室温稳定的疫苗的干燥制剂的制作方法
【专利说明】室温稳定的疫苗的干燥制剂
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2013年9月27日提交的临时申请美国序列号61/ 883,611的优先权，其内容在此处以其整体通过引用并入。 发明领域
[0002] 本发明涉及包含一种或多种活的减毒病毒的疫苗的室温稳定的干燥制剂。本发明 还涉及此类疫苗的干燥制剂的制造和用所述疫苗接种动物受试者的方法。
[0003] 背景 当在室温下储存长时间段时，活的减毒病毒是不稳定的。因此，大多数活的减毒病毒疫 苗在使用前冷冻干燥和冷藏。然而，此类疫苗的运输和储存导致必须传递至疫苗诊所、兽 医、家畜操作者/农民且最终传递至宠物所有者或消费者的显著额外费用。此类费用可证明 在贫困社区和第三世界国家中是禁止性的。因此，对于人BCG疫苗，WHO需要在37°C下28天之 后的>20%的最小存活率[参见例如，Jin等人，Vaccine 29:4848-4852 (2011)]。
[0004] 存在大量可以感染伴侣动物(诸如狗、猫和马)或家畜(诸如家禽、牛和猪)的病毒。 例如，虽然由于相应的病毒感染的症状例如可以包括轻度感冒样症状，但其它可以是快速 致命的，如犬瘟热病毒(CDV)感染的情况[参见例如US2010/0196420]。事实上，CDV触发可以 涉及眼、呼吸道、胃肠道、皮肤和神经系统的多系统感染。来自犬细小病毒(CPV)的死亡率也 相对高[参见例如US2009/0010955LCPV主要是肠病原体，其感染犬，尤其是幼犬，并且特征 在于在超过4至5周龄的犬和幼犬中的急性腹泻、发热和白细胞减少症。甚至更年幼的犬可 患有心肌疾病。犬瘟热病毒和犬细小病毒是需要保护幼犬/犬不受其害的两种最重要的犬 病毒。
[0005] 其它犬病毒包括:犬副流感(CPI)病毒，其是引起促成上呼吸道疾病和传染性气管 支气管炎传染的呼吸系统疾病的高度传染性病毒;导致传染性肝炎的犬1型腺病毒(CAV1); 和高度传染性且可以引起严重类型的呼吸系统疾病的犬流感病毒(CIV)。已报道，CIV能够 引起100%感染，伴随80%发病率，和在严重感染中高达5-8%的死亡率[Crawford等人， Science 310 (5747):482-485 (2005) ;U.S. 7,959,929 B2]。类似地，存在困扰猫的许多 猫病毒，包括猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)、猫冠 状病毒(FCoV)和猫鼻气管炎(FVR)病毒。
[0006] 还存在大量可以感染牛的病毒。此类病毒包括牛病毒性腹泻病毒1型和2型(BVDV1 和BVDV2)、感染性牛鼻气管炎（IBR)病毒、副流感3型(PI3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和牛 呼吸道冠状病毒（BRCV)。此外，存在许多也可以感染牛的细菌，包括多杀性巴氏杆菌 (Pasteurella multocida)、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica)、睡眠嗜组织菌 (Histophilus somni)和牛支原体(Mycoplasma bovis)。
[0007] 类似地，存在大量可以感染家禽的病毒。此类病毒包括感染性支气管炎病毒 (IBV)、感染性法氏囊病病毒（IBDV)、鸡新城疫病毒(NDV)、感染性喉气管炎（ILTV)、马立克 氏病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)(其也被称为MDV3)和禽类偏肺病毒(aMPV)。此外，存在 许多也可以感染家禽的细菌，包括多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、沙门氏菌属 (Salmonella ssp ·)、大肠杆菌、支原体属（Mycoplasma ssp· )、paragallinararum禽杆菌 (Avibacter ium paragal 1 inararum)、丹毒菌属（Ery s ipe las ssp·)、弯曲杆菌属 (Campylobacter ssp·)、弧菌属（Vi brio ssp.)、产气荚膜梭状芽抱杆菌（Clostridium perfr ingens)和寄生虫诸如艾美球虫。
[0008] 而且，存在许多可以感染猪的病毒。此类病毒包括猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRS)、猪圆环病毒(PCV)、传染性胃肠炎病毒(TGE)、猪伪狂犬病病毒(PPRV)、猪细小病毒 (PPV)、猪流感病毒(SIV)、猪轮状病毒(PRV)和猪流行性腹泻病毒(PED)。此外，存在许多也 可以感染猪的细菌，包括多种血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、沙门氏 菌属(Salmonella ssp.)、多种菌毛(pillus)类型的大肠杆菌、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis)、支原体属(Mycoplasma ssp ·)、支 气管炎博德特氏菌(Bordete 11a bronchiseptica)、丹毒菌属(Erysipelas ssp ·)、弯曲杆 菌属（Campylobacter ssp ·)、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumonia)、产 气荚膜梭状芽孢杆菌（Cl os tr id ium perfr ingens)和艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile)〇
[0009] 目前广泛接受的是，预防由于动物中的病毒感染的疾病的最佳方法是针对这些病 毒接种该动物。仅作为一个实例，在狗中，犬瘟热病毒疫苗已显著降低相应疾病的流行率。 类似地，传染性犬肝炎已被犬腺病毒-2疫苗(CAV2)极大限制。在疫苗中使用活的减毒CAV2 代替紧密相关的CAV1消除了关于以下的担忧，即在已用活的减毒CAV1接种的犬中观察到的 间质性肾炎和角膜混浊[Taguchi等人，Can Vet J. 52(9) :983-986(2011)]。此外，可以安 全地施用多价活的减毒病毒疫苗，其限制需要的疫苗注射次数。因此，存在几种商购可得的 多价活的减毒犬病毒疫苗，其防御犬瘟热、传染性犬肝炎、犬细小病毒和犬副流感病毒。此 外，更新的多价疫苗还进一步防御犬流感病毒。然而，仍然非常需要可以在室温下运输和储 存的减毒活病毒疫苗，诸如犬病毒疫苗。
[0010] 本文任何参考文献的引用不应解释为承认此参考文献可用作本申请的"现有技 术"。
[0011] 发明概述 为了克服现有疫苗的缺陷，本发明提供可以在室温下运输和/或储存的活的减毒疫苗 (例如病毒疫苗）的新型稳定的干燥制剂，以及其相应的免疫原性组合物。这些干燥制剂在 27 °C下持续长时间诸如12个月、18个月或甚至更长(例如，1.5至3年)保持有效。
[0012] 在某些实施方案中，活的减毒疫苗是禽类疫苗。在这种类型的具体实施方案中，活 的减毒禽类疫苗是包含活的减毒家禽病毒的家禽疫苗。在这种类型的更具体实施方案中， 活的减毒家禽疫苗是包含活的减毒鸡病毒的鸡疫苗。在这种类型的替代实施方案中，活的 减毒家禽疫苗是包含活的减毒火鸡病毒的火鸡疫苗。
[0013] 在某些实施方案中，活的减毒疫苗是哺乳动物疫苗。在这种类型的具体实施方案 中，活的减毒哺乳动物疫苗是包含活的减毒人病毒的人疫苗。在其它此类实施方案中，活的 减毒哺乳动物疫苗是包含活的减毒牛病毒的牛疫苗。在还有其它实施方案中，活的减毒哺 乳动物疫苗是包含活的减毒猪病毒的猪疫苗。
[0014] 在还有其它实施方案中，活的减毒哺乳动物疫苗是伴侣动物疫苗。在这种类型的 具体实施方案中，活的减毒伴侣动物疫苗是犬疫苗。在这种类型的其它实施方案中，活的减 毒伴侣动物疫苗是猫疫苗。在还有其它实施方案中，活的减毒伴侣动物疫苗是马疫苗。因 此，在具体实施方案中，活的减毒犬疫苗包含活的减毒犬病毒。在其它实施方案中，活的减 毒猫疫苗包含活的减毒猫病毒。在还有其它实施方案中，活的减毒马疫苗包含活的减毒马 病毒。
[0015] 在其它实施方案中，活的减毒疫苗包含重组病毒。在这种类型的具体实施方案中， 重组病毒被用作编码异源蛋白的重组载体。在这种类型的更具体实施方案中，异源蛋白是 病毒或细菌抗原。本发明进一步提供制备本发明的稳定的干燥制剂的方法。本发明进一步 提供将本发明的疫苗在使用前在27°C下作为稳定的干燥制剂储存长时间诸如12个月或更 长(例如，1.5至3年)的方法。
[0016] 本发明还提供向动物施用本发明的稳定的干燥制剂的方法。在具体实施方案中， 稳定的干燥制剂在施用前重构为液体疫苗。本发明进一步提供通过施用本发明的干燥制剂 (例如，以粉末的形式)和/或重构的液体疫苗而预防动物（即，人、伴侣动物或家畜动物）中 的疾病的方法。在具体实施方案中，伴侣动物是犬。在相关实施方案中，伴侣动物是猫。在还 有其它实施方案中，伴侣动物是马。在还有其它实施方案中，家畜动物是牛。在还有其它实 施方案中，家畜动物是猪。在还有其它实施方案中，家畜动物是鸡。在还有其它实施方案中， 家畜动物是火鸡。
[0017] 因此，本发明提供室温稳定的疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒病毒。在具体实施 方案中，疫苗的干燥制剂包含糖稳定剂。在这种类型的相关实施方案中，所述疫苗包含15% 至80% (w/w)糖稳定剂。在具体实施方案中，所述疫苗的干燥制剂包含30%至80% (w/w)糖 稳定剂。在其它具体实施方案中，所述疫苗包含40%至80% (w/w)糖稳定剂。在某些实施方案 中，所述疫苗包含25%至50% (w/w)糖稳定剂。在相关实施方案中，所述疫苗包含30%至70% (w/w)糖稳定剂。在甚至更具体实施方案中，所述疫苗包含40%至60% (w/w)糖稳定剂。
[0018] 在某些实施方案中，所述糖稳定剂是非还原性寡糖。在这种类型的具体实施方案 中，所述非还原性寡糖是蔗糖。在还有其它实施方案中，所述非还原性寡糖是海藻糖。在还 有其它实施方案中，所述非还原性寡糖是棉子糖。在其它实施方案中，所述糖稳定剂是糖 醇。在这种类型的具体实施方案中，所述糖醇是山梨糖醇。在其它实施方案中，所述糖醇是 木糖醇。在还有其它实施方案中，所述糖醇是麦芽糖醇。
[0019] 在替代实施方案中，所述糖稳定剂实际上是两种或更多种糖稳定剂的组合。在这 种类型的具体实施方案中，所述糖稳定剂是蔗糖和山梨糖醇的组合。在某些实施方案中，所 述糖稳定剂是蔗糖和海藻糖的组合。在还有其它实施方案中，所述糖稳定剂是海藻糖和山 梨醇的组合。在还有其它实施方案中，所述糖稳定剂是蔗糖、海藻糖和山梨糖醇的组合。
[0020] 本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以进一步包含一种或多种填充稳定剂 (bulking stablizer)。在具体实施方案中，所述疫苗中的填充稳定剂的量在疫苗的液体形 式中为1%至6% (w/v)，且在干燥制剂中为2%至25% (w/w)。在某些实施方案中，所述填充 稳定剂是甘露糖醇。在相关实施方案中，所述填充稳定剂是甘氨酸。在具体实施方案中，所 述填充稳定剂是葡聚糖。在某些实施方案中，所述填充稳定剂是麦芽糖糊精。在具体实施方 案中，所述填充稳定剂是右旋糖。在其它实施方案中，所述填充稳定剂是聚乙烯吡咯烷酮。 在还有其它实施方案中，所述填充稳定剂是羟乙基淀粉。在还有其它实施方案中，所述疫苗 包含填充稳定剂的组合。在某些实施方案中，所述填充稳定剂包含以下中的两种或更多种： 葡聚糖、甘露糖醇、甘氨酸、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基淀粉。在这种类型的具体 实施方案中，所述填充稳定剂包含甘露糖醇和甘氨酸。在相关实施方案中，所述填充稳定剂 包含葡聚糖和甘氨酸。在这种类型的还有其它实施方案中，所述填充稳定剂包含甘露糖醇、 葡聚糖和甘氨酸。
[0021] 在具体实施方案中，所述蛋白稳定剂是明胶。在其它实施方案中，所述蛋白稳定剂 是全酪蛋白的水解产物。在具体实施方案中，所述全酪蛋白的水解产物是全酪蛋白的蛋白 水解水解产物。在还有其它实施方案中，所述蛋白稳定剂是明胶和全酪蛋白的蛋白水解水 解产物两者的组合。
[0022] 本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂pH范围可以为pH 5.5至pH 8.5。在具体实施 方案中，pH范围为pH 6.0至pH 8.0。在某些实施方案中，pH范围为pH 6.5至pH 7.8。在具体 实施方案中，pH范围为pH 6.8至pH 7.5。在其它实施方案中，pH范围为pH 6.0至pH 7.6。在 还有其它实施方案中，pH范围为pH 6.0至pH 6.8。在还有其它具体实施方案中，pH范围为pH 7.0至pH 7.4。在更具体实施方案中，pH为7.2。在其它更具体实施方案中，pH为6.5。
[0023 ]本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包含缓冲剂。在这种类型的具体实施方 案中，所述缓冲剂包含0.1%至2% (w/w)组氨酸(干燥前为2.5至50 mM)。在相关实施方案中， 所述缓冲剂包含0.2%至1% (w/w)组氨酸。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.25%至 0.75% (w/w)组氨酸。在更具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.5% (w/w)组氨酸。
[0024]在其它实施方案中，所述缓冲剂包含0.1%至2% (w/w)磷酸盐(或磷酸钠、磷酸钾或 两者的混合物；在干燥前为2.5至50 mM)。在相关实施方案中，所述缓冲剂包含0.2%至1% (w/w)磷酸盐。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.25%至0.75% (w/w)磷酸盐。在更具体 实施方案中，所述缓冲剂包含0.5% (w/w)磷酸盐。
[0025]在还有其它实施方案中，所述缓冲剂可以包含2.5至50 mM Tris。在具体实施方案 中，所述缓冲剂包含2.5至50 mM Tris和2.5至50 mM组氨酸。在更具体实施方案中，所述缓 冲剂包含5至20 mM Tris和5至20 mM组氨酸。在又更具体实施方案中，所述缓冲剂包含7.5 至15 mM Tris和7.5至15 mM组氛酸。
[0026] 本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂也可以包含氨基酸稳定剂。在具体实施方案 中，所述氨基酸稳定剂是精氨酸。在还有其它实施方案中，所述氨基酸稳定剂是谷氨酸。在 还有其它实施方案中，所述氨基酸稳定剂是天冬氨酸。在还有其它实施方案中，所述氨基酸 稳定剂是赖氨酸。在相关实施方案中，本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂包含两种或更 多种氨基酸稳定剂。在这种类型的具体实施方案中，所述氨基酸稳定剂是精氨酸和谷氨酸 盐。
[0027] 在某些实施方案中，所述疫苗中的氨基酸稳定剂的浓度在液体制剂中为0.1-0.4 Μ[在干燥制剂中为10%_40% (w/w)]。在具体实施方案中，所述疫苗中的氨基酸稳定剂的浓 度在液体制剂中为〇. 25-0.35 M。在更具体实施方案中，所述疫苗中的氨基酸稳定剂的浓度 在液体制剂中为〇. 25-0.35 M。在甚至更具体实施方案中，所述氨基酸稳定剂在液体制剂中 为0.3 Μ精氨酸。
[0028] 本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂也可以包含蛋白稳定剂。所述蛋白稳定剂可 以是完整蛋白和/或蛋白水解产物。在具体实施方案中，所述稳定剂蛋白是明胶。在替代实 施方案中，所述蛋白稳定剂是全酪蛋白的水解产物。在某些实施方案中，所述全酪蛋白的水 解产物是全酪蛋白的蛋白水解水解产物。在具体实施方案中，所述干燥制剂包含2%至20% (w / w)的蛋白稳定剂。在其它具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含1 %至10 % (w / w)明胶。在 还有其它具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含1%至10% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。
[0029] 本发明的疫苗的干燥制剂也可以包含蛋白稳定剂，所述蛋白稳定剂包括明胶和全 酪蛋白的水解产物两者。在这种类型的具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含1%至10% (w/ w)明胶和1%至10% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。在更具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包 含2%至5