肽。一级胺可直接连接至C端羧 酸基或肽载体的Asp侧链。药物-肽经由酰胺键共辄结合的进行是通过连接药物的羧酸与 间隔子（spacer)/肽的一级胺。在酰胺键形成方面，可以0-苯并三唑-N, N, Ν'，Ν' -四甲 基-脈-六氣磷酸盐（HBTU)或1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC)与 N-羟基苯并三唑（HOBT)的混合物活化间隔子、肽、或药物的羧酸。随后，经活化的羧酸是溶 在不同溶剂，包括二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，并在强碱（即二异丙基乙基胺或三乙基胺） 存在下与对应体（即药物或肽）的胺基反应，以取得所欲的共辄体。欲在多索如比辛与肽 载体间提供间隔子，将胺基与琥珀酸酐或戊二酸酐反应，取得具游离羧酸基的产物，其可连 接至肽的游离胺基。多索如比辛的C14的一级醇是通过酯键连接至载体分子的羧酸基。多 索如比辛的C13酮基亦反应在肼（hydrazine)以形成腙（hydrazone)间隔子，其连接至肽 载体。
[0060] 酯键联是常规用在共辄结合药物与肽，是因其可化学上或酶上（即酯酶）水解以 释放药物。欲共辄结合多索如比辛与肽，以戊二酯修饰多索如比辛的C14,并将戊二酸盐的 其他羧酸连接至肽的D-Lys的侧链胺基，以取得多索如比辛-肽共辄体。
[0061] 可以腙键联作为酸不稳键（acid-labile bond)，以在肿瘤细胞外环境及溶酶体的 pH降低时自共辄体释放药物分子。在C13具酮官能基的道诺鲁比辛（Daunorubicin)及多 索如比辛是衍生肼马来亚酰胺间隔子（即间-马来酰亚胺苯甲酸肼或对-马来酰亚胺苯乙 酸肼），以取得酰肼（hydrazide)中间物。此类马来亚酰胺中间物是反应在肽的Cys残基的 巯基，以取得个别的共辄体。间隔子的芳环的存在提供调节腙键稳定性的可能性。
[0062] 喜树碱（camptothecin)及考布他汀（combretastatin)是共辄结合至肽，其是利 用药物与间隔子间的胺甲酸酯键进行。间隔子含有甲基-胺基乙基部分，其是连接至胺甲 酸酯氮以作为"内建的亲核剂辅助释放"（built-in-nucleophile assisted releasing; BINAR)部分，其作为亲核剂以释放喜树碱。此BINAR部分的二级胺是攻击胺甲酸酯基的羰 基碳，以在间隔子形成五元环脲；其随后释放药物至介质。
[0063] 肽是以1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC)及N-羟基 琥?白酰亚胺（NHS)共辄结合至多索如比辛。共辄体通过Sephadex G25的凝胶过滤而 释放反应物。碳二亚胺共辄结合法避免使用质谱共辄体化学计量测定（Science 1998， 279(5349):377-80)。
[0064] 实施例
[0065] 未意图局限本发明的范围，本发明具体实施例的示例性仪器、装置、方法、及其相 关结果描述如下。应注意到，标题或子标题可用在实施例以方便读者，其不应以任何方式局 限本发明的范围。此外，本文提出及公开特定理论；然而，不论对错，其不应以任何方式局限 本发明的范围，只要该发明根据本发明实施，且不考虑任何特定理论或作用机制。
[0066] 材料与方法
[0067] 细胞株。HCT116、HT29、LS174T、SW620、C0L0 205、A498、HTB-10、B16F10、SK0V3、 PC3、U20S、1112SK、H184、SAS、H460、MIA PaCa2、SK-HEP-l、及 Mahlavu 细胞是购自 American Type Culture Collection(ATCC)，并由ATCC根据DNA轮廓、细胞遗传学分析、及异构酶学 而认证。此类细胞是根据ATCC的方法培养，并在细胞复苏后传代六个月以内。
[0068] 噬菌体展示生物淘选程序。本实验使用基于以随机肽12单体组合库融合至M13 B策菌体pill壳蛋白的·菌体展示的随机肽库（New England Biolabs，MA，USA)。HCT116细 胞是生长至70-80%满。将生长培养基移除，并以无血清的DMEM清洗二次。随后，在4°C下 以阻断缓冲液（含有1 % BSA的无血清DMEM)阻断30分钟。将2X IO11Pfu的噬菌体展示 肽库加至HCT116细胞。将具有反应混合物的细胞培养在4°C的震荡器1小时。在培养后， 以PBS清洗细胞4次，移除未结合的噬菌体。以溶解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、l% Nonidet P-40)回收结合至细胞的噬菌体。经回收的噬菌体是以大肠杆菌ER2738 培养物（New England BioLabs，MA，USA)放大及滴定。经放大的菌体是进行下一轮的生 物淘选，其使用HCT116细胞。第五轮的噬菌体析出物是在LB/IPTG/X-Gal盘上滴定，以确 定噬菌体克隆。
[0069] 以ELISA确定噬菌体克隆。经选取的噬菌体是进一步以ELISA筛选确定。将I X IO4 个细胞种植在96孔ELISA培养盘（Falcon，CA，USA)的各孔内隔夜，并在室温下以2%聚甲 醛或甲醇/丙酮（1:1)固定10分钟。培养盘以PBS清洗二次并在室温下以含有1% BSA的 PBS(w/v)阻断30分钟。接着，将个别的噬菌体克隆加入并在室温下培养1小时。在PBS 清洗三次后，培养盘在室温下以山葵过氧化酶（horseradish peroxidase ;HRP)共辄结合 的小鼠抗M13噬菌体抗体（GE Healthcare)培养1小时，其中稀释倍率为1:2000。培养 盘再次以PBS清洗三次，之后以过氧化酶受质邻苯二胺二盐酸盐（o-phenylenediamine dihydrochloride ;0PD，Sigma)及 H2O2培养。以 3N HCl 终止反应，并以微盘读仪（Model 680, BioRad)在490nm下测定析光值。
[0070] 流动式细胞测量术分析。将细胞生长至70-80%满，并以含有IOmM EDTA的PBS 收取。以Ficoll-Paque Plus密度梯度分离法制备末梢血球单核细胞。以FACS缓冲液（含 1%胎牛血清的PBS)清洗及悬浮细胞后，细胞在4°C下以5X10 9、lX109cfu的个别噬菌 体克隆或对照组噬菌体分别培养1小时。以FACS缓冲液清洗二次后，细胞在4°C下以小 鼠抗M13单株抗体（GE Healthcare)培养1小时，其中稀释倍率为1:2000,之后以藻红素 (phycoerythrin ;PE)共辄结合的山羊抗小鼠二次抗体（Jackson ImmunoResearch)培养30 分钟，其中稀释倍率为1:250。以FACSCantoII (Becton Dickinson)测定发射的荧光信号 并以FlowJo软件分析。
[0071] 噬菌体DNA序列的确定。经选取的噬菌体克隆是以1/6体积的聚乙二醇 (PEG)-NaCl[20% (WtzVol)PEG 8000及2. 5M NaCl]放大及沉淀。将噬菌体沉淀物再次 悬浮在100μΙ的碘缓冲液（IOmM Tris-HCl，pH 8.0、lmM EDTA、4M NaI),并在室温下以 250 μ1的100 %乙醇培养10分钟。在离心后分离噬菌体DNA、以70 %乙醇清洗、风干、及 以50μ1的二次蒸馏水再次悬浮。以二脱氧核苷酸链终止法（di-deoxynucleotide chain termination method)确认经纯化的菌体DNA序列，其是使用自动化DNA序列仪（ABI PRISM 377，Perkin-Elmer，CA，USA)。以- 96gIII 测 3'（SEQ ID N0:23)进行测序，该引物对应于噬菌体次要壳蛋白pill基因序列。
[0072] 体内标靶及竞争试验的动物模式。将5X106个HCT116细胞皮下（s. c.)注射至非 肥胖糖尿病 / 联合免疫缺陷（Non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency ; N0D/SCID)小鼠的背外侧腹。当异种植入肿瘤尺寸达到300±50mm3时，小鼠以2X 10 11Pfu 的标靶噬菌体或对照组噬菌体M13K07进行静脉（i. v.)注射。在注射后7分钟，将小鼠牺 牲，且通过心脏灌流50mL的PBS以清洗未结合的噬菌体。在灌流后，取出异种植入肿瘤 及小鼠器官、以冰冷PBS清洗三次、及切成碎块，其中一些进行均质化。以对数期大肠杆菌 ER2738培养物回收结合至各组织标本的噬菌体，并滴定在LB/IPTG/X-Gal琼脂培养盘。在 肽竞争性抑制实验中，共同注射2X IO9Pfu的噬菌体与100 μ g的对应肽或不相关的对照 组肽。
[0073] 噬菌体在异种植入肿块的免疫组织化学定位。将取自体内噬菌体归巢实验的组 织标本包埋在冷冻蜡块。欲以免疫组织化学法评估各组织的噬菌体分布，将冷冻样本切成 8- μ m厚的切片并收集在经涂布的玻片。以冰冷PBS清洗玻片以移除0CT，并在室温下以 4%聚甲醛固定10分钟。欲阻断内源性过氧化酶活性，在室温下将玻片浸泡在含有3%过 氧化氢的甲醇中30分钟。通过室温下将切片浸入含有1% BSA的PBS中30分钟，阻断非 专一性抗体结合位点。组织切片以小鼠抗M13单株抗体培养1小时，其稀释倍率为1:250 ; 之后加入 Super Enhancer 试剂（Super SENSITIVE? Polymer HRP Detection System/ DAB, BioGenex)中反应20分钟及在Poly-HRP试剂（BioGenex)中反应30分钟。在清洗后， 切片以DAB(3, 3'-二胺基联苯胺）色素原（BioGenex)显影，其中补充Stable DAB缓冲液。 加入PBS终止反应。在细胞核染色方面，将玻片浸入苏木精（hematoxylin)中5分钟，且 随后以覆盖液覆盖以终止反应。拍摄切片影像，并以自动化撷取系统（TissueGnostics) 分析。
[0074] 通过免疫组织化学法的噬菌体克隆肿瘤结合分析。人类大肠癌手术标本是取 自台湾大学附设医院病理部（Department of Pathology, National Taiwan University Hospital)样本库。将OCT包埋的冷冻组织蜡块切成8- μ m厚的组织切片、收集在经涂布 的玻片、及在室温下以2%聚甲醛固定10分钟。将含有3%过氧化氢的甲醇加至玻片上 30分钟，之后以含有1 % BSA的PBS阻断30分钟。样本以小鼠抗M13单株抗体培养1小 时，其稀释倍率为 1:200，之后加入 Super Enhancer 试剂（Super SENSITIVE? Polymer HRP Detection System/DAB，BioGenex)中反应 20 分钟及在 Poly-HRP 试剂（BioGenex)中 反应30分钟。在清洗后，切片以DAB(3, 3' -二胺基联苯胺）色素原（BioGenex)显影， 其中补充Stable DAB缓冲液，且加入PBS终止反应。在细胞核染色方面，将玻片浸入苏 木精中5分钟，且随后以覆盖液覆盖以终止反应。拍摄切片影像，并以自动化撷取系统 (TissueGnostics)分析。
[0075] 肽合成及标记。肽是在CEM Liberty自动化微波肽合成仪（Matthews，NC，USA)合 成，其使用标准Fmoc系固相化学、HOBt/HBTU活化、及Wang树脂（0. 55meq/g取代）。生物 素化形式的肽包括一额外的N端或C端生物素及Gly-Gly-Gly间隔子。肽是N端以生物素 P-硝基苯基酯（biotin P-nitrophenylester;biotin-〇Np)生物素化。生物素 N0VATAG? 树脂是用在C端生物素化肽的合成。以二阶段加入7ml含有20%哌啶的DMF进行去保 护反应，其中初始去保护为45°C下30秒，之后为75°C下3分钟。在75°C下，以5当量的 Fmoc-AA-OH与l:l:lAA/DIC/0xyma反应5分钟，完成偶合反应。在合成完成后，在室温下以 TFA/TIS/水（95:2. 5:2. 5)自树脂裂解肽2. 5小时，之后沉淀并加入冰冷乙醚清洗。
[0076] 肽-PEG-DSPE共辄体的合成。将含有N-羟基琥珀酰亚胺基-羧基聚乙二醇 (MW, 3400)衍生的二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺（distearoylphosphatidyl ethanolamine; NHS-PEG-DSPE ;8. 5mg)的0. 25ml二氯甲烷加入含有3. Img肽的0. 25ml DMS0。其之后与 0.0 llml的三乙基胺混合以催化反应。肽与NHS-PEG-DSPE的化学计量摩尔比为I. 1:1。反 应是在室温下进行72小时。以2kDa截止膜（cut-