交联单体的单体组合物进行反应的步骤，其中聚酸单体和交联单体之一包含径基官 能团且聚酸单体和交联单体之另一包含能够与所述径基官能团反应形成醋连接基的互补 官能团，并且其中选自聚酸单体和交联单体中的至少一者是支链的。
[015引在上述方法的一种形式中，原位生成的气态缩合物随着其形成而导致聚酸网络聚 合物膨胀，由此导致网络聚合物发泡。在一种形式中，膨胀的多孔聚酸网络聚合物可W类似 于或者是多孔海绵。由于聚酸单体和交联单体之间形成的醋连接基，聚合物海绵是可生物 降解的和交联的。
[0159]在一组用于制备多孔可生物降解的聚酸网络聚合物的实施方案中，含有聚酸单体 和交联单体的单体组合物在有限空隙体积（finitevoidvolume)的容器中进行反应。有 限空隙体积的容器可W是封闭的反应容器。在有限空隙体积的容器中的单体反应可能会影 响孔径或结构。例如，与当相同的单体组合物在更小的有限空隙体积的容器中的反应相比， 单体组合物在具有较大的有限空隙体积的容器中的反应将在多孔聚酸网络聚合物中生成 较大的孔。认为孔径的差异与容器中原位生成气态缩合物而造成的压力有关。也可通过改 变单体组合物中单体的量来获得孔径的类似改变。
[0160]在用于制备多孔可生物降解的聚酸网络聚合物的另一些实施方案中，单体组合物 在无限空隙体积的容器中进行反应。例如，可W允许单体组合物在开放的容器中进行反应。 在运种情况下，所得到的多孔聚酸网络聚合物将具有大的孔径。
[0161] 单体组合物中聚酸单体和交联单体的反应可在室溫下或升高的溫度下进行。
[0162]在多孔可生物降解的聚酸网络聚合物的制备中使用的单体组合物可包含本文所 述的任一实施方案的聚酸单体和交联单体。
[0163]在一种形式中，聚酸单体包含多个径基官能团且交联单体包含多个簇酷面化物官 能团。
[0164]在一种具体的形式中，聚酸单体包含多个径基官能团且交联单体包含多个酷氯化 物官能团。在运样的实施方案中，当径基和酷氯化物官能团反应W形成醋连接基时，原位生 成的气态缩合物将是气态盐酸（HCl)。
[0165] 在一些实施方案中，在多孔可生物降解的聚酸网络聚合物的制备中使用的单体组 合物还可包含如本文所述的机械性能改性剂。在一组实施方案中，所述单体组合物可包含 选自多至20% (w/w)、多至15% (w/w)和多至10% (w/w)的量的机械性能改性剂。
[0166]机械性能改性剂可W是疏水性大分子。示例性的疏水性大分子是聚醋多元醇，例 如二径基聚（己内醋）。在一组实施方案中，单体组合物可包含选自0 %至20 % (w/w)、 0. 1 %至15% (w/w)和约0. 5%至10% (w/w)的量的聚醋多元醇。
[0167] 在一些实施方案中，在多孔可生物降解的聚酸网络聚合物的制备中使用的单体组 合物还可包含如本文所述的成孔剂，例如成孔剂颗粒。在一个实施方案中，成孔剂颗粒是盐 颗粒，例如融合的盐颗粒。成孔剂可具有选自约50Jim至1000Jim，约100Jim至700Jim，或 约300ym至600ym范围内的粒径。成孔剂可有助于产生较大的孔和/或有助于控制在聚 酸网络聚合物中产生的孔的大小和结构。
[016引可生物降解的多孔聚酸网络聚合物可具有互连的多孔结构，多孔结构是由于聚酸 单体和交联单之间的反应W及从该反应中产生的气态缩合物在原位形成的。如果用于制备 多孔网络聚合物的单体组合物包含成孔剂，则可产生具有大孔的互连多孔结构。
[0169]包含大孔和互连通道的的互连多孔结构对于组织工程应用可W是有利的。大孔将 允许组织和血管穿透并促进组织的增殖和发育。此外，互连的通道可提供多孔结构中细胞 迁移、组织扩张和血管系统形成的途径。多孔结构的互连性质也将允许输送养分和流体W及清除细胞废物。
[0170] 本文所述的聚酸网络聚合物适合用于其中期望生物相容的和可生物降解的聚合 物的应用范围。
[0171] 可生物降解的聚酸网络聚合物在体外和体内展示了优异的机械性能和降解特性 W及无毒性和极低免疫原性。运些特征最终使得网络聚合物成为用作组织工程应用之支架 和用作细胞培养和可植入装置之基质的优异的候选物。聚酸网络聚合物的可生物降解性意 味着任何外来材料都不会在植入部位积累，从而使周围的组织恢复其天然结构。
[0172] 本发明还提供了在对象中再生组织的方法，该方法包括在对象的期望部位植入包 含根据本文描述的任一实施方案的可生物降解的聚酸网络聚合物之支架的步骤。在一组实 施方案中，组织是脂肪组织且支架被植入到对象的乳房区域。该支架可用于需要组织再生 的重建或美容过程。
[0173] 本发明还提供了培养细胞的方法，所述方法包括在细胞培养的条件下，使细胞与 包含根据本文描述的任一实施方案的可生物降解的聚酸网络聚合物之基质相接触的步骤。 该方法可用于在细胞培养中能够增殖的任何增殖性细胞。在该方法的一组实施方案中，细 胞选自内皮细胞和上皮细胞，特别是角膜内皮细胞和角膜上皮细胞。
[0174] 本发明还提供了用于制备可植入装置的方法，其包括提供包含根据本文描述的任 一实施方案的可生物降解的聚酸网络聚合物之基质W及将所述基质接种到细胞上的步骤。 在一种形式中，所述装置是用于植入对象的眼部的可植入眼部装置，所述细胞选自角膜上 皮细胞和角膜内皮细胞。
[0175] 本发明还提供了用于治疗对象的疾病或病症的方法，其包括提供包含基质的可植 入装置和将细胞接种到该基质上W及在对象需要治疗的位置植入该装置的步骤，所述基质 包含根据本文所述的一个或更多个实施方案中的可生物降解的聚酸网络聚合物。在一些实 施方案中，疾病或病症是角膜内皮功能障碍，且该方法包括在对象的眼中植入眼植入物的 步骤，其中眼植入物包括基质和接种到该基质上的角膜内皮细胞，所述基质包含根据本文 所述的一个或更多个实施方案中的可生物降解的聚酸网络聚合物。本发明人观察到用眼植 入物能够在数周内有利地维持角膜透明度。
[0176] 本发明的聚酸网络聚合物在生物环境中能够降解并产生无毒的降解副产物。生物 降解的速率可W从几天到几周不等，并且可通过改变在聚酸网络聚合物中的不稳定的醋连 接基的量来调整。在一些实施方案中，聚酸网络聚合物的降解可发生在约2周至约20周的 时间内。
[0177] 在一些实施方案中，可通过调整网络聚合物的形态来改变聚酸网络聚合物的可生 物降解性。例如，多孔海绵形式的聚酸网络聚合物可展现出更快的降解速率，原因是聚合物 的多孔结构提供更大的可暴露于生物环境的表面积。
[0178] 本发明的可生物降解的聚酸网络聚合物是已发现为生物相容的、无毒的和极低免 疫原性的合成聚合物。能够控制网络聚合物的降解性、机械性能和渗透性使得运些聚合物 可被制成用于再生医学和组织工程应用的通用基质和支架。
[0179] W下的实施例旨在说明本发明的范围W及使得能够再现和进行比较。它们并非旨 在W任何方式限制本公开的范围。 阳180]连施例
[0181] 可生物降解的聚（乙二醇）（阳G)膜 [01础材料
[0183] 甘油乙氧基化物（M。~IkDa)、癸二酷氯95%)、憐酸盐缓冲盐水（PB巧片 剂、￡-己内醋（97%)、2,2'-二硫二乙醇（90%)、辛酸亚锡（~95%)、甲苯（无水， 99.8% )、Costar超低附着板、膜岛素、转铁蛋白、砸、4' ,6-二脉基-2-苯基吗I噪值API) 的巧光染色、化itonX-IOO和葡聚糖化~500000、葡萄糖测定试剂盒（SigmaGAG0-20: 葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂和邻联茵香胺二盐酸盐）和来自牛的白蛋白-异硫氯 酸巧光素缀合物（白蛋白-門TC)是从SigmaAl化ich获得并按原样使用。Du化ecco改 良的Eagle培养基值MEM)、胎牛血清（FetalBovineSerum,FB巧、心谷氨酷胺、膜蛋白 酶-EDTA化05% )、台吩蓝（0.4% )和青霉素-链霉素是从GIBCO获得。在用于细胞存 活力测定之前，给DMEM补充10%v/v的FBS，1%v/v的k谷氨酷胺和1%v/v的青霉 素-链霉素。NUNCT225、斜颈瓶（cantedneckflask)是从HiermoFisherScientific获 得。Thermanox组织培养塑料灯CP)玻片是从UNC获得。Du化ecco改良的Eagle培养基： 养分混合物F12〇)MEM:F12)、抗生素-抗真菌剂、表皮生长因子巧GF)、胎牛血清（fetal calfserum,FCS)、AlexaFluor488 山羊抗小鼠IgG、膜蛋白酶和邸TA从Invitrogen获 得。在小鼠克隆M17-P5-F11产生的抗化7K+ATP酶（0 2-亚基）单克隆抗体从Santa化UZ Biotechnology获得。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDIToFM巧的基质反 式-2-[3-(4-叔下基苯基）-2-甲基-2-亚丙締基]丙二腊值CTB) (>99.0)和阳离子化剂 (化1尸4(99.999%))购自41化1油并按原样使用。四氨巧喃灯邸）化〇1167巧611，99.99%)、 D-葡萄糖（> 99. 5% )、二氯甲烧巧9. 5% )由化em-Supply提供并按原样使用。用于细 胞存活力测定的CelltiterAqueous化e溶液是从Promega获得并按原样使用。
[0184]a，O-二径基聚己内醋（机械性能改性剂）的合成
[018引 通过e-己内醋的开环聚合（ring-openingpolymerisation,R0P)制备a，O二 径基聚己内醋（二径基P化）。将e-己内醋（20.0g，175mmol)、2,2'-二硫二乙醇（1.08g， 7.OOmmol)和辛酸亚锡（0. 95g，2. 34mmol)溶解于无水甲苯（45mL)中，并在110°C于氣气下 加热24小时。将混合物冷却至室溫，用THF巧0血）稀释，并沉淀到冷甲醇（-18°C，1L)中。 通过过滤收集沉淀物并在真空下（0.Imbar)下干燥W得到18. 8g(94% )为白色粉末的a， ? 二径基PCL;Mn(NMR)= 3.化Da,Mn(MAU)ITo巧=3. 3kDa(PDI= 1. 07)。
[0186] 可生物降解的阳G膜的制备
[0187] 将所需量的二径基PCUP化含量分别为5wt%或lOwt%)溶解于二氯甲烧值CM) (15血）中。将甘油乙氧基化物化70mmol)和癸二酷氯（1. 42mmol)添加到二径基rcL溶液 中，将其充分混合并使其在室溫下静置1小时，偶尔进行揽拌。还制备了不含rcL的样品。 用于制备PEG膜的单体溶液详述于表1。
[018引 表1
[0189]
[0190] 将一定体积（7. 5血）的每一种上述单体溶液移液到玻璃培养皿（直径10cm)上。 然后将每个培养皿放置在真空烘箱中于6(TC持续20分钟，之后施加真空（20mbar)。再过 30分钟后，将皿取出并使其冷却至室溫。用解剖刀对该膜的周边进行划痕并将培养皿中装 满去离子水（20mL)。15分钟后，除去水并添加1 : 1的THF:去离子水（40mL)。将膜从培 养皿表面剥离并放置于水（250mL)中。每15分钟用新鲜水（3X250mL)替换该水，并将膜 在真空下干燥24小时（20mbar，3(TC)。将干燥的膜储存在干燥器中直到进一步使用。
[0191] 使用环境扫描电子显微镜巧nviro-SEM)和光谱反射率分析来测定交联的阳G膜 的厚度。测定了水化的膜的平均厚度为约50ym。
[0192] 由于膜的厚度小W及流延（casting)条件（20mba;r，60°C)，在流延过程中挥发性 溶剂二氯甲烧和形成的HCl气体很容易被除去。随后用水对水凝胶膜进行洗涂和使其溶 胀W确保完全除去肥1。用四氨巧喃灯H巧替代水使得在膜内进行水和THF之间的溶剂交 换，产生的溶胀使得膜易于从培养皿表面剥离，在干燥状态下若不损坏流延膜，则无法实现 剥离。
[0193] 平衡溶胀率和接触角测量
[0194] 为了观察溶胀特性，允许W上制备的PEG膜在1XPBS中溶胀24小时。使用等式 ESR% =( (Ws-Wd) /Wd)X100%计算各种膜的平衡溶胀率巧SR% )，其中Ws和Wd分别指的是 溶胀重量和干重。对于每种类型的膜W-式=份进行分析并且结果取平均值。
[0195] 用DataPhysicsOCA20张力计进行水接触角测量。对具有Owt%、5wt%和 lOwt%PCL含量的完全溶胀的膜使用座滴法（sessile化OPtechnique) (10yL液滴），用 OCA软件记录测量值。在将水滴置于膜的表面上60秒后进行测量。
[0196] W上实验的结果示于表2中。
[0197] 表 2
[0199] 如在表2中所示，发现随着rcL含量的增加（0wt%、5wt%和lOwt% )，膜的ESR% 略有下降（分别为118%、109%、100% )。运是由于疏水？化成分的斥水作用降低了阳G 膜的溶胀能力的结果。增加的rcL含量也导致接触角从44°分别增加至58°和67°，表明 PEG膜的疏水性略有增加。
[0200] 光透射率评估
[020。将水化的阳G膜置于1XPBS溶液中1小时，然后进行UV-Vis评估。在25°C下记录 膜对UV和可见光谱（290nm至750nm)的透射率。结果掲示，在所有波长（400nm至700nm) 下，含0%、5%和10%P化的阳G膜均能透过> 98%的可见光。
[0202] 拉伸评估
[020引进行拉伸测试W测定用不同量的？化(0巧*%、5巧*%和10巧*%)制备的阳6膜的 拉伸能力并使其与人角膜进行比较（表3)。使脱水的膜在IXPBS中溶胀并切割成具有 2X2cm测量区（gagearea)和2cm突起物（t油）的狗骨头形状W用于评估其拉伸性能。将 该膜夹在InstronMicrotester金属夹内的木突起物之间W防止膜的滑移和错口撕裂（jaw tearing)。在拉伸试验前，运些膜未进行应力预适应（precondition)。在IXPBS溶液中溫 度控制的microtester的水浴中于35°C进行膜的拉伸评估。每种类型的膜（具有Owt%、 5wt%和lOwt%的PCL)测试最少S个重复。用50N负荷传感器（loadcell)将夹紧的样 品WO.Imm/秒的速率进行拉伸，直到在测量区发生膜的破裂。在原始数据的汇编中忽略在 测量区未破损的任何膜。将从Bluehill软件获得的数据导出到化iginPro7. 5软件中进 行绘图并确定关键参数，例如极限拉伸应力/极限拉伸应变（ultimatetensilestress/ strain)W及拉伸模量。结果总结于表3中。
[0204]表 3
[0206] 从上述结果已显示添加疏水性rcL可改善所得的阳G膜的机械性能。此外，具有 Owt%和5wt%P化含量的阳G膜展示出与德斯密膜值escemet'SMembrane)可媳美的拉 伸模量，当开发用于再生角膜内皮细胞的可植入装置时，运可W有所帮助。
[0207] 体外降解研究
[020引将具有0%、5%和10%P化含量的水化膜切成2X2cm的正方形。用水（20血）W5分钟的间隔洗涂S次后，将膜在真空下（20mbar)于40°C干燥24小时。将干燥的膜称重， 转移至小瓶（28mL)中并添加lXPBS(20mL)。随后，将容器置于溫度受控的定轨摇床中，维 持在35°C(角膜前房的自然溫度）。在1、2、4和8周的时间点从定轨摇床中取出具有膜的 S个容器。用水（3X20mL)将取出的膜洗涂15分钟，偶尔轻轻揽拌，并在真空下（20mbar) 于4(TC干燥24小时。将干燥的膜称重并将质量对时间进行作图W获得膜的降解谱。对具有 0%、5%和10%P化含量的膜的降解程度的计算显示，在8周内的质量损失分别为~24%、 15%和10%。结果不于图2中。
[0209] PEG膜的体外渗透性评估
[0210] 在具有5血池体积的并排式扩散池（PermeGear，Bethlehem,PA)中进行葡萄糖和 白蛋白的扩散率测量。将膜巧wt%PCL)置于扩散池之间并紧紧地夹住W防止泄漏。对于 葡萄糖测量，一个池（来源池）中填充含葡萄糖的PBS(0.05g/mL，4mL)且另一个池（目标 池）仅填充PBS缓冲液（4mL)。对于白蛋白的测量，将含白蛋白-异硫氯酸巧光素缀合物 (白蛋白-門TC)的PBS(50yM，4mL)放置于来源池中并将PBS缓冲液放置于目标池中。对于 葡萄糖和白蛋白测量两者，在磁力揽拌下将每个池中的室保持在35°C。在设定的时间（30、 45、60、80和100分钟）将等分试样（2mL)从目标池中取出并用新鲜的PBS(2mL)替换。对 于葡萄糖测量，制备用于使用葡萄糖测定试剂盒（SigmaGAG0-20:葡萄糖氧化酶/过氧化 物酶试剂和邻联茵香胺二盐酸盐试剂）之分光光度分析的样品并使用化ima化UUV-1800 分光光度计在540皿处进行分析。对于白蛋白测量，使用化ima化UUV-1800分光光度计测 量白蛋白-FITC在495皿处的吸光度。
[0211] 体外渗透性研究显示具有5%P化的膜对于葡萄糖和白蛋白分别具有 2. 3 (±0. 3)X10 6CmV秒和1. 0 (±0. 2)X10 7CmV秒的扩散率。相比之下，文献报道显示人 角膜对葡萄糖和白蛋白分别具有2. 6 (±0. 3)X10 6CmVs和1.OX10 7cm7s的扩散率（参 见RafatM，LiF，FagerholmP，LagaliNS,WatskyMA,HungerR，MatsuuraT，Griffith M.PEG-stabilisedcarbodiimidecrosslinkedcollagen-chitosanhydrogelsfor cornealtissueengineering.Biomaterials2008;29:3960-3972)。体外扩散性研究表 明PEG膜对大分子和小分子两者都是可渗透的。所述大分子和小分子对于组织（例如人角 膜）的生存和功能是重要的。
[021引 PEG膜的体外细胞毒性评估
[021引为了评估膜的细胞毒性，将脱水的膜巧wt%的P化，IOOmg)置于80%v/v的乙醇 溶液中，持续30分钟。然后洗涂该膜并用无菌PBS(3X20mL)W10分钟的间隔进行再水 化。随后将再水化的膜置于无菌的补充的DMEM(2mL)中，随后在37°C下解育72小时。从 溶液中取出膜并在细胞生存力测定中使用条件培养基。为了研究膜降解产物对细胞生存力 的影响，将脱水的膜（500mg)在IM肥1(5血）中降解30分钟。将溶液在真空下浓缩并将 残余物与水巧X20mL)共沸，然后在真空下（0.Imbar)干燥。将降解产物（IOOmg)溶解于 无菌DMEMOmL)中。然后使溶液在UV下灭菌30分钟，并通过0.22ym的尼龙过滤器过滤， 之后用于毒性研究。在37°C下，具有95%-100%的湿度的5%C02气氛中，使NIH3T3-L1 细胞在T225瓶中于补充的DMEM中生长至汇合。用0. 05 %膜蛋白酶-EDTA(GIBCO)将细胞 膜蛋白酶消化，使用台吩蓝手动计数活细胞/死细胞染色，用新鲜培养基进行稀释W得到 1.25XIO5个细胞/mL的接种密度并接种在96孔板（SOiiL/孔）上。留下一些空白孔作 为细胞空白对照。将板放回培养箱中，持续4小时，之后添加膜条件培养基和膜降解产物溶 液。将制备的储备溶液巧Omg/mL