一种中大型植物外植体的灭菌方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养领域，具体设及一种中大型植物外植体的灭菌方法。
【背景技术】
[0002] 外植体的有效灭菌是所有植物组织培养的重要一步。植物组织培养是指从植物体 上截取需要的细胞、组织或器官，通过无菌操作，在人为调控下进行培养，广泛应用于溯危、 稀有植物的长期保存、经济植物的快速繁殖、远源杂交崎形胚或未成熟胚胎的挽救、培养， 新型种质资源的创造值H、基因工程、细胞融合）、脱毒复壮等领域。
[0003] 与医疗器械、食品加工等行业的消毒不同，保持外植体在消毒后依然具有较高的 生命力是植物组织培养必须要坚守的原则。物理消毒法，如福射消毒、高溫、高压、蒸汽灭菌 等都会导致外植体死亡。因此组织培养领域对外植体的消毒方法均是采用化学法。从植物 组织培养消毒技术诞生至今，相关的科研人员都在探索使用何种化学试剂才能到达有效灭 菌的目的。
[0004] 常用的化学试剂有乙醇、次氯酸钢、氯化隶（升隶）、过氧化氨、次氯酸巧和硝酸 银。氯化隶较难在随后的洗涂过程中去除，且对外植体有毒副作用。过氧化氨是强氧化剂， 滴落到皮肤后会有灼伤感。氯化隶和过氧化氨作用较强，如果浓度稍大或时间略长，外植体 很容易死亡。次氯酸巧容易吸收空气中的水分，影响灭菌效果。硝酸银也是强氧化剂，但 灭菌能力不如氯化隶和过氧化氨，价格又比乙醇和次氯酸钢贵，所W较少采用。综合灭菌效 果、安全系数和价格因素，乙醇和次氯酸钢是目前最为广泛使用的化学试剂。 阳〇化]乙醇和次氯酸钢组合使用可W满足一般常见外植体的消毒要求。目前植物外植体 的通用消毒方法是：体积百分比浓度为75%的乙醇表面处理20秒-90秒后，再用体积百分 比浓度为2-15%次氯酸钢水溶液消毒8-20分钟，再用无菌蒸馈水漂洗2-4次，每次1-2分 钟。采用该消毒方法，需要对大量蒸馈水进行高压灭菌W制备得到无菌蒸馈水。如果不能 达到灭菌效果，再使用其它的化学试剂。
[0006] 有些中大型外植体，如百合果实、茄果类幼果、葫芦科幼果、馨葫科块茎等等体积 较大，一般长度或者长径超过4cm，采用目前业界通用的消毒技术，有W下几个缺点：1、受 灭菌器材的限制，每次只能对几个外植体进行消毒，灭菌效率低下；2、内部具较大空腔的 外植体，如百合果实，内部空腔体积大，比重轻，密度小，在整个消毒过程中均漂浮在液体表 面，容易导致表面消毒不完全，从而造成污染；3、馨葫科块茎在±中生长，携带多种、大量菌 类，不易彻底消毒，采用传统灭菌方法的灭菌效率低下。
[0007] 因此，植物组织培养领域需要研发出一种针对于中大型植物外植体的、快速高效 的、成本低廉的、操作简单的灭菌方法。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种中大型植物外植体的灭菌方法，该方法将外植体先用乙醇溶液浸 泡，再在火焰中灼烧并冷却。
[0009] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0010] 一种中大型植物外植体的灭菌方法，包括W下步骤：
[0011] 浸泡步骤：将外植体在乙醇溶液中进行浸泡处理，得到浸泡后的外植体；
[0012] 灼烧步骤：将所述浸泡后的外植体进行灼烧处理，得到灭菌后的外植体。
[0013] 上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述外植体的长度或长径大于等于4cm，小于 等于15cm。
[0014] 上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述外植体为百合果实、番茄幼果、茄子幼 果、西瓜幼果、馨葫块茎。
[0015] 上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述浸泡步骤中，所述浸泡处理的时间为1-5 秒，优选为1-3秒。
[0016] 上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述浸泡步骤中，所述乙醇溶液的体积百分 浓度为90 % -99 %，优选为95 % -99 %。
[0017] 上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述灼烧步骤中，所述灼烧处理的时间为 1-30秒，优选为2-20秒。
[0018] 上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述浸泡步骤和灼烧步骤均在超净工作台中 进行。
[0019] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0020] 1、本发明无需采用次氯酸钢溶液、升隶溶液等对外植体进行消毒，也无需对大量 蒸馈水进行高压灭菌，所W操作简单、节省试剂、对环境友好。
[0021] 2、本发明采用的灼烧处理属于物理消毒法，是现有技术中被认为的完全不可能应 用于植物组织培养领域的消毒方法，所W本发明的灭菌方法打破了上述技术偏见，是对植 物组织培养领域传统消毒观念的彻底转变。
[0022] 3、本发明适用于用传统的灭菌方法效果不佳的中大型外植体，包括：百合果实、茄 果类幼果、葫芦科幼果、馨葫科块茎等，使用范围广泛。
[0023] 4、本发明操作简便，成本低廉，快速高效，容易推广，应用价值高。
【具体实施方式】
[0024] 一种中大型植物外植体的灭菌方法，包括W下步骤：
[00巧]步骤一、浸泡：在超净工作台内，将清洗去除表面浮尘的外植体在体积百分浓度为 90 % -99 %，优选为95 % -99 %乙醇溶液中进行浸泡处理1-5秒，优选为1-3秒，得到浸泡后 的外植体。
[0026] 示例性地，上述乙醇溶液的浓度可W为90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96 %、 97%、98%、99%中的任意值或任意两者之间的范围；上述浸泡的时间可W为1秒、2秒、3 秒、4秒、5秒中的任意值或任意两者之间的范围。
[0027] 上述中大型外植体，包括：百合果实、茄果类幼果、葫芦科幼果、馨葫科块茎等等， 体积较大，一般长度或者长径超过4cm，采用目前业界通用的化学灭菌方法对运些外植体灭 菌，耗时长、效率低，很难令人满意。
[0028] 步骤二、灼烧：在超净工作台内，将浸泡后的外植体过火进行灼烧处理累计为 1-30秒，优选为2-20秒，待火焰彻底焰灭，外植体冷却后，得到灭菌后的外植体；再对该灭 菌后的外植体进行后续的操作。
[0029] 示例性地，上述灼烧累计的时间可W为1秒、2秒、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、 30秒中的任意值或任意两者之间的范围。
[0030] 该灭菌方法的操作中无需采用次氯酸钢溶液、升隶溶液等对外植体进行消毒，也 无需对大量蒸馈水进行高压灭菌，所W操作简单、节省试剂、对环境友好；该灭菌方法采用 的灼烧处理属于物理消毒法，在现有技术中被认为是一种完全不可能应用于植物组织培养 领域的消毒方法，该灭菌方法打破了上述技术偏见，是对植物组织培养领域传统消毒观念 的彻底转变，彻底突破了之前植物组织消毒技术理论和经验的束缚；该灭菌方法的操作适 用于用传统的灭菌方法效果不佳W及效率低下的中大型外植体，包括：百合果实、茄果类幼 果、葫芦科幼果、馨葫科块茎等，使用范围广泛；该灭菌方法的操作简便，成本低廉，快速高 效，容易推广，应用价值高。
[0031] W下通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但运些例举性实施方式并非旨在 对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定。 阳0巧 实施例1
[0033] 本实施例的外植体为授粉后45-60天的百合果实，长径为6-9厘米；其内部具有较 大空腔，比重轻，密度小，如采用传统的灭菌方法进行灭菌，则在整个消毒过程中均漂浮在 液体表面，容易导致表面消毒不完全，从而造成污染。
[0034] 本实施例的灭菌方法包括W下步骤：
[0035] (1)清洗：摘取授粉后45-60天的百合果实，用清水洗去其表面浮尘，吸水纸吸净 水份。
[0036] (2)浸泡：在无菌操作台内，用綴子夹住果实在体积百分浓度为95%的乙醇溶液 (可多次重复使用）中来回测动=五下，约1-3秒，得到浸泡后的果实。
[0037] (3)灼烧和冷却：将浸泡后的果实过火灼烧2-3秒；再将其放入无菌蒸馈水中灭 火、冷却，得到灭菌后的果实。
[0038] (4)再将果实在无菌吸水纸上来回滚动2、3下即可进行随后的植物组织培养等操 作。
[0039] 传统化学灭菌方法与本实施例的灭菌方法效果的比较：
[0040] (1)对照组：采用化学灭菌法，具体步骤为：先将清洗后的外植体于体积百分浓度 为75%乙醇溶液中浸泡振荡30-50秒，再于体积百分浓度为2. 5%的次氯酸钢溶液中浸泡 振荡14-15分钟，再用无菌蒸馈水清洗3-4次，每次1-2分钟，再于无菌吸水纸上吸干外植 体表面的水分。
[0041] 实验组：采用本实施例的灭菌方法。
[0042] W上两组中，每组实验均做3次，每次10个外植体，消毒一周、二周、四周后分别统 计外植体的灭菌效果和生长状况。
[0043] (2)采用对照组的化学灭菌法存在W下缺陷：果实上部大约4-6平方厘米的区域 漂浮在次氯酸钢溶液上方，在大约15分钟的时间里，需要人工不停地翻滚果实，保证果实 表面全部得到消毒。另外，由于果实的长径较长，通常400ml烧杯一次最多处理2-4个果实， 即平均25分钟只能消毒3个果实。而采用实验组的方法，1分钟就可W消毒2个果实。灭 菌效率提高了大约17倍，运是该方法的优点。用该方法消毒，四周后无菌率保持100%，且 内部种子依然具有萌发力；极其快速高效，不用次氯酸钢，节省了大量试剂和时间。
[0044] 下表为W上两组的平均试剂用量、时间的比较；可见实验组的乙醇溶液、次氯酸钢 溶液、无菌蒸馈水的用量均远小于对照组，实验组的时间也远少于对照组。
[0045]
[0046] 注：1、乙醇可W反复使用；2、400ml烧杯中一次可放入2个百合果实。
[0047] 对照组和实验组培养2周后统计幼胚萌发情况，对照组的平均幼胚萌发率为 87 %，实验组的平均幼胚萌发率为83 %，没有显著差异。 引实施例2
[0049] 本实施例的外植体为授粉后15-25天的番茄幼果。按照果实大小，通常把番茄分 为小果、中果和大果=个类型。本实施例的方法在处理中果，特别是大果类型时，有突出的 优势。一般中果的长径为4-6厘米，大果的长径为5-7为厘米。
[0050] 本实施例的灭菌方法包括W下步骤：
[0051] (1)清洗：摘取授粉后15-25天的番茄幼果，用清水洗去其表面浮尘，吸水纸吸净 水份。
[0052] (2)浸泡：在无菌操作台内，将幼果浸入装有200ml的体积百分浓度为95%的乙醇 溶液（可多次重复使用）的500ml的烧杯中，翻滚1-3秒，确保幼果表面沾满乙醇溶液，得