，但显著低于治疗前的模型组，因此，绿原酸可以降低血清肌 酸磷酸激酶（CPK)。
[0040](3)HE染色 对各组小鼠的腓肠肌常规脱水后，透明，石蜡包埋，切片，展片，然后分别HE染色。
[0041] 由图1中A图所示，治疗前正常对照组的小鼠肌纤维细胞呈多角形，形态大小均匀 一致，胞浆匀染；肌间隙正常，无炎性细胞浸润。由图1中C图所示，治疗前模型组的mdx小 鼠的肌纤维细胞大小形态不均，失去正常的形状；肌间隙变宽，局部可见炎性细胞浸润与变 性坏死。由图1中E图所示，绿原酸治疗组的肌纤维细胞不如治疗后正常对照组（由图1中 B图所示）均匀一致，仍有少许炎性细胞浸润，但较治疗前模型组有部分改善，因此，说明绿 原酸可以防止肌纤维坏死，并促进肌纤维再生。
[0042] (4)电镜 1.固定：小鼠腓肠肌取材后，先用2. 5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时 间，用0.lmol/L的磷酸漂洗液漂洗，重复3次，每次时间15分钟；然后用1%锇酸固定液固 定2-3小时，再用0.lmol/L的磷酸漂洗液漂洗，重复3次，每次时间15分钟。
[0043] 2.脱水：先放入50%乙醇中，时间为15-20分钟，然后放入70%乙醇中，时间为 15-20分钟，再放入90%乙醇中，时间为15-20分钟，之后放入90%乙醇和90%丙酮配制的混 合液中（体积比为1 :1)，时间为15-20分钟，然后在90%丙酮中呆15-20分钟，以上操作均 是在4°C冰箱内进行。之后在室温条件下，放入100%丙酮中，重复3次，每次15-20分钟。
[0044] 3.包埋：先在室温条件下放入纯丙酮+包埋液(透射电镜常规用Epon812树脂） (体积比为2 :1)中3-4小时，于室温条件放入纯丙酮+包埋液（1 :2)下过夜，再在37°C条件 下放入纯包埋液中2-3小时。
[0045] 4.固化：先在37°C的烘箱内过夜，然后置于45°C的烘箱内12小时，之后在放于 60°C的烘箱内24小时。
[0046] 5?超薄切片机切片，切片厚度为50_60nm。
[0047] 6. 3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。
[0048] 7.透射电镜观察拍片。
[0049] 由图2中A图所示，电镜观察发现正常对照组的小鼠肌丝排列较整齐，方向一致， Z盘清晰可见；由图2中B图所示，治疗前的模型组可见线粒体肿大、肌浆网扩张、细胞核异 染质，肌丝灶性融解是最典型表现；由图2中C图所示，绿原酸治疗后肌丝灶性融解较治疗 前的模型组有部分改善。因此，说明绿原酸可以改善mdx小鼠腓肠肌的病理形态，从而证实 绿原酸可以治疗mdx小鼠。
[0050] (5)蛋白质印迹法（Westernblot): 1. 裂解：称取lOOmg组织剪碎，加入已配入相应蛋白酶抑制剂的裂解液500y1于冰上 研磨，研磨约15分钟，离心lOmin，转速设定为12000rpm，之后吸取上清液，分别进行蛋白浓 度的测定； 2. 配平：根据蛋白质浓度决定加入裂解液样品全部配平，使蛋白浓度一致，在95°C左 右水浴5分钟，再放入冰几分钟，待完全冷却样品后最大转速短暂的离心，然后备上样。
[0051] 3.验漏：首先进行水渗漏试验，等待至少10-20分钟，在确定胶不漏的情况下开始 配胶。
[0052] 4.配胶：根据所需测定的蛋白质分子量来定下层胶的浓度；上层胶不分浓度，在 下层胶配好后，立即予以ddH20液封；上层胶配好后根据所要测定的上样量和样品个数来选 择插入10孔或者15孔梳。
[0053] 5 ?拔梳子 6. 上样 7. 跑胶：开始时将电压设定为80伏；条带跑出上层胶后的电压可以调到100-110V。
[0054] 8.转膜：在转膜液浸入里海绵和滤纸以及NC膜，然后将胶放入TB里；将电压调至 100V，时间设定为40-60min。
[0055] 9.封闭：先将牛奶配好，然后在转膜结束后将NC膜放置其中，于摇床上至少摇30 分钟。
[0056] 10.加一抗：将按稀释比稀释后的相应的抗体加入牛奶中，用封膜带封好，然后放 入4 °C冰箱过夜。
[0057] 11.洗膜：配TBST，然后用其清洗膜3遍，每次时间为lOmin。
[0058] 12.加二抗：二抗的稀释比一般为1:3000,也就是说3ml牛奶里加0. 1ml抗体；加 入2抗后，封好口放，然后在室温条件下放置30-40min。
[0059] 13.显色：在暗室中将试剂A及试剂B按体积比1:1混合来配制ECL化学发光检 测试剂，将PVDF膜置于抗体孵育盒中，并加入配制好的ECL化学发光试剂，浸润5秒钟后取 出，用滤纸吸干多余试剂；将PVDF膜放入仪器中曝光。
[0060] 14.应用图像分析软件来计算每个条带的光密度值。
[0061] 其测定结果如下表3所示。
[0062] 表3不同时期各组小鼠腓肠肌NF-kB蛋白表达变化（0D比值，^ ±S)
注：与同时点mdx模型组相比，P〈0. 05 ;与同组治疗前相比（P〈0. 05) 由表3可知，小鼠腓肠肌中NF-kB蛋白表达情况：绿原酸治疗组的条带灰度较模型 组及治疗前低，说明绿原酸治疗后mdx小鼠腓肠肌中NF-kB蛋白表达水平较模型组及治疗 前低。因此，说明绿原酸可以降低NF-kB的活性，减少肌肉病变。
[0063] 本实施例中采用SPSS17. 0软件统计处理实验数据。所有计量资料均采用均数土 标准差表示。westernblot图像采取imagej进行分析，各时间点与对照组比较以目的条带 与内参的灰度值比（0D值比)作为统计量，采用两两比较T检验，以p< 0. 05为差异有统计 学意义。
[0064] 综合上述数据可见，绿原酸对DMD疾病具有治疗效果。同时，由于Duchenne肌 营养不良（DMD)、Becker肌营养不良（BMD)、肢带型肌营养不良等均属肌营养不良疾病，其 机理均与DMD类似，从而适用与DMD疾病治疗的药物和方法，略加适应性变化，同样适用于 Becker肌营养不良（BMD)、肢带型肌营养不良疾病的治疗，因此绿原酸可应用于制备治疗 肌营养不良的药物中。
[0065] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 绿原酸在制备治疗肌营养不良疾病的药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物以有效剂量的绿原酸为活性成 分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药剂中每制剂单位含有绿原酸1~ 1000 mg04. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药剂中每制剂单位含有绿原酸 30 ~250mg。5. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药剂中每制剂单位含有绿原酸 100~200mg。6. 根据权利要求2-5任一项所述的用途，其特征在于，所述绿原酸的纯度大于或者等 于 98%。7. 根据权利要求2-5任一项所述的用途，其特征在于，所述药剂为口服制剂或者注射 剂。8. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌营养不良疾病为先天性肌营养不 良症、Duchenne肌营养不良症、Becker肌营养不良症和肢带型肌营养不良症中的至少一 种。
【专利摘要】本发明提供了绿原酸在制备治疗肌营养不良疾病的药物中的用途，属于生物医药领域领域。本发明通过药效实验证明绿原酸具有防止肌纤维坏死，促进肌纤维再生，使肌力增强，血清肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）等生化指标下降，病症明显改善的效果；同时，绿原酸能够抑制骨骼肌的肌膜破裂和坏死，具有抗炎/免疫反应，抗氧化作用，延缓肌纤维的凋亡、变性及坏死，增强骨骼肌运动等能力，因此，绿原酸可以应用于制备治疗肌营养不良疾病的药物中。
【IPC分类】A61K31/216, A61P21/00
【公开号】CN105055392
【申请号】CN201510580291
【发明人】张洁, 朱丽娜
【申请人】四川九章生物科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月14日