人cd34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及人⑶34阴性祖细胞，其用于临床病况治疗中的医学用途。
【背景技术】
[0002]成人CD34阴性祖细胞是多能细胞，具有能够自我更新并且多谱系分化成造血、内皮和间充质种类的各种组织的能力。⑶34阴性祖细胞已经与免疫调节和再生潜能相关，这让人期待它们在用作治疗人疾病的细胞治疗剂的效果。
[0003]例如，国际专利申请WO 2008/150368A1公开了非基因修饰的CD34阴性干细胞在治疗下述病症中的医学用途:胃肠不适、糖尿病、肌营养不良和外科手术或身体创伤中的急性创伤愈合。Singer和Caplan描述了人间充质干细胞在炎症中作用的推测机制(N.G.Singer 和 A.1.Caplan:“Mesenchymal Stem Cells:Mechanisms ofInflammat1n”(间充质干细胞:炎症的机理)，Annual Review of Pathology:Mechanismsof Disease (病理学年度回顾:疾病的机理)，2011，457-478)。Tolar等回顾了关于MSC生物学的争议和最近的观点、临床前模型中MSC对同种异体反应的调节、以及MSC注射的临床经历(J.Tolar，K.Le Blanc，A.Keating，B.R.Blazar Concise Review:Hittingthe Right Spot with Mesenchymal Stromal Cells”(简明回顾:以间充质干细胞碰撞正确位点)，Stem Cells 2010 (干细胞 2010)，28，1446-1455)。Roemeling-van Rhi jn 等提供了来自实体器官移植中临床前和临床MSC研究的结果(MRoemeling-Van Rhi jn，W.Weimar，M.J.Hoogdui jn:“Mesenchymal Stem Cells Applicat1n for Solid OrganTransplantat1n” (间充质干细胞:实体器官移植的应用)，Current Opin1n in OrganTransplantat1n (器官移植的最新观点)，2012，17，55-62) ο类似地，Hoogduijn等评估了间充质干细胞疗法在临床器官移植中的进展(M.J.Hoogdui jn，F.C.Popp? A.Grohnert,M.J.Crop，M.van Rhijn，A.T.Rowshani? E.Eggenhofer，P.Renner，Μ.E.Reinders，T.J.Rabelink，L.J.van der Laan? F.J.Dor，J.N.1 jzermans，P.G.Genever? C.Lange，A.Durrbach，J.H.Houtgraaf? B.Christ，M.Seifert，M.Shagidulin，V.Donckier，R.Deans，0.Ringden，N.Perico，G.Remuzzi? A.Bartholomew，H.J.Schlitt，ff.Weimar，
C.C.Baan? M.H.Dahlkej 和 MISOT 研究小组:“Advancement of Mesenchymal Stem Cellin Solid Organ Transplantat1n(MISOT) ”(间充质干细胞在实体器官移植中的优势)，Transplantat1n (移植)，90，2010，124-126)。 LeBlanc和同事研究了间充质干细胞是否可减轻造血干细胞移植之后的移植物抗宿主病(GvHD) (K.Le Blanc, F.Frassoni, L.Ball，
F.Locatelli，H.Roelofs，1.Lewis，E.Lanino，B.Sundberg，Μ.E.Bernardo，M.Remberger?
G.Dini，R.M.Egeler? A.Bacigalupo，W.Fibbe，0.Ringden，Developmental Committee ofthe European Group for Blood and Marrow Transplantat1n (欧洲血液和骨髓移植发展委员会):“Mesenchymal Stem Cells for Treatment of Steroid Resistant，severe，acute Graft-versus-Host-Disease:A phase Two Study”(用于治疗抗类固醇的严重急性移植物抗宿主病的间充质干细胞:第二阶段研究)，Lancet，2008，371，1579-86)。Pati和同事提示MSC可通过出血性休克诱发的肺中局部和全身性作用靶向治疗血管通透性和炎症(S.Pati，M.H.Gerber，T.D.Menge，K.A.Wataha，Y.Zhao，J.A.Baumgartner，J.Zhao，P.A.Letourneau，M.P.Huby? L.A.Baer，J.R.Salsbury? R.A.Kozar? C.A.Wade，P.A.Walker，P.K.Dash，C.S.Cox Jr，M.F.Doursout，J.B.Holcomb:^Bone marrow derived mesenchymalstem cells inhibit inflammat1n and preserve vasculare endothelial integrityin the lungs after hemorrhagic shock”(源自间充质干细胞的骨髓抑制炎症并保护在失血性休克后肺中的血管内皮细胞层的完整性)，PLoS 0ne，2011，6，e25171)。Charixmi综述了骨髓间充质干细胞的多种特征包括基质和免疫调节能力，其可负责受伤组织修复机制的多功能性(P.Charbord:^Bone marrow mesenchymal stem cells historical overviewand concepts”(骨髓间充质干细胞:历史概述和概念)，Human Gene therapy (人类基因治疗)，2010，21，1045-56)。
[0004]随着强烈需要更好地理解CD34阴性祖细胞的治疗潜能和这些多功能细胞更有层次的医学用途，人们对于CD34阴性祖细胞的临床兴趣也随之增加。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种人CD34阴性祖细胞，其用于保护具有血管炎性疾病风险或患有血管炎性疾病的受试者的血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应。
[0006]本发明也提供了用于上述用途的人⑶34阴性祖细胞的制造方法，该方法包括下述步骤:
[0007]a)分离⑶34阴性祖细胞，
[0008]b)在细胞生长培养基中扩增⑶34阴性祖细胞至少12天，
[0009]c)收获⑶34阴性祖细胞。
[0010]本发明进一步提供一种测定方法，该方法测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力，其通过制备包含内皮靶细胞、细胞毒性CD8+T淋巴细胞和CD34阴性祖细胞的样品和包含内皮靶细胞和细胞毒性CD8+T淋巴细胞而没有CD34阴性祖细胞的参考样品，并比较样品和参考样品中的内皮靶细胞的裂解来进行测定。
【附图说明】
[0011]图1是显示测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力的方法的代表性实验设计的方块图。
[0012]图2显示通过使用来自不同供体的骨髓间充质干细胞/基质细胞的⑶34阴性祖细胞来保护内皮细胞避免同种异体CD8+细胞毒性T淋巴细胞引起的特异性裂解的结果。
[0013]图3显示内皮细胞被同种异体⑶8+CTL的裂解是I型MHC限制性的并且不依赖于天然杀伤细胞细胞或淋巴因子-激活的杀伤细胞活性。
[0014]图4显示骨髓MSC(BM-MSC)特异性地保护内皮细胞避免同种异体⑶8+细胞毒性T淋巴细胞引起的裂解，而尺寸匹配的对照细胞不体现保护作用。
[0015]图5显示通过使用源自各种组织的间充质干细胞/基质细胞的⑶34阴性祖细胞来保护内皮细胞的水平的比较结果。
[0016]术语和定义
[0017]在本申请中，使用的某些术语都具有如下阐释的含义。
[0018]如本文所使用，如果细胞或其任何前体细胞来自相同物种的另一受试者，就该受试者而言，细胞是“同种异体”的。
[0019]如本文所使用，“⑶34阴性祖细胞”是指在其表面上没有⑶34的干细胞。⑶34阴性祖细胞本身可也产生或分化成CD34阴性干细胞/基质细胞。CD34阴性祖细胞可包括造血性的、内皮的和/或间质的后裔。在某些优选的实施方式中，“CD34阴性祖细胞”是指CD34阴性间充质干细胞/基质细胞(MSC);而造血祖细胞和内皮祖细胞最终在成熟期间开始表达⑶34和其他同时存在的标志物。
[0020]如本文所使用，“血管内皮细胞层”应包括但不限于排列在血管的内部表面的细胞。特别是，血管内皮细胞层包括直接接触血液的内皮细胞。
[0021]如本文所使用，“免疫介导的细胞毒性反应”是指但不限于细胞介导的免疫应答，该细胞介导的免疫应答导致靶细胞的损伤或死亡，其中免疫应答直接作用于该靶细胞。在某些实施方式中，免疫介导的细胞毒性反应包括MHC介导的细胞免疫。
[0022]如本文所使用，“⑶34阴性间充质干细胞/基质细胞”是指满足国际细胞治疗协会建议的三个最低标准的干细胞:(I)当使用组织培养瓶保持在标准培养条件下时的塑料-附着；(2)通过流式细胞仪测量时，表达⑶105、⑶73和⑶90，并且，不表达⑶45、⑶34、CD14或CDllb、CD79a或CD19 ; (3)在标准体外分化条件下分化为成骨细胞、成熟脂肪细胞和成软骨细胞的能力(M.Dominici, K.Le Blanc, 1.Mueller, 1.Slaper-Cortenbach，F.Marini，D.Krause，R.Deans，A.Keating，Dj.Prockop，E.Horwitz:〃Minimal criteriafor defining multipotent mesenchymal stromal cells (定义多潜能间充质干细胞的最低标准).The Internat1nal Society for Cellular Therapy posit1n statement (国际细胞治疗协会的立场声明)〃，Cytotherapy (细胞疗法)，2006，8，315-7)。
[0023]在某些实施方式中，“⑶34阴性间充质干细胞/基质细胞”另外是指用γ-1FN刺激之后表达 B7-H1 的 MSC(PD-Ll) (M.Najar