乙酸/水I /10 (v/v)中并冻干。使用UPLC-MS (沃特斯公司(Water s)的Acqui ty)检验肽的纯 度并且使用Maldi-Tof质谱(布鲁克公司(Bruker)的Microf lex)检验完整性，显示预期的分 子质量。
[0233] 缩写：
[0234] Fmoc :9H_荷基甲氧羰基
[0235] NMM: N-甲基吗啉
[0236] PyB0P:苯并三唑-丨_基-氧基-三-吡咯烷-六氟磷酸鱗
[0237] TFA:三氟乙酸
[0238] 细菌菌株
[0239]由荷兰马斯特里赫特的马斯特里赫特大学医学中心的S.Croes博士友情提供甲氧 西林耐药性金黄色葡萄球菌（MRSA)的临床分离株LUH14616(参见Croes S BMC Microbiol · 2009 ;9:229 · doi : 10 · 1186/1471-2180-9-229)，并且由MEOC Heck博士（荷兰比 多芬(BiIthoven)，RIVM，国立公共卫生与环境研究所，感染性疾病和筛选实验室)赠送莫匹 罗星耐药性MRSA LUH 15051。
[0240] 金黄色葡萄球菌JAR描述于Campoccia等（Int J Artif Organs · 2008年9月；31 (9)：841-7)〇
[0241] 细菌在-80°C下储存直至使用。通过将从血液琼脂板分离的MRSA菌落在胰蛋白酶 大?汤（TSB)培养基（法国Le Pont de Clax的BD公司（Becton Dickinson))中解育2.5小 时，然后稀释至所需的浓度来制备对数中期细菌接种物。
[0242] 表 1
[0245] 体外杀伤试验
[0246] 为了在对数中期细菌上进行体外杀伤试验，MRSA LUH14616和MRSA LUH 15051在 PBS中重悬至lx IO6细菌/ml的浓度。随后，200μ1加入事先冻干的一定浓度范围的肽LL-37、 P60.4Ac(0P-145)和Ρ10。随后，细菌-肽混合物在37°C下孵育1小时。为了建立这些肽的杀伤 能力，混悬液连续稀释并接种在DST琼脂板上以测量有活力的CFU计数。通过线性回归分析 来计算 IC90、IC99 和 IC99.9 值。
[0247] 为了用PlO变体进行体外杀伤试验，金黄色葡萄球菌JAR(lmln CFU/ml)在37°C下 与PBS或I3BS/人血浆（1/1，v/v)中各种浓度的肽孵育2小时。表2-6显示了导致杀死99.9%的 细菌的肽的浓度(残留iooocFiVmihLcgig是2次独立实验的平均值。
[0248] 人皮肤等效物
[0249]如El Ghalbzouri等（Lab Invest · 2004年1 月；84( 1): 102-12)所述制备人皮肤等 效物。简言之，将5xl05个正常人角质形成细胞接种在充斥成纤维细胞的大鼠尾胶原基质 上。事先通过制成接种正常人成纤维细胞(4mg/ml胶原，IOx HBSS，1M NaOH，FCS和成纤维细 胞）的基底(〇. 1 %乙酸，4mg/ml胶原，汉克斯平衡盐溶液(HBSS，IOx)，IM NaOH和FCS)和顶部 胶原层来制备胶原基质。使用3μηι孔径的Transwel 1滤器（Corning 3414，克斯塔公司 (Costar))来培养人皮肤等效物。胶原基质在成纤维细胞介质中培养一周。全厚度的人皮肤 等效物首先在37°C和7.3 % CO2下在角质形成细胞介质中浸没培养2或3天，然后如上所述在 角质形成细胞介质中培养，但是用1%FCS并补充2M L-丝氨酸、IOmM L-肉毒碱、ΙμΜ DL-a-生育酚-乙酸盐、50μΜ抗坏血酸、含有1:1:1比例的棕榈酸、亚油酸和花生四烯酸的脂质补充 物，和2.4x10、牛血清白蛋白。在2或3天后，随后将HSE如上所述在角质形成细胞介质中空 气-液体界面处培养14天，但没有血清并补充2M L-丝氨酸、IOmM L-肉毒碱、ΙμΜ DL-a-生育 酚-乙酸盐、50μΜ抗坏血酸、脂质补充物(含有25μΜ棕榈酸、30μΜ亚油酸和7μΜ花生四烯酸(2: 1:1)以及2.4xHT 5M牛血清白蛋白。每周2次更新培养基。
[0250] 烧伤感染模型和实验处理
[0251 ] 如上所述使用0.4μηι孔径的transwell滤器(Corning 3460，克斯塔公司）重建全厚 度皮肤模型。在空气-液体界面处培养10天后，通过在皮肤等效物上施涂液氮15秒来造成 20_2的烧伤口。在感染之前，热损伤的皮肤等效物在37°C和7.3%CO 2下孵育1小时。通过在 皮肤等效物上施加接种物中的IXIO5MRSA来进行感染。在孵育1小时后，去除未粘附的细菌。 处理在感染后1或8小时开始并且给予一个剂量（100ml的PBS中IOOyg)的LL-37、P60.4Ac或 P10。处理在加工之前延长4或24小时。用Iml的PBS洗涤皮肤等效物以去除所有未粘附的细 菌。然后，取2个4_的活检物并在Iml的PBS中匀化。匀化物和洗涤物连续稀释以在诊断灵敏 性测试(DST)琼脂板上测量活CFU计数。
[0252] 结果
[0253] PlO的鉴定
[0254] 合成一组15个肽。肽经设计，以在与P60.4AC相比时，强化或弱化预测的两亲性结 构(Nell MJ等，PeptideS(2006)649-660)，其基于计算机辅助的结构预测。抗生物膜活性在 肽（以这种方式生成的较高和较低活性的抗微生物肽)之间的有高度活力的。预期抗微生物 肽内的两亲性螺旋结构的修饰和抗生物膜活性之间存在微秒的关系。因此，基于这些观察 开发了一系列短合成肽，并且评价其抗微生物活性。这些肽的活性在无抗微生物活性和以 摩尔为基准具有超过LL-37的活性的肽之间变化。P60.4AC和测试的15个肽的序列是：
[0256] 肽PlO非常高效地杀死MRSA LYH14616。其具有所有测试的肽中最高的针对MRSA LUH14616的活性，并且甚至明显比P60.4Ac(0P-145)更有效，参见图2A和B。例如，PlO的 IC99.9为0.59μΜ，表示在该浓度下PlO杀死1000个细菌中的999个。P60.4AC在类似甚至稍高 的0.75μΜ的浓度下仅杀死1000个细菌中的900个（IC90为0.75μΜ)。因此，与相似浓度下的 PlO处理相比，用Ρ60.4Ac处理之后存活的细菌超过100倍。因此，PlO的活性大约是Ρ60.4Ac 的100倍。
[0257] PlO和变体的活性
[0258] 肽10在杀死MRSA和莫匹罗星耐药性MRSA中以及从热损伤的人皮肤等效物中消除 细菌方面比LL-37和P60.4Ac更有效（图3-5)。
[0259] PlO对于对数期、稳定器的细菌和生物膜中残留的细菌的MRSA细菌是高度有效的。 [0260]另外，PlO针对以下高度有效：
[0261 ] 1)革兰氏阳性菌，例如，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)的各种甲 氧西林耐药性以及敏感性菌株(参见图4和5)，
[0262] 2)革兰氏阴性菌，包括各种(耐药性)绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌 株，（耐药性)鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)菌株，
[0263] 3)分枝杆菌，和
[0264] 4)真菌病原体（氟康唑耐药性）白色念珠菌（Candida albicans)和黑曲霉 (Aspergillus niger)。
[0265]其中一个或所有氨基酸已被其相应D-氨基酸取代，或一个氨基酸已被另一个L-氨 基酸取代的PlO变体具有与PlO相当的抗微生物活性。同时，具有用不同基团，包括乙酰基、 酰胺、NH-(CH2-CH 2-O)11-OK己酰基、癸酰基、肉豆蔻酰基、丙酰基、1个或2个氨基-己酰基基 团在N端或C端延长的变体和较短的PlO变体具有与PlO相当的抗微生物活性。这些PlO变体 的序列和活性示于表2、3、5和6中。其中导入脯氨酸取代以打断螺旋的肽是活性最差的（参 见表4)。
[0266]表2.其中一个氨基酸被其D-氨基酸(小写字母)取代的PlO变体和相对物以及逆反 肽的活性。J =乙酰基，B =酰胺
[0270 ]表3.其中肽在N端或C端用不同基团延长的P10变体的活性。J =乙酰基，B =酰胺，ο =NH- (CH2-CH2-O) li-CO，b =己酰基，j =癸酰基，u =肉豆蔻酰基，U =丙酰基。Z =氨基-己酰 基
[0273]表4.其中已经通过用P(脯氨酸，已经报道是螺旋破坏残基)取代2个特定氨基酸修 饰肽的P1 〇变体的活性。J =乙酰基，B =酰胺
[0276]表5.其中一个氨基酸已被另一个L-氨基酸取代的PlO变体的活性。J=乙酰基，B = 酰胺
【主权项】
1. 一种包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或所述氨基酸序列的变体的分离 或重组多肽， 所述多肽具有抗微生物、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫和/或抗炎活性， 所述变体具有至少16个氨基酸，并且： -具有以下氨基酸取代中的至多5个： ?选自L、I、V或A的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代； ?选自R、K或Η的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代； ?由Q取代Ε ?由F取代Υ或W ?选自Q、N、A、S或Τ的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代 -其中一个或多个氨基酸由对应的D-氨基酸取代， -其中一个或多个氨基酸由对应的非天然氨基酸取代，和/或 -具有来自所述氨基酸序列的至少16个连续氨基酸的逆反序列。2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽任选地在N端和/或C端被修饰，优选 包含N端乙酰基-、己酰基-、癸酰基-、肉豆蔻酰基-、NH-(CH 2-CH2-〇) n-CO-或丙酰基-残基， 和/或包含C端酰胺-、NH- (CH2-CH2-〇) n-CO-酰胺-和1个或2个氨基-己酰基基团。3. 如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述变体包含至少氨基酸序列 YKKIVEKLKRWLRQVL，所述序列具有权利要求1所述的氨基酸取代中的至多5个。4. 一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求1 - 3中任一项所述多肽的核酸序 列。5. -种载体，所述载体包含如权利要求4所述的核酸分子。6. -种重组宿主细胞，所述细胞包含如权利要求4所述的核酸分子和/或如权利要求5 所述的载体。7. -种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的多肽或其药学 上可接受的盐、权利要求4所述的核酸分子和/或权利要求5所述的载体以及至少一种药学 上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂。8. 如权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物配制用于局部给药，如乳膏、凝胶、 油膏、洗液、泡沫、悬液、喷雾、气溶胶、粉末气溶胶。9. 如权利要求7或8所述的药物组合物，所述药物组合物还包含其他抗微生物剂，优选 选自下组:青霉素类、头孢菌素类、莫匹罗星、碳青霉烯类。10. 如权利要求7-9中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物包含控释递送运载体 和/或靶向递送运载体，所述运载体包含所述多肽，其中所述运载体优选选自下组:纳米颗 粒、微粒、纳米胶囊、微胶囊、脂质体、微球、水凝胶、聚合物、脂质复合物、血清白蛋白、抗体、 环糊精和葡聚糖。11. 包含权利要求1-3中任一项所述多肽的医疗装置涂层。12. 用作治疗、预防或诊断剂的权利要求1-3中任一项所述的多肽和/或权利要求4所述 的核酸分子。13. 用于治疗微生物、细菌、真菌、病毒和/或寄生虫感染和/或用于治疗由细菌、真菌、 病毒和/或寄生虫引起的病症的权利要求10所述的多肽和/或核酸分子。14. 一种治疗被细菌、真菌、病毒和/或寄生虫感染的对象的方法，所述方法包括给予所 述对象治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4所述的核酸分子或权利 要求7-9中任一项所述的药物组合物。15. -种制备权利要求1-3中任一项所述多肽的方法，所述方法包括： -提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码权利要求1-3中任一项所述多肽的核酸序 列； -用所述核酸分子转化宿主细胞； -在允许所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞； -从所述细胞收获所述多肽； -任选地在N端或C端修饰所述多肽。
【专利摘要】本发明涉及抗微生物肽，包含该肽的药物组合物及其治疗或预防微生物、细菌、真菌、病毒和寄生虫感染的用途。
【IPC分类】A61K38/00, C07K14/00
【公开号】CN105555290
【申请号】CN201480039600
【发明人】P·H·尼博林, P·希姆斯特拉, J·W·德里弗豪特
【申请人】莱顿大学学术医院以Lumc的名义运作
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年5月9日
【公告号】CA2911919A1, EP2994154A1, US20160075749, WO2014182172A1