抗微生物肽的制作方法

抗微生物肽的制作方法
【专利说明】抗微生物肽
[0001] 本发明涉及生物化学领域。更具体地，本发明涉及抗微生物肽的领域并涉及对抗 细菌、病毒、真菌和寄生虫感染。
[0002] 抗微生物肽(AMP)是整个自然中生物体防御系统的必需组分并且提供抵抗侵入的 病原体的保护。AMP并不靶向单一限定的分子结构(表位），而是作用在细胞膜上因此快速杀 死细菌和真菌。因此，与常规抗生素相反，无论细菌的代谢活性如何，它们都是有效的。除了 它们的直接杀微生物活性，抗微生物肽是特别有吸引力的，由于某些肽显示出多重活性，如 先天和适应性免疫系统的调节、炎症和伤口愈合、以及其它的抗真菌、抗病毒、抗寄生虫和 抗癌活性。AMP在序列和二级结构上是特别多种多样的，但是它们有一些共同的性质。它们 通常是短的（约15-40个氨基酸）、阳离子型、两亲性并且大部分通过破坏细菌膜的完整性来 发挥它们的杀微生物作用。AMP与靶微生物的阴离子膜表面的相互作用导致膜透化、细胞裂 解和死亡。公认胞质膜是大多数抗微生物肽的主要靶标，而膜中肽的积累导致增加的透过 性和屏障功能的丧失，造成胞质组分泄漏和细胞死亡。已经提出了一些唯象的和其它更为 量化的膜透化的各种分子机制以揭示AMP的作用。
[0003] 主要通过地毯模型或孔模型来使模型系统中的实验观察结果合理化（图1)。在地 毯模型中，AMP在平行于膜取向的膜表面上积累导致细胞膜的局部膜变薄和不稳定，造成胞 内物质释放。然而，存在有力证据表明许多AMP也以去污剂样的方式通过以非特异性方式破 坏脂质的包装和组织(例如，脂质的极性和非极性基团的离析或脂质聚簇)或通过诱导非双 层脂质聚集体来发挥作用。此外，一些AMP通过细胞膜并且与胞内靶标相互作用（图1)导致 细菌/真菌活力丧失。
[0004] 明显地，AMP作用的模式与常规抗生素不同，后者通常具有简单靶标，如细胞壁 上、或蛋白质中的独特表位和RNA合成过程，这使得病原体细菌更快发展出耐药性。抗微生 物肽优于常规抗生素的主要优势在于并不容易发展出针对这些AMP的微生物耐药性，最可 能是因为这些肽(与常规抗生素不同）并不靶向单一限定的分子结构(表位），而是作用在细 胞膜上，由此在几分钟内杀死细菌和真菌。因此，由于快速杀伤速率快于细菌的生长速率和 靶标的性质（脂质组成显著改变会影响细菌细胞活力），更不可能发展出耐药性。在肽的亚 抑制浓度存在下的重复传代培养(sub-culture)之后监测细菌易感性，已经确定出现对AMP 有耐药性的突变株，其显示突变速率低于测试的其它临床抗生素（例如，环丙沙星和红霉 素）。虽然这些抗生素的最小抑制浓度(MIC)在全部传代培养中增加(高达64倍），肽的压迫 并没有增加菌株的MIC。因此，与常规抗生素不同，在AMP存在下不太可能发展出耐药性。此 外，AMP是快速作用和生物可降解的，这减轻了目前关于环境中残留抗生物的顾虑。
[0005] 多种微生物感染与生物膜形成相关，其中微生物在自产的聚合物基质中的结构化 的群落中聚集并粘附于表面。常规抗生素的另一个缺点在于，由于以下原因，它们不能确保 根除生物膜感染：
[0006] 1)常规抗生素向生物膜中的渗透不足：
[0007] 包埋细菌的基质保护它们免受外部影响，如抗微生物物质。大多数抗生素能够透 过生物膜，但是它们向生物膜中的扩散缓慢，使得它们在能够引发其所需效果之前失活。
[0008] 2)细菌的低代谢活性:通常用万古霉素(经常与利福平联用)来处理生物膜相关的 感染(BAI)。虽然已知万古霉素能够非常良好地透过生物膜-虽然是在明显降低的转运速率 下-其使位于生物膜内的细菌的数量减少的能力较差。因此，用这种抗生素处理仍然有较高 的失败率，这可由生物膜中细菌的低代谢活性来解释，这使得抗生物无效。
[0009] 3)抗生素的失活或降解:在BAI中，抗生素大多数是全身性给予的。因此，它们易于 经由肾清除从血流中去除并且在血液和周围组织中酶促降解。酶（由细菌产生)可直接破坏 或修饰化合物。这些机制有力降低了药物在局部环境中的浓度。在生物膜中，低渗透带来另 一个问题。由于高血液浓度抗生素具有毒性，提高全身性给药浓度是不可行的。
[0010] 4)细菌已经发展出耐药性:除了一般增加的针对抗生素的细菌耐药性，由于在更 深层中抗生素浓度降低，细菌从抗生素压迫下逃逸的风险更高，这可能导致对这些抗生素 的耐药性增加的突变株的存活。已经报道了抗生素(包括万古霉素）的次优浓度强化了生物 膜形成。此外，重复给予效果不足的常规抗生素促进了抗生素耐药性的发展。
[0011] 5)常规抗生物导致促炎性微生物化合物的释放:已经显示在BAI中，细菌在植入物 周围组织中定居。这在很大程度上是由于局部免疫反应的失调。这也是为何在许多病例中， 甚至在替换植入物之后，感染持续的原因。生物材料的植入引发称为"外来体反应"的炎性 反应，其特征在于嗜中性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞的连续流入，之后是巨噬 细胞与衬套生物材料的多核外来体巨细胞的融合，新成纤维细胞形成和纤维沉积，导致外 来体的纤维化/包封。这一顺序的时间受到分子信号的高度调节，如由涉及的细胞类型产生 的细胞因子。在感染的情况中，另外由称为"病原体相关分子模式"（PAMP)的细菌分子触发 宿主免疫系统，这些分子由宿主细胞上的特异性受体识别，如To 11 -样受体(TLR)。例如，细 菌肽聚糖或脂多糖被TLR2和TLR4识别，并且是炎性反应的强效诱导物。同时通过外来体反 应和细菌感染激活免疫系统导致宿主免疫系统的"过度(over the top)"反应，造成发炎和 破坏的组织，事实上提供了感染的理想环境。因此，生物材料和PAMP的同时激活可能对免疫 功能造成有害的作用并且强烈地增加了感染易感性。
[0012]现在，已知超过2 0 0 0种不同的抗微生物肽序列（参见例如 www.bbcm.univ. trieste. it/~tossi/search.htm)，包括天蚕素、防卫素、爪蟾抗菌肽和导 管素 (cathelicidin)。抗微生物肽和蛋白质，例如，描述于：
[0013] US 6,503,881，其公开了阳离子肽是待用作抗微生物肽的尹杜抗菌肽类似物。阳 离子肽衍生自不同的物种，包括动物和植物。
[0014] US 5,912,230，其公开了抗真菌和抗细菌的基于组胺素(1^5^&^11)的肽和治疗真 菌和细菌感染的方法。这些肽基于天然产生的人富组蛋白的氨基酸序列的确定部分。
[0015] US 5,717,064，其公开了甲基化的富赖氨酸裂解肽。裂解肽耐受胰蛋白酶消化并 且是非天然的。裂解肽适用于体内给药。
[0016] US 5,646,014，其公开了从来自蚕血淋巴的抗微生物部分分离的抗微生物肽。该 肽展示出对几种细菌菌株的抗微生物活性，如大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄 球菌(Staphylococcus aureus)和錯状芽抱杆菌(BaciIlus cereus) 〇
[0017] WO 2004/016653,其公开了基于天青杀素的20-44序列的肽。该肽含有由二硫键桥 连连接的环结构。
[0018] US 6,495,516，其公开了基于杀菌的551^)&蛋白质杀菌/透过性增加蛋白（8?1)的 肽。该肽展现出抗微生物效果并具有LPS-中和能力。
[0019] WO 01/81578,其公开了编码G偶联蛋白质-受体相关的多肽的多个序列，其可用于 多种疾病。
[0020] WO 2004/067563和WO 2005/040192,其公开了基于肽LL-37(人导管素的37C-末端 氨基酸)的抗微生物肽。
[0021 ] 几种AMP、达托霉素和DPK-060现在正处于临床使用和/或研发中，例如，多粘菌素 B、尼生素、培西加南、奥米加南、艾塞加南。此外，已经进行了0P-145的2期临床试验，其是衍 生自内源性人导管素抗微生物肽LL-37的24个氨基酸的肽。0P-145已经发展为用于局部治 疗慢性中耳炎的内毒素中和抗微生物肽。当前已知的AMP仍然存在几个缺陷。虽然蛋白水解 降解对于环境是有益的(无残留AMP)，但是其阻止了动态循环。可也由高效的肽清除导致。 同时，AMP的精确工作机制仍然在很大程度上未知，因此难以预期它们的真实应用和全部潜 能。例如，通常不知道AMP如何与宿主细胞相互作用以诱导其作用。因此，在临床症状中使用 AMP已限于局部应用。
[0022] 多种细菌，如绿脓假单胞菌(P · aeruginosa)、奠肠球菌(E · faecal is)、奇异变形菌 (Proteus mirabilis)、酿胺链球菌（Streptococcus pyogenes)和金黄色葡萄球菌 (S.aureus)全部分泌降解几种抗微生物肽(如导管素 LL-37)的蛋白酶。因此，从治疗的角度 来看，耐蛋白酶的抗微生物肽有优势。另外，许多抗微生物肽在通常于问题性发病机理中起 关键作用的具有挑战性的微生物如细菌(例如，金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌）中不是 非常高效的，并且需要经优化以显示增加的效果。此外，由于AMP针对细菌以及哺乳动物膜 的潜在裂解性和其它性质，设计新肽的挑战之一取决于开发与受感染患者的细胞膜相比， 具有高的针对微生物如细菌或真菌细胞的特异性的AMP，即高治疗指数(最小溶血浓度/最 小抗微生物活性;MHC/MEC)。
[0023] 因此，即使现在存在较大量的抗微生物肽，对新的改善的抗微生物肽仍然存在增 加的需求，其可用于中和微生物，尤其是对抗生物剂和/或其它抗微生物剂有耐药性或耐受 性的那些微生物。更重要的是，存在对新抗微生物肽的需求，其在导入哺乳动物如人时是非 变应原性的并且具有针对致病性微生物的高特异性。
[0024] 本发明的一个目的在于提供新型强效抗微生物肽，其克服了常规抗生素的短处并 具有优于已知的抗微生物肽改善的性质。另一目的在于提供新型肽，其展示出针对生物膜 感染中的致病性微生物的高活性。
[0025] 发明人发现序列为LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的多肽PlO在体外对(耐药性)革兰 氏阳性菌(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))和革兰氏阴性菌(例如，绿脓 假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))以及真菌，例如白色念珠菌(Candida albicans)和 黑曲霉(AspergiIlus niger)是高度有效的。如图2A和213所示，PlO相比任意其它测试的肽 明显更有效。另外，PlO能够在塑料以及生物表面(受伤的3-D人皮肤模型)上阻止甲氧西林 耐药性金黄色葡萄球菌生物膜形成。此外，PlO中和内毒素脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)和脂 多糖(LPS)，由此降低促炎反应。PlO采用α-螺旋产生两亲性结构，其中极性氨基酸位于螺旋 的一侧并且亲水性氨基酸位于相反侧。其中引入脯氨酸取代以打破螺旋的肽没有活性，表 明多肽的两亲性质对于其生物活性而言是重要的。已经进行的临床试验发现PlO甚至比OP-145 (Ρ60 . 4Ac) 明显更为强效 ，如图 2-5 所示 。如图 2Β 所示并在实施例中 详述， PlO 的 IC99.9 (0.59μΜ)甚至低于P60.4Ac的IC90(0.75μΜ)。因此，在0.59μΜ的浓度下，PlO杀死1000个细菌 中的999个，而Ρ60.4Ac在相似甚至稍高的浓度下仅杀死1000个细菌中的900个。因此，与相 似浓度下的PlO处理相比，用P60.4Ac处理之后存活的细菌超过100倍。此外，PlO具有宽活 性谱，由于其针对广泛的微生物包括细菌、真菌、病毒和寄生虫有活性。
[0026] 本发明的抗微生物肽对生物膜感染的独特效果在以下三点：它们将1)防止生物膜 形成并打散已有的生物膜，2)杀死释放位点处及周围的细菌、真菌或其它微生物，和3)通过 中和促炎微生物内毒素如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)和脂多糖(LPS)并激活巨噬细胞以促 进它们的吞噬作用和杀微生物活性来协调免疫反应。这种免疫控制对于防止植入物周围的 组织变为病原体的新环境而言是必要的。本发明的多肽针对多种微生物有活性，包括对常 规抗生物有耐药性的那些。
[0027] 还发现：i)P10变体，其中一个或全部氨基酸被其D-氨基酸取代(表2)，ii)P10变 体，其中所述肽已经用包括乙酰基、酰胺、NH-(CH 2-CH2-O)11-OK己酰基、癸酰基、肉豆蔻酰 基、丙酰基、1个或2个氨基酸-己酰基基团的不同基团在N端或C端延长，iii)P10变体，其中 一个氨基酸已经被另一种L-氨基酸取代，和iv)较短的P-IO变体，其具有与PlO相当的抗微 生物活性，如实施例中所证明（参见表2、3、5和6)。
[0028] 因此，本发明的多肽具有针对残留或不残留在生物膜中的微生物的抗微生物高活 性，具有由内毒素中和活性表明的最佳的抗炎(微生物化合物-中和)活性，高选择性（即抗 微生物高活性），可接受的低细胞毒性和免疫增强活性。
[0029]因此，本发明提供了 一种分离或重组多肽，所述重组多肽包含氨基酸序列 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR，或所述氨基酸序列的变体，
[0030]所述多肽具有抗微生物、抗细菌、抗病毒、抗