粘着连接（AJ)和紧密连接（TJ)。糖尿病改变在AJ和TJ两者中的特定蛋 白质的含量、磷酸化和定位，从而促进增加的内皮屏障通透性。
[0016] 为了支持上述讨论以及获得更多的信息，参考Frank等人，Cell Tissue Res. ,335:41-47(2009) ;Simionescu 等人，Cell Tissue Res. ,335:27-40(2009); van den Berg 等人，J. Cyst. Fibros. ,7(6): 515-519 (2008) ;Viazzi 等人，Hypertens. Res.，31:873-879(2008) ;Antonetti 等人，第 14 章，第 340-342 页，in Diabetic Retinopathy (由 Elia J.Duh 编辑，Humana Press，2008) ;Felinski 等人，Current Eye Research，30:949-957(2005) ;Pascariu 等人，Journal of Histochemistry&Cytoch emistry，52(1):65_76 (2004) ;Bouchard 等人，Diabetologia，45:1017-1025 (2002); Arshi 等人，Laboratory Investigation，80 (8) : 1171-1184 (2000) ;Vinores 等人， Documenta Ophthalmologica,97:217-228 (1999) ；0omen 等人，European Journal of Clinical Investigation，29:1035-1040(1999) ;Vinores 等人，Pathol. Res. Pract.， 194:497-505(1998) ;Antonetti 等人，Diabetes，47:1953-1959(1998); Popov 等人，Acta Diabetol.，34:285-293(1997) ;Yamaji 等人，Circulation Research，72:947-957 (1993) ;Vinores 等人，Histochemical Journal，25:648_663(1993); Beals 等人，Microvascular Research，45:11-19 (1993) ;Caldwell 等人，Investigative Ophthalmol. Visual Sci.，33 (5):16101619 (1992)〇
[0017] 通过转胞吞作用和细胞旁途径，也会发生开窗内皮中的内皮运输。此外，借由窗发 生内皮运输。开窗内皮对于水和小亲水溶解物具有显著高的通透性，这是因为窗的存在。
[0018] 窗可能会或可能不会被膈所覆盖。具有带膈的窗（diaphragmed fenestrae)的内 皮的位置包括内分泌组织（例如胰岛和肾上腺皮质）、胃肠粘膜以及肾脏的肾小管周围毛 细血管。具有带膈的窗的开窗内皮的血浆蛋白质的通透性不会超过连续性内皮的血浆蛋白 质的通透性。
[0019] 具有不带膈的窗的内皮的位置包括肾的肾小球。血管小球的开窗内皮被延伸到窗 内的多糖包被覆盖（形成所谓的"筛型塞子（seive plug)"）以及被更为松散关联的糖蛋 白的内皮细胞表面层覆盖。功能的选择通透性研究的数学分析已经确定血管小球的内皮细 胞多糖包被（包括存在于窗中的），以及与其关联的表面层占据循环中血浆白蛋白的最多 95%的固位（retention) 〇
[0020] 已经发现血管小球内皮中的窗的损失与一些疾病中的蛋白尿相关，这些疾病包括 糖尿病性肾病、移植肾肾小球病、先兆子痫、糖尿病、肾功能衰竭、环孢霉素A肾病、血清性 肾炎以及Thy-1肾炎。已经发现肌动蛋白重排，以及尤其是张力丝（stress fiber)的解聚 对于窗的形成和保持是重要的。
[0021] 为了支持上述关于开窗内皮的讨论以及获得额外的信息，参考Satchell 等人，Am. J.Physiol.Renal Physiol.，296:F947_F956(2009) ;Haraldsson 等人， Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.，18:331-335 (2009) ;Ichimura 等人，J. Am. Soc. Nephrol., 19:1463-1471 (2008) ；Ballermann? Nephron Physiol., 106:19-25 (2007)； Toyoda 等人，Diabetes，56:2155-2160(2007) ;Stan， "Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability，"，679-688 页，Endothelial Biomedicine (编 辑，Aird，Cambridge University 出 片反，Cambridge，2007) ； Simionescu 和 Antohe， "Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium:Changes in Various Pathologies，"42-69 页，The Vascular Endothelium I(编辑，Moncada 和 Higgs ，Springer-Verlag，Berlin，2006)〇
[0022] 通过转胞吞作用，发生窦状内皮中的内皮运输，且通过细胞间间隙（内皮之间的 狭缝）和细胞内间隙（窗）。用肌动蛋白丝_断裂药物治疗窦状内皮可以引起间隙数量 的显著和快速的增加，表明为对肌动蛋白细胞骨架内的内皮的孔隙率的调节。已经报道了 其它改变细胞骨架的药物会改变窗的直径。因此，窗-关联的细胞骨架可能会控制在窦 状内皮中内皮过滤的重要功能。在肝脏中，窗的减少（defenestration)(窗的损失）导 致内皮通透性的降低，其与一些疾病和病症的发病相关，这些疾病和病症包括老化、动脉 粥样硬化生成、动脉粥样硬化、肝硬化、纤维化、肝衰竭、原发性肝癌和转移性肝癌。为了 支持上述讨论以及获得更多的信息，参考Yokomori，Med. Mo 1. Morpho 1.，41:1-4(2008); Stan, "Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability, " 679-688 页， Endothelial Biomedicine (编辑，Aird, Cambridge University 出版，Cambridge, 2007)； DeLeve, "The Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell, "1226-1238 页，Endothelial Biomedicine (编辑，Aird, Cambridge University 出版，Cambridge, 2007) ;Pries 和 Kuebler，"Normal Endothelium, "1-40 页，The Vascular Endothelium I(编辑， Moncada 和 Higgs，Springer-Verlag, Berlin, 2006) ;Simionescu 和 Antohe, "Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium:Changes in Various Pathologies, "42-69 页，The Vascular Endothelium I(编辑，Moncada 和 Higgs, Springe r-Verlag，Berlin, 2006) ;Braet 和 Wisse，Comparative Hepatology, 1:1-17(2002) ;Kanai 等人，Anat.Rec.，244:175-181 (1996) ;Kempka 等人，Exp. Cell Res. ,176:38-48(1988); Kishimoto 等人，Am. J. Anat.，178:241-249 (1987)。
[0023] 糖尿病性视网膜病是最常见的糖尿病性眼疾病，并且是美国成年人失明的诱导原 因(National Eye Institute factsheet, 2009 年，www.nei.nih.gov/health/diabetic/retinopathy, asp)。在2000年，世界卫生组织公布，在美国糖尿病的患病率据报道为 17, 702, 000例。该报告还指出，截止到2030年，该患病率预计将上升至30, 312, 000例 (Wild，2004)。糖尿病性视网膜病是在视网膜脉管系统中进行性和蓄积性的变化，其包括微 动脉瘤、视网膜内出血和渗出物、血管迂曲、视网膜内微血管异常（IRMA)和视网膜前新血 管化形成（Boyd,等人 Canadian Diabetes Association Clinical Practice Guidelines Expert Committee 2008, S134-139)。视网膜前新血管化形成可导致玻璃体出血、视网 膜脱离、纤维化和永久性视力丧失。糖尿病性视网膜病还包括糖尿病性黄斑水肿（DME)， 其为液体外渗，涉及并威胁中央视力。糖尿病中大多数视力丧失是由于DME(Moss,等 人，Ophthalmology 1998 ;105:998_1003)。血管通透性增加和水肿在这一过程的早期发 生。在视网膜组织永久性被破坏之前，有效地治疗血管通透性和水肿可逆转或减缓糖尿病 的这些并发症（Gardner, et al. Current Diabetes Reports 2008;8:263-269 ;Sander，et al. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 2007;48:3983-3987;和 Antonetti,等人 Diabetes 2006 ;55:2401-2411)。
[0024] 对于有临床意义的糖尿病性黄斑水肿（CSME)的主要治疗包括视网膜激光光凝 术和玻璃体内雷珠单抗。对渗漏区域的视网膜激光光凝术可减少50%的中度视力丧失 (30%至15% )并减缓疾病进程。但是，激光治疗受限于：在一些情况下的疗效缺乏、程序 性不适、需要重复治疗和有烧蚀视网膜损害的风险，包括中心凹烧伤和伤疤，其可随时间 增加（American Academy of Ophthalmology Preferred PracticePattern?,Diabetic Retinopathy, 2008 ;Maeshima, et al. Retina. 2004 ;24:507-511)。在 2012 年 7 月 30 日，玻 璃体内雷珠单抗(LUCENTIS?)被批准用于治疗DME。这个注射到眼睛的抗血管内皮生长 因子（VEGF)疗法被证明是有效的，但出于以下原因无法给药至一些患者：有免疫反应、青 光眼、局部眼刺激的风险或眼内炎的发展，其可能造成完全视力丧失。此外，重复数月的过 程的高治疗花费对于很多患者而言很难负担。
[0025]除了常规措施，例如控制血糖、高血压和血脂，目前尚无有效地口服药物来治疗糖 尿病性视网膜病，尤其是DME。对新型药物疗法存在显著未满足的临床需求，所述新型药物 疗法可有效地治疗糖尿病性视网膜病和DME (Ryan，等人Am. J. Health Syst Pharm. 2007; 64(17Suppl, 12):S15-21)〇
【发明内容】
[0026] 本发明的一个实施方案涉及在有此需要的动物中抑制血管通透性过高的方法，包 括确定该动物体脂含量并根据该动物的体脂含量给药该动物血管通透性过高抑制量的达 那唑化合物。本发明的另一实施方案涉及在有此需要的动物中抑制血管通透性过高的方 法，包括给药该动物血管通透性过高抑制量的达那唑化合物，其中所述量对应于该动物的 体脂含量。
[0027] 在一个方面，确定步骤包括计算该动物的体质指数（BMI)。
[0028] 在另一方面，所述达那唑化合物可口服给药。在另一方面，所述达那唑化合物可以 约0. 5mg/BMI单位/天至约1. Omg/BMI单位/天的量给药。在另一方面，达那挫化合物可 每天给药两次。在另一方面，当该动物的BMI小于26时，达那挫化合物的量为约2mg/天至 约15mg/天。还在另一方面，该动物的BMI小于26时，达那挫化合物的量为约5mg/天。在 另一方面，当该动物的BMI为26至35时，则达那唑化合物的量为约2mg/天至约15mg/天。 在一个方面，当该动物的BMI为26至35时，达那唑化合物的量为约10mg/天。仍在另一方 面，当该动物的BMI大于35时，达那挫化合物的量为约5mg/天至约45mg/天。又在另一方 面，当该动物的BMI大于35时，达那唑化合物的量为约15mg/天。
[0029] 在其他方面，所述动物由于存在由血管通透性过高介导的疾病或病症，因此需要 达那唑化合物。达那唑化合物的给药可在诊断出该疾病或病症后立即开始。在各个方面， 该疾病或病症可为糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、老 年性黄斑退化症、脑部水肿、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状动脉微血管病变、脑微血管病变、 Eals病、损伤引起的水肿、与高血压有关的水肿、肾小球血管渗漏、失血性休克、欧文加斯综 合征、缺血、黄斑水肿、肾炎、肾病、肾病性水肿、肾病综合征、神经病、水肿导致的器官衰竭、 先兆子痫、肺水肿、肺动脉高压、肾衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉闭塞、视网膜 炎、视网膜病变、无症状性脑梗死、系统性炎症反应综合征、移植肾肾小球病、葡萄膜炎、血 管渗漏综合征、玻璃体出血或Von Hippie Lindau病。在优选的方面，该疾病或病症可为黄 斑水肿、神经病、视网膜病变或糖尿病的血管并发症。
[0030] 血管并发症可以是水肿、内皮下间隙的低密度脂蛋白的蓄积、加速的动脉粥样硬 化、脑血管壁加速老化、心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、糖尿病心肌病、糖尿病母 亲的胎儿的肺发育滞后、一个或多个肺部生理参数的变化、感染易感性增加、肠系膜中的血 管增生、糖尿病性神经病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病以及皮肤 发红、变色、干燥和溃疡。在优选的方面，所述血管并发症可以是水肿、糖尿病心肌病、糖尿 病性神经病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、非增殖性糖尿病性视网膜病或糖尿病 性肾病。
[0031] 在各个方面，由于该动物具有一个或多个由血管通透性过高介导的疾病或病症的 早期迹象或倾向于发展成由血管通透性过高介导的疾病或病症，则该动物需要达那唑化合 物。在一个方面，所述疾病或病症是糖尿病、高血压或动脉粥样硬化。
[0032] 在一个方面，所述血管通透性过高可以是见于脑、隔膜、十二指肠肌肉组织、脂肪、 心脏、肾脏、大血管、肺、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤或睾丸或其周围的连续内皮的 血管通透性过高。在一个方面，所述连续内皮可见于脑、心脏、肺、神经或视网膜，或在其周 围。
[0033] 仍在另一方面，所述血管通透性过高是见于肾、胰腺、肾上腺、内分泌腺体或肠或 其周围的开窗内皮的血管渗透性过高。在一个方面，所述开窗内皮见于肾脏中。
[0034] 本发明的达那唑化合物可为达那唑。
[0035] 本发明的达那唑化合物可为延时释放制剂。在一个方面，所述延时释放制剂包含 选自以下的成分：脂质体和多糖。
[0036] 本发明的动物可以是人。
[0037] 本发明的另一实施方案涉及调节动物内皮细胞的细胞骨架的方法，其包括确定该 动物的体重；并根据该动物的体重向其给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。在一 个方面，确定的步骤包括计算该动物的体质指数（BMI)。在另一方面，该细胞骨架的调节包 括抑制肌动蛋白张力丝（stress fiber)的形成。仍在另一方面，所述细胞骨架的调节包括 导致、增加或延长皮质肌动蛋白环的形成。又在另一方面，细胞骨架的调节包括RhoA的抑 制。
【附图说明】
[0038] 图1显示了跨内皮细胞单层的HRP通透性降低的变化百分比。达那唑的剂量响应 对处理了 24小时的细胞的HRP通透性有影响。数据表示为平均值+SEM，其是通过3个单独 的试验，一式三份进行计算的。* = P值〈.05,与载体相比。
[0039] 图2显示了达那唑的TEER响应：0. 1 ym的达那唑与载体相比的暂时响应。TEER 测量了跨生长于transwell植入物上的内皮细胞单层。越高的电阻说明了越高的屏障完整 性。
[0040] 图3A-3H显示了纤丝状肌动蛋白皮质重排和达那唑。视网膜内皮细胞用连接鬼笔 毒环肽的罗丹明染色。处理后，将细胞固定3小时（凝血酶暴露仅15分钟）。治疗组：载体 对照（图3A)，0? 1 y m达那唑（图3B)，1 y m达那唑（图3C)，10 y m达那唑（图3D)，100ng/ ml TNF- a (图 3E)，TNF- a +〇? 1 y m 达那唑（图 3F)，0? lU/mL 凝血酶（图 3G)和凝血酶 + y m 达那唑（图3H)。