用在提升抗癌药物输送及医疗效果的癌症标靶肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明大体上是涉及有关癌症标靶肽，且更特定地是有关具癌细胞特异性的肽标 靶共辄体。
【背景技术】
[0002] 包膜化学治疗剂的配体标靶纳米颗粒在癌症治疗上扮演越来越重要的角色，且预 期成为下一代的治疗模式。大肠癌是最常诊断出的癌症之一，且是全球癌症死因的主因。 目前大肠癌的治疗仅具有限的成功率，因此，这类病患迫切需要更有效的治疗方式。发展标 靶药物输送系统是有效输送抗癌药物至肿瘤所必需。发展新颖方法以早期检测及有效治疗 癌症，将取决在癌细胞表面的独特生物标记（biomarkers)的识别及对此类生物标记具高 度结合亲和性的肿瘤特异性配体的分离。肽菌体展示（phage display)是一有效方法， 其通过全细胞淘选（whole-cell panning)而识别能结合至特定细胞类型的肽，使得肽内 化（internalization)，其共辄结合至纳米颗粒时可作为药物输送载具。此容许在细胞内 使用肽输送有毒负载（toxic payloads)以达到治疗效果。然而，标靶肽的靶蛋白识别有 其难度，是因肽的结合亲和性低，且标靶肽与经分离的靶蛋白间难以在全膜萃取物（whole membrane extracts)中维持原始结合作用。
[0003] 因此，本领域存在迄今未解决的需求，以解决上述缺失及不足，特别是与癌症标靶 妝相关者。
【发明内容】
[0004] 在一方面，本发明是涉及一共辄体，其包含：(a) -经分离或合成的长度小于15个 氨基酸残基的标靶肽，其包含一氨基酸序列，其至少90%等同于选自SEQ ID NOs :1、2、及3 的序列；以及（b) -组分，其是共辄结合至标靶肽，该组分是选自药物输送载具、抗癌药物、 微胞、纳米颗粒、微脂体、聚合物、脂质、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、细胞、显像剂、及标记 剂。标靶肽具结合在人类大肠癌细胞的活性，但不结合在正常细胞。
[0005] 前述标靶肽的长度可为10、11、12、13、或14个氨基酸残基，或甚而长度小于10个 氨基酸残基，其前提是维持肽标靶癌细胞的功能。
[0006] 在本发明的一具体实施例中，组分是药物输送载具。药物输送载具可选自由微脂 体、聚合物微胞、脂蛋白系药物载体、纳米颗粒药物载体、树状体、干细胞、及多肽组成的群 组。
[0007] 在本发明的另一具体实施例中，标靶肽可共辄结合至：(a) -或多个药物，其是选 自多索如比辛（doxorubicin)及温诺平（vinorelbine);或（b) -寡核苷酸；或（c) 一显像 剂。显像剂可为但不局限在，放射性分子、放射性药物、或氧化铁颗粒。
[0008] 在本发明的另一具体实施例中，共辄体可进一步包含至少一抗癌药物，其是包膜 在药物输送载具内。该至少一抗癌药物可选自多索如比辛、温诺平、及其任何结合物。
[0009] 在本发明的另一具体实施例中，药物输送载具是微脂体。微脂体可经聚乙二醇化 (PEGylated)〇
[0010] 肽可包含一氨基酸序列，其至少95%等同于选自SEQ ID NO: 1、2、及3的序列。
[0011] 在本发明的另一具体实施例中，肽的序列是选自SEQ ID NO :1、2、及3。
[0012] 在本发明的另一具体实施例中，组分是标记剂，其是共辄结合至标靶肽的C端。在 本发明的此具体实施例中，共辄体可进一步包含：(a)癌细胞，其结合至标靶肽，其中标靶 肽的C端是共辄结合至标记剂；以及（b)交联剂，其将癌细胞交联至标靶肽。
[0013] 在本发明的另一具体实施例中，前述共辄体的组分为蛋白质，即α-烯醇酶。
[0014] 在更另一方面，本发明是涉及一组合物，其包含：(a) -治疗有效量的前述共辄 体；以及（b) -医药上可接受的赋形剂、载体、或载具。
[0015] 此外，本发明是涉及一组合物，其包含：(a) -治疗有效量的前述共辄体，其中抗 癌药物是多索如比辛；(b) -治疗有效量的前述共辄体，其中抗癌药物是温诺平；以及（C) 一医药上可接受的赋形剂、载体、或载具。
[0016] 在另一方面，本发明是涉及治疗癌症的方法，其包含：投予前述组合物至具癌症的 个体。
[0017] 在本发明的另一具体实施例中，癌症包含α-烯醇酶在其细胞表面。癌症可选自 由结肠癌、乳癌、神经胶质瘤、肺癌、血癌、肝细胞癌、食道癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、睾 丸癌、及卵巢癌组成的群组。在更另一方面，本发明是涉及治疗癌细胞的方法，其包含：使癌 细胞在体内或体外暴露在一有效量的前述共辄体。癌细胞可存在于个体，或存在于取自个 体的组织标本。癌细胞可过度表达α-烯醇酶。
[0018] 此等及其他方面将显见在下列较佳具体实施例的说明并伴随下列图标，尽管其中 可能存在变化及改进，但其不背离本发明新颖概念的精神及范围。
[0019] 附图是说明本发明的一或多个具体实施例，并伴随书面描述，以阐述本发明的原 理。尽可能，整体图标中使用相同的参考编号，以表示具体实施例的相同或类似组件。
【附图说明】
[0020] 图I(A)-I(C)显示经选取的噬菌体克隆的体内肿瘤归巢能力的验证。（A)含有 HCT-116异种植体的N0D/SCID小鼠是静脉注射经选取的噬菌体克隆。在8分钟后，以PBS 灌流洗去游离的噬菌体，且移除异种植体及器官以测定噬菌体效价。（B)以免疫组织化学进 行噬菌体的定位检测。噬菌体克隆HCT-63、HCT-69、及HCT-74显示强力累积在肿瘤，但未 在正常器官如大脑、心脏、肺脏、及结肠检出。（C)噬菌体克隆标靶肿瘤组织的活性是受其相 对应肽的竞争抑制。
[0021] 图2 (A)-2 (B)显示特异性噬菌体克隆结合至各癌细胞株及hCRC组织切片手术标 本的活性。（A)以流动式细胞测量术测定各克隆结合至hCRC细胞的表面结合活性。红色： 经选取的噬菌体克隆；黑色：对照组噬菌体（I X IOwPfW^X IO5个细胞）。（B)特异性噬菌 体克隆结合至人类大肠癌组织切片的活性。源自大肠癌病患组织切片的标本是以噬菌体培 养，并以抗M13噬菌体抗体检测。人类大肠癌手术标本可检出经选取的噬菌体而非对照组 噬菌体。
[0022] 图3 (A)-3 (J)显示微脂体性药物标靶输送至hCRC细胞。（A)微脂体多索如比辛 (LD)的低温电子显微镜（Cryo-TEM)显微图片及经安定化的微脂体温诺平（sLV)。（B) LD及 sLV 的粒径分布及 ζ 电位（zeta potential)。（C) DSPE-PEG-NHS 及 DSPE-PEG-pHCT74 共辄 体的MALDI-TOF质谱分析。（D) pHCT74肽共辄结合的LD及pHCT74肽共辄结合的sLV的低温 电子显微镜显微图片。（E)pHCT74-LD及pHCT74-sLV的粒径分布及ζ电位。（F)以不同微脂 体制剂培养后（多索如比辛10 μ g/ml)，HCTl 16细胞的多索如比辛摄取。以细胞裂解液样本 的荧光测定进行多索如比辛的定量。（G)LD或含0.05%至5% (摩尔）pHCT74-peg-DSPE脂 质的LD的体外细胞毒性轮廓，其是以人类HCT116大肠癌细胞进行。（H)以GraphPad Prism 软件计算IC5。值。（I)温诺平、sLV、或pHCT74-sLV的体外细胞毒性轮廓。（J)温诺平、sLV、 及pHCT74-sLV的IC 5。估计值。所显示的数据是取自3个独立实验的平均值。误差杠，SD。 (*，0· 05 彡 P>0. 01 ;**，0· 01 彡 P>0. 001 ;以及 ***，Ρ〈0· 001)。比例尺条带代表 50nm。
[0023] 图4 (A)-4 (H)显示pHCT74肽的靶蛋白鉴定。⑷实验设计示意图。⑶以流动式 细胞测量术评估生物素化的PHCT74肽结合至HCTl 16细胞的特性。（C)生物素化pHCT74肽 与HCT116细胞表面蛋白的交联亲和性，其是以2-巯乙醇自链霉亲和素（streptavidin)磁 珠切断经交联的蛋白质。以银染显示条带。（D)以串联质谱演译的标的条带肽序列（SEQ ID 勵：22)。出）通过将特异性81^熟伍勵14、8、(：、及〇8111?熟）导入!1(：1'116细胞以稳定减量 ENOl基因，其是通过病毒载体感染。（F)在α-烯醇酶基因减量后，HCT74噬菌体的结合活 性下降。（G)当α-烯醇酶过度表达时，HCT74噬菌体的结合活性增加。（H)HCT74噬菌体与 重组型α-烯醇酶蛋白的结合亲和性。将96孔培养盘预涂布2ug/mL的α-烯醇酶蛋白， 并培养在浓度渐增的HCT74噬菌体，之后培养在HRP共辄结合的抗Μ13抗体。数据是以平 均值土标准偏差表不。
[0024] 图5 (A)-5 (I)显示标靶肽pHCT74的共辄结合提升微脂体多索如比辛及微脂体温 诺平在大肠癌异种植入模式的效果。含有人类HCTl 16 ((A)、（B)、（C))或SW620 ((D)、（E)、 (F))大肠癌异种植体的小鼠是分别处理lmg/kg pHCT74-LD、lmg/kg LD、lmg/kg FD、及PBS。 图5(G)、（H)、（I)显示温诺平负载的微脂体对人类大肠癌HCTl 16异种植入小鼠的抗肿瘤 功效。小鼠是分别投予1.511^/1^?!1074-81^、81^、及？85。所有化合物是每周经由尾静脉 注射二次。图5(B)、（C) ; (E)、（F) ; (H)、（I)是在处理结束时，将肿瘤组织切片及秤重。*， 0· 05 彡 P>0. 01 ;**，0· 01 彡 P>0. 001 ;以及 ***，Ρ〈0· 001。误差杠，SEM。
[0025] 图6(A)_6(G)显示pHCT74肽的共辄结合提升微脂体多索如比辛及微脂体温诺 平在大肠癌异种植入模式的效果。含有HCT116异种植体（250mm 3)的小鼠是随机分成7 个处理组，其中每组6只小鼠。投予载具（PBS)、LD(lmg/kg)、sLV(l. 5mg/kg)、LD(lmg/ kg) +sLV (I. 5mg/kg)、pHCT74_LD (lmg/kg)、pHCT74_sLV (I. 5mg/kg)、或 pHCT74_LD (lmg/ kg)+pHCT74-sLV(L5mg/kg)的HCT116异种植入小鼠的肿瘤生长（A)及体重（B)曲线。 在处理结束时，将肿瘤组织切片（C)及秤重（D)。（E)以lmg/kg pHCT74-LD与1.5mg/kg PHCT74-LX组合治疗有六分之三的肿瘤根除。以载具（PBS)、LD(lmg/kg)、sLV(2mg/kg)、 LD (lmg/kg)+sLV (2mg/kg)、pHCT74-LD( lmg/kg)、pHCT74-sLV(2mg/kg)、或 pHCT74-LD( lmg/ kg)+pHCT74-sLV(2mg/kg)处理含有大型HCT116异种植体（650mm3)的小鼠。治疗组的肿 瘤生长（F)及体重（G)曲线。所有化合物是每周经由尾静脉注射二次。*，0. 05彡P>0. 01 ; **，0· 01 彡 P>0. 001 ;以及 ***，P〈0. 001。误差杠，SEM。
[0026] 图7 (A) -7 (F)显示pHCT74-LD与pHCT74-sLV组合治疗在原位大肠癌模式的提升 的抗肿瘤功效。NSG 小鼠（NOD. Cg-Prkdcscld I12rgtmlWil/SzJ)是原位植入 HCT116-luc 细 胞，并在肿瘤接种 5 天后，处理载具（PBS)、FD(lmg/kg)+FV(2mg/kg)、LD(lmg/kg)+sLV(2mg/ kg)、或pHCT74-LD (lmg/kg)+pHCT74-sLV (2mg/kg)。所有化合物是每周经由尾静脉注射二 次。（A)以生物发光监控肿瘤生长，其是使用IVIS200成像系统。（B)以生物发光定量法监 控肿瘤进展。（C)体重。（D)卡本-麦尔存活图（Kaplan-Meier survival plot)。（E)各 处理组的中位数存活天数。（F)对数秩（log-rank)(曼特尔-考克斯（Mantel-Cox))检定 的存活分析，其显示所有个体的存活率（N = 8)。
[0027] 图8为选自HCT116的噬菌体展示的肽序列的比对表。分配至各序列的SEQ ID NOs.由上而下分别为 3、4、5、6、7、8、9、10、11、2、1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21〇
【具体实施方式】
[0028] 本发明更具体而言以下列实施例描述，其仅旨在说明，是因其中许多改进及变化 将由本领域的技术人员所显见。现详述本发