验的平均值和标准偏差。发现BM-MSC在所有测试的E/T比例下以高显著性抑制因⑶8+CTL引起的同种异体内皮细胞的裂解(*，#，:p<0.001)。通过添加CD34阴性骨髓间充质干细胞/基质细胞，同种异体内皮靶细胞的特异性裂解平均下降约 65%，即 28.3±5.8%至 9.7±8.3%。
[0085]实施例3:CD34阴性祖细胞的免疫调节作用是内皮细胞层特异性的
[0086]作为对照，如实施例2中描述那样进行实验，不同之处是⑶34阴性BM-MSC不添加至内皮细胞，而是用效应细胞预先温育并且之后将其去除。在该情况下，相比没有用BM-MSC预先温育的效应细胞，当效应细胞用BM-MSC预先温育时，没有观察到内皮靶细胞的特异性裂解的下降。所以可得出结论，BM-MSC的免疫调节活性涉及BM-MSC与内皮靶细胞的特异性相互作用。
[0087]实施例4:同种异体CD8+CTL引起的内皮靶细朐裂解是I铟MHC限制件的并目不依赖于天然杀伤细胞或淋巴因子激活杀伤细胞活性
[0088]作为进一步的对照，通过限于同种异体抗原的I型MHC提呈，研究了同种异体⑶8+细胞毒性T淋巴细胞效应细胞的裂解活性是否是抗原特异性的。为了该目的，内皮靶细胞经受如实施例2中的CD8+效应细胞，但是是在存在中和I型MHC抗体的情况下(W6/32)。另夕卜，显示效应细胞不具备相当于天然杀伤细胞或非特异性淋巴因子激活杀伤细胞的活性。通过进行如实施例2的实验完成该对照，但是其中，对于天然杀伤细胞(K562)而言，内皮靶细胞替换成对照靶细胞系。
[0089]这些对照实验的结果总结在图3中。列表示每个具有四个个体BM-MSC供体的四个独立实验中20的效应细胞/靶比例的靶细胞的特异性裂解的算数平均数和标准偏差。结果显示中和抗I型MHC抗体的存在明显降低靶细胞的特异性裂解(*，**:p<0.001)，确认效应细胞的裂解活性是同种异体抗原特异性的。此外，对照靶K562的裂解显著降低(***:p〈0.002)，表明细胞毒性T淋巴细胞效应细胞不具备对应天然杀伤细胞或非特异性淋巴因子激活杀伤细胞的活性。
[0090]实施例5:保护内皮靶细胞避免因CD8+CTL效应细胞引起的裂解对于CD34阴性祖细胞而言是特异性的
[0091]⑶34阴性祖细胞比如源自骨髓的⑶34阴性间充质干细胞/基质细胞是比较大的细胞。所以，评估BM-MSC对内皮靶细胞的保护是否是基于来自通过BM-MSC接近内皮细胞的CD8+T淋巴细胞效应细胞的空间抑制而不是基于BM-MSC的免疫调节能力。该实验设计与实施例2类似，但是其中来自人心脏组织的成纤维细胞样细胞而不是BM-MSC被添加至内皮靶细胞。成纤维细胞样细胞的尺寸与BM-MSC匹配。
[0092]结果显示在图4中。列表示每个具有三个不同BM-MSC供体的三个独立实验的内皮靶细胞的特异性裂解的算数平均数和标准偏差，以百分数计归一化至没有保护的内皮细胞的裂解。从添加尺寸匹配的对照细胞没有观察到对内皮靶细胞的保护作用(**:没有显著性)，表明内皮靶细胞通过BM-MSC的保护是免疫相关的而不是由于空间抑制。
[0093]实施例6:CD34阴性干细胞是免疫性低下的(immunologically naive)
[0094]CD34阴性祖细胞本身不是免疫原性的，这是重要的。由于该原因，研究了骨髓CD34阴性间充质干细胞/基质细胞的免疫原性。如前述实施例2那样进行实验，但是其中不是内皮细胞而是骨髓间充质干细胞/基质细胞在没有内皮细胞的情况下用作靶细胞。当BM-MSC作为靶提呈时，没有观察到同种异体CD8+细胞毒性T淋巴细胞效应细胞的裂解活性。该发现尤其与CD34阴性祖细胞和间充质干细胞/基质细胞的免疫性低下一致。
[0095]实施例7:来自不同来源的CD34-祖细胞的内皮保护能力
[0096]比较源自不同组织来源的⑶34阴性祖细胞保护内皮靶细胞避免⑶8+CTL介导的裂解的效力。如实施例2那样进行实验，其中CD34-祖细胞(21)是源自骨髓的MSC (BM-MSC，9个单独的样品)，或源自脐带的MSC (UC-MSC，4个单独的样品)，或源自羊膜的MSC(AMC-MSC，3个单独的样品)。这些实验的结果总结在图5中。每个列对显示取决于MSC来源的以百分数计没有MSC保护(实心列)和有MSC保护(阴影列)的具体内皮靶细胞裂解的算数平均数和标准偏差。所有测试的MSC能够保护内皮靶细胞避免CD8+CTL介导的裂解。用BM-MSC观察到最有力的保护，其中相比没有MSC保护的内皮细胞裂解平均下降72.3%。AMC-MSC平均降低内皮细胞裂解约53.2%，UC-MSC仍平均降低内皮细胞裂解约39.5%。该实施例也突出了本方法的如下重要性:测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力，以便评估来自不同来源的细胞的保护效力，和积极预测CD34阴性祖细胞体内的作用。
【主权项】
1.一种用于保护处在血管炎性疾病风险或患有血管炎性疾病的受试者的血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的用途的人CD34阴性祖细胞。2.根据权利要求1所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞造成的血管内皮细胞层特异性细胞裂解。3.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞包括CD27阴性和CD28阴性的内皮细胞层特异性细胞毒性T淋巴细胞。4.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中血管炎性疾病包括针对相对于受试者是同种异体的实体器官移植的血管内皮细胞层的同种异体反应。5.根据权利要求1?3中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括同种异体造血干细胞移植之后移植相关的并发症。6.根据前述权利要求所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述移植相关的并发症包括移植物抗宿主病(GvHD)。7.根据权利要求5所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述移植相关的并发症包括微血管疾病。8.根据权利要求1?3中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括由于自体免疫应答引起的急性、炎症或过敏性血管炎。9.根据前述权利要求所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述急性、炎症或过敏性血管炎包括过敏性肉芽肿病、巨细胞动脉炎、韦格纳肉芽肿病、大动脉炎、川崎疾病、血栓闭塞性脉管炎(Buerger疾病)、结节性多动脉炎、Churg-Strauss-综合症、显微镜下多血管炎、冷球蛋白性脉管炎、荨麻疹性血管炎、眼-口 -生殖器三联综合征、肺出血肾炎综合征、感染后血管炎或药物诱导的血管炎。10.根据权利要求1?3中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括血管内皮细胞层的慢性炎症。11.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述⑶34阴性祖细胞包括⑶34阴性间充质干细胞/基质细胞。12.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD34阴性祖细胞选自下述组，所述组包括骨髓、脐带、胎盘和脂肪组织CD34阴性祖细胞，或它们的组合。13.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述⑶34阴性祖细胞的特征在于表达⑶105、⑶73和⑶90，并且不表达⑶45、⑶34、⑶14或CDllb、CD79a 或 CD19。14.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD34阴性祖细胞是骨髓CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。15.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述⑶34阴性祖细胞结合至少一种另外的药理学活性组分使用。16.根据前述权利要求所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述至少一种另外的药理学活性组分具有选自下述组的药理学活性，所述组包括抗炎症活性、抗缺血性活性、抗血栓形成活性、和它们的组合。17.一种用于前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞的制造方法，所述方法包括下述步骤: a)分离CD34阴性祖细胞； b)在细胞生长培养基中扩增所述CD34阴性祖细胞至少12天； c)收获所述CD34阴性祖细胞。18.根据前述权利要求所述的方法，其中在方法步骤a)中，所述CD34阴性祖细胞分离自下述组的组织，所述组包括骨髓、脐带、羊膜和脂肪组织，或它们的组合。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中方法步骤b)的所述细胞生长培养基包括包含下述物质的培养基: -人血小板裂解物，不含直径大于0.22 μ m的固体物质，其中裂解物占所述细胞生长培养基总体积的2%至15%， -人新鲜冷冻的血浆(FFP)滤液，不含直径大于0.22 μ m的固体物质，其中FFP滤液占所述细胞生长培养基总体积的1%至10%， -肝素，在所述细胞生长培养基中的浓度为OU/ml至10U/ml， -L-谷氨酰胺，浓度为0.5mM至10mM，和 -适于哺乳细胞生长的无血清、低葡萄糖培养基，其中无血清、低葡萄糖培养基占所述细胞生长培养基总体积的75%至97%。20.一种测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力的方法，其通过制备包含内皮靶细胞、细胞毒性CD8+T淋巴细胞和CD34阴性祖细胞的样品和包含内皮靶细胞和细胞毒性CD8+T淋巴细胞而没有CD34阴性祖细胞的参考样品，并比较所述样品和所述参考样品中的内皮靶细胞的裂解来进行测定。21.根据权利要求20所述的方法，其中在用内皮靶细胞和所述CD8+T淋巴细胞制备样品和参考样品之前，所述CD8+T淋巴细胞与同种异体内皮细胞在存在白介素-2的情况下共培养。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中至少一种另外的药理学活性组分被添加至所述样品和/或所述参考样品。
【专利摘要】本发明提供了CD34阴性祖细胞，用于保护处在血管炎症疾病风险或患有血管炎症疾病的受试者的血管内皮细胞避免免疫介导的细胞毒性反应。也提供了人CD34阴性祖细胞的制造方法，和测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞避免免疫介导的细胞毒性反应的能力的方法。
【IPC分类】A61K35/00, A61K45/00, C12N5/071, C12N5/0775, A61K35/28, A61K38/17, G01N33/00
【公开号】CN105025927
【申请号】CN201480011828
【发明人】京特·艾斯纳, 克里斯蒂娜·京特, 拉尔夫·哈斯
【申请人】埃普塞斯有限责任两合公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年2月28日
【公告号】CA2901653A1, WO2014131877A1