到浸泡后的幼果。
[0053] (3)灼烧和冷却：用綴子夹住浸泡后的幼果，过火灼烧直到火焰彻底消失，时间为 10-20S，得到灭菌后的幼果。
[0054] 本步骤中可W灼烧浸泡后的幼果1-3次；番茄幼果灼烧1次就可W达到灭菌效果； 如果灼烧3次，幼果外表皮脱落，但还未伤及幼胚。 阳化5] 传统化学灭菌方法与本实施例的灭菌方法效果的比较：
[0056] (1)本实施例的分组和化学灭菌法的操作参见实施例1。
[0057] (2)采用对照组的化学灭菌法存在W下缺陷：幼果顶部大约1-4平方厘米的区域 漂浮在次氯酸钢溶液上方，在大约15分钟的时间里，需要人工不停地翻滚幼果，保证幼果 表面全部得到消毒。另外，由于幼果体积较大，通常500ml烧杯一次最多处理1-2个中果或 者1个大果。对大果而言，平均25分钟只能消毒1个果。而采用本实施例的灭菌方法，最 多1分钟就可W消毒1个幼果。灭菌效率提高了大约24倍，运是该方法的优点。
[0058] 下表为W上两组的平均试剂用量、时间的比较；可见实验组的乙醇溶液、次氯酸钢 溶液、无菌蒸馈水的用量均远小于对照组，实验组的时间也远少于对照组。
[0059]
W60] 注：1、乙醇可W反复使用；2、500ml烧杯中一次可放入1-2个番茄幼果。
[0061] 将实验组的灭菌后的幼果无菌解剖后，取出幼胚放置于培养基后，幼胚可正常萌 发。用此方法消毒，四周后无菌率保持100%，且内部种子依然具有萌发力；极其快速高效， 不用次氯酸钢，节省了大量试剂和时间。
[0062] 对照组和实验组培养2周后统计平均幼胚萌发情况。幼胚萌发率由材料性质决 定，详见下表：
[0063]
[0064] 注：回交二代果实没有采用对照组的消毒方法，而是全部采用了实验组的方法进 行消毒，幼胚萌发率为41. 77%。 W65] 实施例3
[0066] 本实施例的外植体为授粉后20-35天的茄子幼果，长径为8-lOcm。
[0067] 本实施例的灭菌方法包括W下步骤：
[0068] (1)清洗：摘取授粉后20-35天的茄子幼果，用清水洗去其表面浮尘，吸水纸吸净 水份。
[0069] (2)浸泡：在无菌操作台内，将幼果放入装有体积百分浓度为95-99%的乙醇溶液 (可多次重复使用）的大烧杯或铁饭盒中浸泡中1-3秒，确保幼果表面沾满乙醇溶液，得到 浸泡后的幼果。
[0070] (3)灼烧和冷却：用綴子或夹子夹住浸泡后的幼果，过火灼烧直到火焰彻底消失， 共灼烧2次，总计时间为20-30S，得到灭菌后的幼果。
[0071] 传统化学灭菌方法与本实施例的灭菌方法效果的比较：
[0072] (1)本实施例的分组和化学灭菌法的操作参见实施例1。其中，化学灭菌法操作 中，需要先把茄子幼果切成小块。
[0073] 采用对照组的灭菌方法存在W下缺陷：茄子幼果的长径较长，整体近似圆形， 500ml烧杯都难W放入。传统化学灭菌方法需要先把幼果切成小块再灭菌，平均25分钟只 能消毒1个果。而本实施例的灭菌方法，最多1分钟就可W消毒1个幼果；灭菌效率提高25 倍，运是该方法的优点。
[0074] 似下表为W上两组的平均试剂用量、时间的比较巧见实验组的乙醇溶液、次氯 酸钢溶液、无菌蒸馈水的用量均远小于对照组，实验组的时间也远少于对照组。 阳0巧]
[0076] 注：1、乙醇可W反复使用；2、对照组中，1个幼果切成小块后至少需要放在1个 500ml的烧杯中，一般将切好的小块平分在2个500ml烧杯中。
[0077] 将灭菌后的幼果无菌解剖后，取出幼胚放置于培养基后，幼胚可正常萌发。用此方 法消毒，四周后无菌率保持100%，且内部种子依然具有萌发力；极其快速高效，不用次氯 酸钢，无需准备大量的无菌蒸馈水，节省了大量试剂和时间。
[0078] 对照组和实验组培养2周后统计幼胚萌发情况，对照组的平均幼胚萌发率约为 90%，实验组的平均幼胚萌发率也大约为90%，4周后两组的平均成苗率也没有显著差异。
[0079] 实施例4
[0080] 本实施例的外植体为授粉后15-25天的西瓜幼果，长径为3-15畑1。
[0081] 本实施例的灭菌方法包括W下步骤：
[0082] (1)清洗：摘取授粉后15-25天的西瓜幼果，用清水洗去其表面浮尘，吸水纸吸净 水份。
[0083] (2)浸泡：在无菌操作台内，将幼果放入装有体积百分浓度为95-99%的乙醇溶液 (可多次重复使用）的大烧杯或铁饭盒中滚动浸泡1-3秒，确保幼果表面沾满乙醇溶液，得 到浸泡后的幼果。
[0084] (3)灼烧和冷却：用木头夹子（长约25厘米）夹住浸泡后的幼果，过火灼烧直到 火焰彻底消失，共灼烧3次，总计时间约为30s，保证西瓜和台面均彻底杀菌，得到灭菌后的 幼果。
[00化]传统化学灭菌方法与本实施例的灭菌方法效果的比较：
[0086] (1)本实施例的分组和化学灭菌法的操作参见实施例1。其中，对照组的化学灭菌 方法中，需要先将西瓜幼果去皮后切成边长大约2cm左右的立方体。采用对照组的灭菌方 法存在W下缺陷：西瓜幼果的长径较长，整体近似圆形，需要先把幼果切成小块再灭菌，平 均25分钟只能消毒1个果。而本实施例的灭菌方法，大约1分钟就可W消毒1个幼果；灭 菌效率提高25倍，运是该方法的优点。
[0087] 似下表为W上两组平均的试剂用量、时间的比较巧见实验组的乙醇溶液、次氯 酸钢溶液、无菌蒸馈水的用量均远小于对照组，实验组的时间也远少于对照组。
[0088]
[0089] 注：1、乙醇可W反复使用；2、500ml烧杯中一次最多只能放入1个西瓜幼果的切 块。
[0090] 将灭菌后的幼果无菌解剖后，然后用高压灭菌后的水果刀将瓜切开，用綴子将里 面的未成熟种子（即西瓜幼胚）一粒粒取出放在培养基上，幼胚可正常萌发。用此方法 消毒，四周后无菌率保持100%，且内部种子依然具有萌发力；本实施例的方法极其快速高 效，不用次氯酸钢和蒸馈水，节省了大量试剂和时间。
[0091] 对照组和实验组培养2周后统计幼胚萌发情况，正常授粉材料，对照组平均幼胚 萌发率约为80-90 %，实验组平均幼胚萌发率大约为80-90 %，两组的平均成苗率没有显著 差异。 阳OW] 实施例5
[0093] 本实施例的外植体为馨葫成熟块茎；该块茎的长径为9-12(3111，在±壤内部生长， 表面粗糖，凹凸不平，携带有多种、大量菌类，采用传统灭菌方式很难彻底杀灭表面的所有 菌类。
[0094] 本实施例的灭菌方法包括W下步骤：
[00河 （1)清洗：选取馨葫成熟块茎，在自来水下用刷子冲刷干净，洗刷掉表面所有的泥 ±，再用吸水纸吸净水份。
[0096] (2)浸泡：在无菌操作台内，将块茎放入装有体积百分浓度为95 % -99 %的乙醇溶 液（可多次重复使用）的大烧杯或铁饭盒中浸泡中1-3秒，确保块茎表面沾满乙醇溶液，得 到浸泡后的块茎。
[0097] (3)灼烧和冷却：用綴子夹住浸泡后的块茎，过火灼烧2-3秒，立即放入无菌蒸馈 水中灭火、冷却，共灼烧和冷却2次，总计时间为20-30S，得到灭菌后的块茎。
[0098] 传统化学灭菌方法与本实施例的灭菌方法效果的比较：
[0099] (1)本实施例的分组和化学灭菌法的操作参见实施例1 ;其中，传统化学灭菌法 中，需要先将馨葫块茎切成小块。
[0100] (2)下表为W上两组平均的试剂用量、时间的比较；可见实验组的乙醇溶液、次氯 酸钢溶液、无菌蒸馈水的用量均远小于对照组，实验组的时间也远少于对照组。
[0101]
阳102] 注：1、乙醇可W反复使用；2、500ml烧杯中一般一次只放入1个块茎的切块。
[0103] 将灭菌后的块茎无菌解剖后，取出芽点及其周围连带的组织放置于培养基后，从 芽点可长出正常的幼苗。用此方法消毒，四周后无菌率保持在约为70%，且芽点活性正常； 本实施例的方法极其快速高效，不用次氯酸钢，无需准备大量的无菌蒸馈水，节省了大量试 剂和时间。
[0104] 对照组和实验组培养1、2、4周后统计平均的无菌率（无菌率=(无菌茎块数/总 茎块数）X100 %)如下表： 阳1化]
d实验组培养4周后的污染不是霉菌污染，而是火烧处理过当对组织造成了伤害所 致。而对照组的污染一般均为霉菌污染。
【主权项】
1. 一种中大型植物外植体的灭菌方法，其特征在于：所述灭菌方法包括以下步骤： 浸泡步骤：将外植体在乙醇溶液中进行浸泡处理，得到浸泡后的外植体； 灼烧步骤：将所述浸泡后的外植体进行灼烧处理，得到灭菌后的外植体。2. 根据权利要求1所述中大型植物外植体的灭菌方法，其特征在于： 所述外植体的长度或长径大于等于4cm，小于等于15cm。3. 根据权利要求1或2所述中大型植物外植体的灭菌方法，其特征在于： 所述外植体为百合果实、番茄幼果、茄子幼果、西瓜幼果、薯蓣块茎。4. 根据权利要求3所述中大型植物外植体的灭菌方法，其特征在于： 所述浸泡步骤中，所述浸泡处理的时间为1-5秒，优选为1-3秒。5. 根据权利要求3所述中大型植物外植体的灭菌方法，其特征在于： 所述浸泡步骤中，所述乙醇溶液的体积百分浓度为90% -99%，优选为95% -99%。6. 根据权利要求3所述中大型植物外植体的灭菌方法，其特征在于： 所述灼烧步骤中，所述灼烧处理的时间为1-30秒，优选为2-20秒。7. 根据权利要求3所述中大型植物外植体的灭菌方法，其特征在于：所述浸泡步骤和 灼烧步骤均在超净工作台中进行。
【专利摘要】本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种中大型植物外植体的灭菌方法。所述灭菌方法包括：浸泡步骤：将外植体在乙醇溶液中进行浸泡处理，得到浸泡后的外植体；灼烧步骤：将所述浸泡后的外植体进行灼烧处理，得到灭菌后的外植体。本发明无需采用次氯酸钠溶液、升汞溶液等对外植体进行消毒，无需对大量蒸馏水进行高压灭菌，所以操作简单、节省试剂、成本低廉、对环境友好，使用范围广泛，应用价值高。
【IPC分类】A61L2/18, A61L101/34, A61L2/04
【公开号】CN105148299
【申请号】CN201510512329
【发明人】赵泓, 王贤, 王永勤
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月19日