lXPBS(20mL，0.01%w/v的叠氮化钢）中。将小瓶密 封并放入溫度可控的定轨摇床中（37°C，IOOrpm)。在各个时间点（1、2、4和8周）从定轨摇 床取出3个样品并在去离子水（3X20mL)中洗涂30分钟。随后，通过将聚合物浸泡在乙醇 (2X20mL)中1小时，接着在真空中（60°C，24小时）干燥进行脱水。然后将干燥的样品称 重并将获得的质量值对时间进行作图W得到降解谱。
[031引降解研究掲示用TmsCl制备的多孔PEG海绵在8周内有约40%的质量损失，而用SebCl制备的那些多孔PEG海绵在8周内有约35%的质量。到4周时，用SucCl制备的多 孔阳G海绵已经完全降解（图15)。
[0316] 多孔PEG海绵的体外细胞毒性评估
[0317] 为了多孔PEG海绵的细胞毒性的评估，制备了两种类型的样品。为了评估多孔水 凝胶的细胞毒性，将干燥的多孔PEG海绵称重，将IOOmg置于80 %v/v的乙醇溶液，持续30 分钟。然后洗涂多孔PEG海绵并用无菌PBS(3X20分钟）再水化并放在2mL的无菌DMEM 中，随后在37°C解育72小时。然后取出多孔PEG海绵并在细胞生存力测定中使用条件培 养基。为了研究水凝胶降解产物对细胞生存力的影响，将干燥的水凝胶巧OOmg)在IMHCl 溶液巧血）中降解。在真空下与水巧X20mL)共沸除去肥1，最后在高真空下干燥。称重 IOOmg的降解产物并使其溶解/重悬浮于2mL的无菌DMEM中。然后将溶液在UV下灭菌30 分钟，并通过0. 22ym的过滤器过滤，之后用于毒性研究。在37 °C下，具有95 % -100 %的湿 度的5%C02气氛中，使NIH3T3-L1细胞在T225 瓶中于DMEM中生长至汇合。用0.05%膜 蛋白酶-邸TA将细胞膜蛋白酶消化，使用台吩蓝手动计数活细胞/死细胞染色，用新鲜的培 养基稀释W达到1. 25XIO5个细胞/血的接种密度并接种在96孔板上（80yL/孔）。留下 一些空白孔作为细胞空白对照。将板放回培养箱中，持续4小时，之后添加多孔PEG海绵条 件培养基和降解产物。将制备的储备溶液巧Omg/mL)用新鲜的完全培养基按因数10稀释 两次。将其20JiL的两种稀释物W-式S份添加到96孔板中（W获得IOOppm和1000 ppm 的浓度），通过板的轨道运动轻轻地混合，然后将板放回培养箱中再解育72小时。解育后， 将CelltiterAqueous化e溶液添加到板（20JiL/孔）中。轻轻摇晃板W帮助混合，然后放 回到培养箱中，持续30分钟至4小时。W定期的间隔，使用配备有微板读数器的Cary50 BioUV-可见分光光度计在490nm和700nm处读取板的UV-Vsi吸光度。在约2小时解育后 溶液的颜色达到平衡。用背景吸光度（700nm)和培养基单独的吸光度（细胞空白对照）校 正在490nm处的吸光度值，然后归一化至生长对照。
[031引在不同浓度（10化pm和1000 ppm)的多孔PEG海绵条件培养基存在下，解育72小 时后，观察到所有交联剂对细胞生存力的影响极小（图16(a))。在通过快速的酸介导之降 解获得的降解产物的存在下，在I(K)PPm没有观察到对细胞的代谢活性有显著的影响（如图 16化)）。另一方面，在1000 ppm观察到代谢活性稍有降低，但是相对于对照，此差异是极小 的。
[0319] 多孔阳G海绵的体内评估
[0320] 将用癸二酷氯（2wt%的PCL)制备的溶胀多孔PEG海绵（实施例17)切成圆盘 10X4mm(直径X高度），在真空中干燥（20mbar，60°C)并置于塑料小瓶中，双重密封在自 封袋内，之后进行丫福照灭菌。在Ste;ritech，Victo;ria，Australia中进行丫灭菌（25kGy 最小值）。灭菌后，在植入前将水凝胶置于IX无菌PBS中持续3个小时。将多孔PEG海 绵在3个时间点植入12只大鼠中。所有的步骤都是根据澳大利亚国家健康与医学研究委 员会（NHMRC)的指导方针进行的，并经墨尔本大学，圣文森特医院动物伦理委员会批准。雄 性SpragueDawley大鼠（动物资源中屯、（Murdoch)WesternAustralia)，35〇±5〇g体重） 关在批准的设备中并喂食标准的大鼠饲料并随意饮水。手术前2天和手术后2天，W饮水 的形式W25. 5mg/kg/天的剂量施用抗生素-恩诺沙星度aytril50，Baye;r)W避免伤口感 染。对于手术，麻醉动物并使用异氣烧维持麻醉状态。对背表面上的皮肤进行剌毛、消毒并 沿中线制成四个独立的纵向切口，约1. 5cm长，相距1. 5cm。通过在主切口的任意一边小屯、 地用纯器解剖来制备每个支架的单独的皮下袋，并将海绵插入到每个袋中，并使用通过中 屯、孔且进入周围筋膜的3-0聚丙締缝线将其错定到合适的位置。使用伤口夹闭合伤口并使 动物在加热垫上恢复30分钟。在植入后2、8和16周，如先前所描述的使大鼠麻醉，重新打 开原始伤口，取出水凝胶支架和周围组织，然后通过屯、内注射Ieth油art使大鼠安乐死。将 取出的海绵垂直于圆形表面切成两半，并用4%的多聚甲醒溶液于4°C固定48小时，并通过 石蜡处理。处理之后，将外植体包埋W便可W观察和分析完整的横截面和周围组织。通过 样品的中点切割5ym厚的切片并封片在多聚赖氨酸包被的载玻片上。使用苏木精和伊红 (H組）对切片进行染色并使用抗邸1的抗体对巨隧细胞和巨细胞进行免疫组织化学分析。 [0321]植入2周后，多孔阳G海绵很好地并入组织中，只形成薄的囊（图17d)。在2周后 观察到关于水凝胶的尺寸的微小改变；聚合物海绵保持完整并清晰可见（图17e)。在加工 到石蜡中后，将聚合物海绵切片，随后用H&E染色W观察渗透进聚合物海绵的细胞和组织 (图17g-i)。H&E染色的切片显示致密细胞组织和高度血管化组织从周围组织渗入水凝胶 中。从指示血管位置的染色的红细胞可清楚地看到血管（图17h-i)。可W看到血管化组织 能够从周围组织渗透到聚合物海绵的中屯、（如通过H&E染色的切片所证明的）。在染色的 切片中观察到的大间隙可能是由于加工进石蜡造成的脱水而导致的多孔PEG海绵孔壁和 穿透的组织收缩引起的。
[032引8周获取也显示在并入周围组织之多孔阳G海绵周围的薄纤维囊。获取的组织的 二等分显示外植体尺寸的厚度减小并且观察到聚合物海绵材料变黄。通过H&E染色证实组 织浸润至支架的中屯、，但是没有观察到渗透组织的量有显著差异（图17j)。然而，注意到8 周后存在的组织是疏松结缔组织，而不是在2周时存在的致密细胞组织（图17k，1)。多孔 阳G海绵的血管形成很可能是由于来自周围组织的血管形成，因为没有进行细胞或生物因 子装载。
[032引血管化组织渗透到聚合物海绵的中屯、证明了多孔阳G海绵的孔的互连性。到2周 时细胞和血管组织的渗透表明多孔阳G海绵对细胞组织和血管是可渗透的。因此，多孔阳G 海绵具有适合于细胞和血管结合的3D环境，并保证渗透组织的存活。
[0324] 与在2周和8周时相比，在16周更加难W定位植入物，原因是在切除时所观察到 的植入物突起缩小。按照2周和8周，在周围组织中没有副作用的宏观证据。存在少量固 体组织并粘附至缝线。切割粘附至缝线的组织和缝线周围的组织并进行组织学处理。获取 之组织的二等分掲示，植入物的尺寸小得多且仅剩余非常少量的多孔阳G海绵（图18a)。
[0325] 进行H&E染色W辨别组织形态并观察多孔阳G海绵的存在。H&E染色的切片的分 析掲示，到16周，剩余极少量的多孔PEG海绵（图18b和C)。其中存在多孔PEG海绵残余 物的地方，周围组织是平常的致密细胞组织和血管组织。运表明，在16周内聚合物海绵发 生严重的降解，表明其在体内的可生物降解性。
[0326] 巨隧细胞和异物巨细胞（FBGC)的存在是对植入物的先天免疫应答的指示。作为 确定巨隧细胞和FBGC反应的一种手段，对所有切片进行邸1免疫染色（图18d-l)。2周样 品的邸1染色掲示如所预测的存在巨隧细胞。在第2周通过邸1染色观察到巨隧细胞主要 是存在于渗透组织的中屯、，一些位于组织/聚合物界面处（图18d-f)。8周切片的分析显 示巨隧细胞反应已显著降低，且巨隧细胞的尺寸小的多（图18g-i)。染色的组织主要W非 炎性细胞为主，在支架/组织界面存在的量极少，表明对水凝胶材料的反应极小。到16周 聚合物海绵已经发生了严重降解（如剩余极少量的支架所证明的）。邸1染色的16周切片 显示极少量的巨隧细胞（图20j-l)。通过邸1染色对切片进行分析，多孔PEG海绵及其降 解产物最初导致轻微的炎症反应，运种反应超过16周就显著降低。
[0327]体内研究掲示在植入16周后，对于多孔阳G海绵及其降解产物没有观察到副作 用。通过使血管组织W极低免疫原性渗透和到16周时严重降解，多孔PEG海绵表现出作为 支架的理想性能。
[032引应当理解，在不背离如本文所概述的本发明的精神的情况下，可作出多种其他修 改和/或改变。
[0329] 除非上下文另有说明，否则在整个本说明书和所附的权利要求书中，术语"包括" 及其变形例如"包含"和"含有"将理解为指包含陈述的整数或步骤或者整数组或步骤组， 但不排除任何其他的整数或步骤或者整数组或步骤组。
[0330] 在本说明书中提到的任何现有出版物（或从其中推出的信息）或任何已知事项， 不是并且不应认为是承认或认可或W任何形式暗示现有出版物（或从其中推出的信息）或 已知事项构成本说明书所努力设及的领域的公知常识的一部分。
【主权项】
1. 通过酯连接基交联的可生物降解的聚醚网络聚合物，其是通过使包含多官能聚醚单 体和多官能交联单体的单体组合物聚合而制备的，其中所述聚醚单体和所述交联单体之一 包含羟基官能团并且所述聚醚单体和所述交联单体之另一包含能够与所述羟基官能团反 应形成酯连接基的互补官能团，且其中选自所述聚醚单体和所述交联单体的至少一者是支 链的。2. 根据权利要求1所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述互补官能团选自羧 酸、羧酸酯、羧酸酐和羧酰卤化物。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述互补 官能团是羧酰卤化物。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述聚醚 单体包含多个羟基官能团。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述聚醚 单体是支链的。6. 根据权利要求5所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述聚醚单体具有式 (I)的结构： A(BX)n ⑴ 其中： A是η价核心； B是聚醚链段； X是羟基官能团；并且 η表示（BX)基团的数目且至少为3。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述聚醚 单体包含衍生自C2-C3二元醇的聚醚链段。8. 根据权利要求7所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中聚醚链段各自具有在约 IOODa至约10, OOODa、约150Da至约5000Da和约200Da至约1000 Da范围内的分子量。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述聚醚 单体选自甘油乙氧基化物和季戊四醇乙氧基化物。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述交联 单体包含至少两个羧酰卤化物官能团。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述交 联单体具有式（II)的结构： R(Y)n (II) 其中： R是烃基； Y是选自羧酸、羧酸酯、羧酸酐和羧酰卤化物的互补官能团；并且 m表示Y基团的数目且至少为2。12. 根据权利要求11所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述式（II)的交联单 体具有式（IIa)或（IIb)的结构：其中： R是烃基；并且 Y是选自羧酸、羧酸酯、羧酸酐和羧酰卤化物的互补官能团。13. 根据权利要求11或权利要求12所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中R包含 2至12个碳原子。14. 根据权利要求11至13中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中Y是羧 酰卤化物官能团。15. 根据权利要求14所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述羧酰卤化物官能 团包含选自氯化物和溴化物的卤化物部分。16. 根据权利要求1至15中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述 交联单体选自琥珀酰氯、己二酰氯、癸二酰氯、戊二酰氯、庚二酰氯、辛二酰氯和均苯三甲酰 氯，优选琥珀酰氯和癸二酰氯。17. 根据权利要求1至16中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中在所述 单体组合物中所述聚醚单体与交联单体的摩尔比在约5 : 1至1 : 5的范围内，优选为约 3 : 1至1 : 3,最优选为约1 : 2。18. 根据权利要求1至17中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述单 体组合物还包含机械性能改性剂。19. 根据权利要求18所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述单体组合物包含 多至20% (w/w)，优选多至15% (w/w)，更优选多至10% (w/w)的机械性能改性剂。20. 根据权利要求18或权利要求19所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述机 械性能改性剂是疏水性大分子或疏水性低聚物。21. 根据权利要求20所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述疏水性大分子是 聚酯多元醇。22. 根据权利要求21所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其中所述疏水性大分子是 二羟基聚（己内酯）。23. 根据权利要求1至22中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物，其是多孔的， 平均孔直径在约Inm至约3mm的范围内。24. 体外细胞培养基质，其包含根据权利要求1至22中任一项的可生物降解的聚醚网 络聚合物。25. 根据权利要求24所述的细胞培养基质，其为膜的形式。26. 基质，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物。27. 支架，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的可生物降解的聚醚网络聚合物。28. 纳米多孔膜，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的可生物降解的聚醚网络 聚合物。29. 用于制备通过酯连接基交联的可生物降解的聚醚网络聚合物的方法，所述方法包 括在允许聚醚单体和交联单体之间形成酯连接基的条件下，使包含多官能聚醚单体和多官 能交联单体的单体组合物进行反应的步骤，其中所述聚醚单体和所述交联单体之一包含羟 基官能团并且所述聚醚单体和所述交联单体之另一包含能够与所述羟基官能团反应形成 酯连接基的互补官能团，且其中选自所述聚醚单体和所述交联单体的至少一者是支链的。30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述互补官能团选自羧酸、羧酸酯、羧酸酐和羧 酰卤化物。31. 根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述互补官能团是羧酰卤化物。32. 根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述聚醚单体包含多个羟基官能 团。33. 根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述聚醚单体是支链的。34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述聚醚单体具有式（I)结构： A(BX)n ⑴ 其中： A是η价核心； B是聚醚链段； X是羟基官能团；并且 η表示（BX)基团的数目且至少为3。35. 根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述聚醚单体包含衍生自C2-C3 二元醇的聚醚链段。36. 根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述聚醚链段各自具有在约 IOODa至约10, OOODa、约150Da至约5000Da和约200Da至约1000 Da范围内的分子量。37. 根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述聚醚单体选自甘油乙氧基化 物和季戊四醇乙氧基化物。38. 根据权利要求29至37中任一项所述的方法，其中所述交联单体包含至少两个羧酰 卤化物官能团。39. 根据权利要求29至38中任一项所述的方法，其中所述交联单体具有式（II)的结 构： R(Y)n (II) 其中： R是直链烃、支链烃或环烃； Y是选自羧酸、羧酸酯、羧酸酐和羧酰卤化物的互补官能团；并且 m表示Y基团的数目且至少为2。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述式（II)的交联单体具有式（IIa)或（IIb) 的结构：其中： R是直链烃、支链烃或环烃；并且 Y是选自羧酸、羧酸酯、羧酸酐和羧酰卤化物的互补官能团。41. 根据权利要求39或40所述的方法，其中R包含2至12个碳原子。42. 根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中Y是羧酰卤化物官能团。43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述羧酰卤化物官能团包含选自氯化物和溴化 物的卤化物部分。44. 根据权利要求29至43中任一项所述的方法，其中所述交联单体选自琥珀酰氯、己 二酰氯、癸二酰氯、戊二酰氯、庚二酰氯、辛二酰氯和均苯三甲酰氯，优选琥珀酰氯和癸二酰 〇45. 根据权利要求29至44中任一项所述的方法，其中在所述单体组合物中聚醚单体 与交联单体的摩尔比在约5 : 1至1 : 5的范围内，优选为约3 : 1至1 : 3,最优选为约 1:2。46. 根据权利要求29至45中任一项所述的方法，其中所述单体组合物还包含机械性能 改性剂。47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述单体组合物包含多至20% (w/w)，优选多至 15% (w/w)，更优选多至10% (w/w)的机械性能改性剂。48. 根据权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述机械性能改性剂是疏水性大 分子或疏水性低聚物。49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述疏水性大分子是聚酯多元醇。50. 根据权利要求49所述的方法，其中所述疏水性大分子是二羟基聚（己内酯）。51. 根据权利要求29至50中任一项所述的方法，其中所述聚醚单体和所述交联单体之 间的反应在室温下进行。52. 根据权利要求29至51中任一项所述的方法，其中所述聚醚单体和所述交联单体之 间的反应生成气态形式的缩合物，所述缩合物在聚醚网络聚合物中产生孔。53. 根据权利要求29至52中任一项所述的方法，其中所述单体组合物还包含固体成孔 剂。54. 根据权利要求53所述的方法，其中所述单体组合物包含成孔剂颗粒。55. 根据权利要求54所述的方法，其中所述成孔剂颗粒是盐颗粒。56. 用于制备通过酯连接基交联的多孔可生物降解的聚醚网络聚合物的方法，所述方 法包括在允许形成通过酯连接基交联的聚醚网络聚合物且在原位生成在网络聚合物中产 生多个孔的气态缩合物的条件下，使包含多官能聚醚单体和多官能交联单体的单体组合物 进行反应的步骤，其中所述聚醚单体和所述交联单体之一包含羟基官能团并且所述聚醚单 体和所述交联单体之另一包含能够与所述羟基官能团反应形成酯连接基的互补官能团，其 中选自所述聚醚单体和所述交联单体的至少一者是支链的。
【专利摘要】本发明涉及通过酯连接基交联的可生物降解的聚醚网络聚合物，包含所述可生物降解的聚醚网络聚合物的基质、植入物和支架，用于制备这类网络聚合物、植入物和支架的方法，以及使用包含所述网络聚合物的基质、植入物和支架的方法，特别是用于培养细胞和再生组织。
【IPC分类】C08G65/00, A61L27/18, A61F2/00, C08G63/668
【公开号】CN105358185
【申请号】CN201480032915
【发明人】安东·布伦科韦, 贝尔卡伊·厄兹切利克, 格雷格·光华·乔
【申请人】墨尔本大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年4月10日
【公告号】EP2983726A1, US20160060392, WO2014165917A1