和CAV2在较低pH (6.5) 具有更高的稳定性，而CPV在中性至较高pH(7.6)具有更高的稳定性。与所测试的其它两种 缓冲剂相比，CDV和CPI在KP04或组氨酸中更稳定，而CAV2和CPV的稳定性似乎不那么依赖于 所用的缓冲剂。
[0142] 研究糖浓度和组合对病毒的稳定性的影响，如表9a和9b中所示。糖浓度列于表9a 中，且在45°C和37°C下病毒在这些制剂中的稳定性列于表9b中。在本研究中，所有制剂都具 有相同的病毒散装抗原投入量，且将这些制剂中的病毒冷冻干燥为珠粒。相对稳定性排序 基于不同制剂中各病毒在45°C和37°C下和在多个时间点的稳定性数据。表9a和9b中的数据 表明，CDV、CPI和CAV2的稳定性对糖浓度具有强依赖性，其中病毒在4-30%范围内的较高浓 度糖下具有更高的稳定性。该数据还表明，蔗糖和海藻糖(Sue +TrH)的组合似乎比单独的 蔗糖或海藻糖表现更好。
[0143] 还研究L-精氨酸浓度对病毒的稳定性的影响（表10)。制剂SPO2B、SP26和SP27的差 异仅在于L-精氨酸盐酸盐的浓度。[对于一些数据点，数据由于测定无效(n/a)而不可用]。 基于在45 °C和37 °C下获得的数据，CDV、CPI和CAV2的稳定性似乎取决于精氨酸浓度，其中精 氨酸的较高浓度是更稳定的(表10)。
[0144] 进一步研究不同的精氨酸盐或精氨酸以及谷氨酸的浓度的影响(表11a和lib)。表 11a显示各制剂中的精氨酸的浓度和盐和谷氨酸的浓度和干燥疫苗的相应的起始Tg。所有 制剂都是相同的，除了精氨酸和谷氨酸的上述差异。用不同的酸将L-精氨酸调节至pH 7.2 以产生不同的精氨酸盐。起始Tg是制剂中的冷冻干燥的疫苗珠粒的起始玻璃转换温度。起 始Tg通过差示扫描量热法测定，且是至少3个重复的平均值。表11a中列出的制剂在45°C和 37°C下的稳定性数据显示于表lib中。还将相对稳定性排序且列于表lib中。如表11a和lib 中所示，不同的L-精氨酸盐可具有不同的稳定性影响。尽管制剂SP33中的精氨酸磷酸盐提 供高得多的Tg，所有3种病毒的稳定性相对于其它精氨酸盐降低。与SP10中发现的所有三种 病毒的稳定性相比，在制剂SP35中组合0.15M精氨酸氯化物与0.15M-元谷氨酸钠略微改善 所有三种病毒的稳定性。
[0145] 依克多因和羟基依克多因是嗜盐微生物中发现的天然化合物。两者都是相容性溶 质，其通过充当渗压剂而充当保护性物质，且因此帮助生物体在极端渗透胁迫后存活，赋予 对盐和温度胁迫的抗性。依克多因和羟基依克多因两者已显示是蛋白以及许多其它生物品 的有效稳定剂。因此，测试它们对CDV、CPI和CAV2的稳定性的稳定化效果。制剂SP39和SP40 与制剂SP10是相同的，除了此外它们分别含有依克多因或羟基依克多因（表13)。在三种储 存温度下的稳定性数据用于评估其稳定化效果。使用相同的干燥循环在珠粒中冷冻干燥含 有这3种病毒级分的疫苗共混物。
[0146] 稳定性排序基于来自3种温度(在45°C、37°C和27°C下）的稳定性数据。表13中的稳 定性数据和稳定性排序表明，依克多因和羟基依克多因两者可以改进CDV和CPI在37°C和27 °C下的稳定性，尽管在45°C下的稳定化效果不是那么显著。依克多因和羟基依克多因对 CAV2的稳定化作用由于其低降解曲线而难以测定。
[0147] 实施例5 冷冻干燥的CPV的稳定性结果 也已经评估单价CPV在不同制剂中的稳定性。尽管CPV可以与其它三种犬病毒一起包括 于活性的室温稳定的制剂中，例如，SPCPV-02和SPCPV-03制剂可以提供所测试的四种不同 的犬病毒的CPV在27 °C下的约18个月的保质期，CPV就其最佳室温稳定性而言最不同。
[0148] 因此，CPV与CDV、CP I或CAV2相比具有不同的针对糖的偏好，例如，与还原糖相比， 对于糖醇诸如山梨糖醇更稳定。然而，甚至在山梨糖醇存在的情况下，冷冻干燥的珠粒或块 饼的物理稳定性有时导致干燥珠粒在储存过程中的收缩或塌陷。因此，在制剂筛选过程中 监测效价的稳定性和干燥的CPV制剂的物理稳定性两者。值得注意的是，单价CPV疫苗制剂 的筛选证明是实现疫苗产品的模型研究，其平衡病毒效价稳定性与干燥产物物理稳定性。
[0149] 表14显示五种不同的制剂中CPV在45 °C、37 °C和27 °C下的稳定性数据。将单价CPV 共混入这些制剂中，然后冷冻干燥为100uL大小珠粒。本研究中的所有制剂含有10mM KP04 (pH 7.2)作为缓冲剂，和2%葡聚糖70k和2 %甘氨酸作为填充稳定剂。各制剂的山梨糖醇浓 度(w/v)显示于表中。所有制剂还含有稳定蛋白"GN"（明胶和NZ-胺）。1 xGN是：0.8%明胶和 1.0%似胺;而2.516~是:2.5%明胶和2.5%似胺。效价稳定性排序基于在45°(：、37°(：和27 1€ 下的病毒滴度变化。
[0150]物理稳定性排序基于冷冻干燥之后和稳定性研究过程中的冷冻干燥珠粒的玻璃 转换温度(Tg)和物理结构外观。较高Tg和更强的维持珠粒的物理结构的趋势得到物理稳定 性的更高得分。
[0151 ]表14中的稳定性数据表明，山梨糖醇的较高浓度有益于CPV效价稳定性，但减轻疫 苗物理稳定性;而较高的蛋白浓度对于物理稳定性是有益的。此外，包括L-精氨酸对CPV稳 定性没有负面影响。
[0152 ]在表15中概述的研究中进一步评估葡聚糖和不同浓度的山梨糖醇的效果。表15中 的所有制剂都含有2%甘氨酸、2.5%明胶、2.5%NZ胺和10mM KP04缓冲剂(pH 7.2)。此外， 所有制剂都含有山梨糖醇和葡聚糖70k。将单价CPV共混入这些制剂中，然后冷冻干燥为 100uL大小珠粒。将这些制剂的效价和物理稳定性与表15的研究中类似地排序。表15中的数 据表明，较高浓度的葡聚糖70k有益于冷冻干燥的CPV珠粒物理稳定性，但损害效价稳定性 (6%)。同时，较高浓度的山梨糖醇对于效价稳定性是有益的，但需要中等浓度的葡聚糖70k 来维持其结构。本研究中的数据表明，山梨糖醇和葡聚糖70k的最佳组合对于具有高效价和 高物理稳定性两者的最佳冷冻干燥的CPV疫苗是需要的。
[0153] 实施例6 不同的干燥形式对病毒稳定性的影响 为了研究以不同形式干燥的疫苗是否具有不同的稳定性概况，将相同制剂中的病毒在 小瓶中干燥为块饼或在托盘中干燥为珠粒，然后比较它们的稳定性。表16显示SP02B中的珠 粒中和Π )?ν-03中的块饼中的CDV、CAV2和CPI的稳定性测试结果。（SP02B和roiv-〇3实际上 是相同的制剂）。如从表16可见，CDV、CPI和CAV2在小瓶中的稳定性与在小瓶中观察到的稳 定性是相当的（或略好）。本研究中的数据表明，珠粒中鉴定的最佳制剂也可用于在小瓶中 干燥为块饼的病毒疫苗。
N/A:不适用。
[0155] 表5 用于小瓶中的疫苗的冷冻干燥循环
N/A:不适用。
[0156] 塾 不同制剂中的⑶V、CPI、CAV2和CPV在27 °C的估计保质期
[0157] 表7 使用45°C加速稳定性测试鉴定的几种领先制剂
[0158] 表8 缓冲剂和pH对病毒稳定性的影响
[0159]表9a 表用的共混物制剂的非还原性寡糖含量和总非还原性寡糖
[0160] 表9b 糖浓度对冷冻干燥的CDV、CP I和CAV2的稳定性的影响
n/a:数据不可用。
[0161] 表 10 共混物中的L-精氨酸浓度对病毒稳定性的影响
n/a:数据不可用。
[0162] 表11a 与不同的精氨酸盐以及与谷氨酸组合冷冻干燥的珠粒的起始Tg
[0163] 表lib 不同的精氨酸盐和谷氨酸对CDV、CAV2和CPI稳定性的影响
[0164] 表12 甘露糖醇和甘氨酸作为用于4路疫苗的稳定剂的影响
? D0是冻干之后的病毒的滴度，且w2是在45 °C储存2周之后的病毒滴度。 ?制剂ΙΒ1-02、ΙΒ1-06和IB1-10之间的差异是填充稳定剂。 IB1-02含有4%甘露糖醇，181-06含有2%甘氨酸，然而，181-10不含任何填充稳定剂。
[0165] 表13 依克多因和羟基依克多因对病毒稳定性的影响
【主权项】
1. 疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒病毒、30%至80% (w/w)的非还原性寡糖、5%至40% (w/w)的氨基酸稳定剂、2%至20% (w/w)的蛋白稳定剂和具有6.0至8.0的pH的缓冲剂。2. 权利要求1的干燥制剂，其进一步包含2%至25% (w/w)的填充稳定剂，且其中所述填 充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为〇. 05至0.40。3. 权利要求1或2的干燥制剂，其中所述活的减毒病毒是选自犬瘟热病毒、腺病毒、副流 感病毒、编码和表达异源抗原的重组病毒载体及其任何组合的活的减毒病毒。4. 权利要求3的干燥制剂，其中所述活的减毒病毒是选自犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2 型(CAV2)、犬副流感病毒(CPI)和编码和表达异源抗原的重组犬副流感病毒载体(rCPI)及 其任何组合的活的减毒犬病毒。5. 权利要求4的干燥制剂，其进一步包含犬细小病毒(CPV)和2%至5% (w/w)山梨糖醇。6. 权利要求3的干燥制剂，其进一步包含细小病毒(CPV)和2%至5% (w/w)山梨糖醇。7. 权利要求1至6的干燥制剂，其中所述非还原性寡糖选自鹿糖、海藻糖、棉子糖及其任 何组合;且其中pH为6.2至7.5。8. 权利要求1至7的干燥制剂，其中所述填充稳定剂是甘露糖醇。9. 权利要求1至8的干燥制剂，其中所述氨基酸稳定剂是精氨酸。10. 权利要求9的干燥制剂，其中所述氨基酸稳定剂进一步包含谷氨酸盐。11. 权利要求1至10的干燥制剂，其进一步包含0.02%至1% (w/w)的二价阳离子的盐，所 述二价阳离子选自Mg++、Ca++和Zn ++。12. 权利要求1至11的干燥制剂，其在被干燥之前，所述疫苗已经通过选自以下的方法 处理:将其应用于膜，将其冷冻为珠粒，将其在小瓶中冷冻，喷雾干燥，喷雾冷冻干燥，和将 其诱导以起泡。13. 权利要求1至12的干燥制剂，其中所述蛋白稳定剂选自明胶、全酪蛋白的蛋白水解 水解产物及其组合。14. 权利要求1至13的干燥制剂，其中所述非还原性寡糖是20%至80% (w/w)鹿糖和18% 至66% (w/w)海藻糖的组合;所述填充稳定剂是5%至17% (w/w)甘露糖醇;所述氨基酸稳定 剂是9%至34% (w/w);其中所述蛋白稳定剂包含2%至5% (w/w)明胶和2%至6% (w/w)的全酪 蛋白的蛋白水解水解产物;且其中所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.08至 0.37〇15. 权利要求14的干燥制剂，其中所述非还原性寡糖是45%至60% (w/w)鹿糖和15%至 25% (w/w)海藻糖的组合;所述填充稳定剂是5%至17% (w/w)甘露糖醇;所述氨基酸稳定剂 是10%至25% (w/w)精氨酸;且其中所述蛋白稳定剂包含1.5%至3.5% (w/w)明胶和2%至4% (w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物。16. 针对选自犬瘟热病毒、腺病毒、副流感病毒和细小病毒的病毒接种动物的方法，其 包括将权利要求1至15的干燥制剂与药学上可接受的载体混合以形成液体疫苗，然后将所 述液体疫苗施用于犬。17. 针对选自犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2型（CAV2)、犬副流感病毒(CPI)和犬细小病 毒(CPV)的犬病毒接种犬的方法，其包括将权利要求1至15的干燥制剂与药学上可接受的载 体混合以形成液体疫苗，然后将所述液体疫苗施用于犬。18. 制备室温稳定的疫苗的干燥制剂的方法，其包括： a. 通过组合治疗有效量的活的减毒犬病毒与8%至30% (w/v)的非还原性寡糖、1%至6% (w/v)的填充稳定剂、0.1M至0.5 Μ的氨基酸稳定剂、0.9%至10% (w/v)的蛋白稳定剂和具有 6.0至8.0的pH的缓冲剂而制备疫苗制剂;其中所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率 为0.05至0.40;且 b. 在真空下干燥步骤a.的疫苗制剂以制备室温稳定的干燥制剂。19. 权利要求18的制备干燥制剂的方法，其中所述制备包括组合治疗有效量的活的减 毒犬病毒与所述非还原性寡糖，所述非还原性寡糖是5%至18% (w/v)的鹿糖和5%至18% (w/ v)海藻糖、2%至4% (w/v)的填充稳定剂、0· 1M至0.3M的氨基酸稳定剂、：L5%至6% (w/v)的蛋 白稳定剂的组合;且其中所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为〇. 08至0.37。20. 权利要求18或19的制备干燥制剂的方法，其进一步包含包括选自依克多因、羟基依 克多因或其组合的渗压剂。21. 权利要求18至20的制备干燥制剂的方法，其中所述活的减毒犬病毒选自犬瘟热病 毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒及其任何组合。22. 权利要求18至21的制备干燥制剂的方法，其进一步包括犬细小病毒和0.5%至5% (w/v)山梨糖醇。23. 权利要求18至22的制备干燥制剂的方法，其中所述填充稳定剂是甘露糖醇。24. 权利要求18至23的制备干燥制剂的方法，其中所述氨基酸稳定剂是精氨酸或精氨 酸和谷氨酸盐的组合。25. 权利要求18至24的制备干燥制剂的方法，其中在干燥之前，所述疫苗制剂通过选自 以下的程序处理:将其应用于膜，将其冷冻为珠粒，将其在小瓶中冷冻，喷雾干燥，喷雾冷冻 干燥，和将其诱导以起泡。 2 6.疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒细小病毒、10 %至8 0 % (w / w)的糖醇、10 %至7 0 % (w/w)的填充稳定剂、4%至50% (w/w)的蛋白稳定剂和具有6.8至8.0的pH的缓冲剂。27. 权利要求26的疫苗的干燥制剂，其中所述活的减毒细小病毒是活的减毒犬细小病 毒(CPV)〇28. 权利要求26或27的干燥制剂，其中所述糖醇选自山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麦芽 糖醇及其组合，其中所述填充稳定剂选自葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀 粉、甘氨酸、甘露糖醇或其组合，其中所述蛋白稳定剂选自明胶、全酪蛋白的蛋白水解水解 产物或其组合。29. 权利要求28的干燥制剂，其中所述糖醇是山梨糖醇，所述填充稳定剂是葡聚糖和甘 氨酸的组合，且所述蛋白稳定剂是明胶和全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合。30. 权利要求26至29的干燥制剂，其中所述CPV选自CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c和包 含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组CPV。31. 权利要求30的干燥制剂，其中所述CPV-2c具有ATCC登记号PTA-13492。32. 权利要求1至15和26至31的干燥制剂，其进一步包含选自依克多因、羟基依克多因 或其组合的渗压剂。33. 疫苗，其包含权利要求1至15的干燥制剂与权利要求26至32的干燥制剂和液体药学 上可接受的载体的组合。34. 针对选自选自犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬细小病毒及其任何组合 的犬病毒接种犬的方法，其包括将权利要求1至15的干燥制剂与权利要求26至32的干燥制 剂和药学上可接受的载体混合以形成液体疫苗，然后将所述液体疫苗施用于所述犬。
【专利摘要】本发明公开了包含活的减毒病毒、糖稳定剂和氨基酸稳定剂的室温稳定的疫苗的干燥制剂。本发明还公开了此类疫苗的制造和通过施用此类疫苗保护动物的方法。PTA-1349220130124
【IPC分类】A61K39/29
【公开号】CN105636610
【申请号】CN201480052614
【发明人】乔志松, K.奥康内尔
【申请人】英特维特国际股份有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年9月26日
【公告号】CA2923362A1, WO2015044337A2, WO2015044337A3