含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域,具体设及含化蛾胺结构的化合物的一种新用途,更具 体设及含化蛾胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒化bola Virus,EBOV)是传染病埃博拉出血热的病原体,该出血热于 1976年首次在扎伊尔发现,其高传染性的爆发流行和高致死性很快引起了世界各国研究人 员的注意。埃博拉病毒具有极强的感染性,可引起人类和其他灵长类动物高致死性的出血 热综合征。研究表明,埃博拉病毒的所有组分对疾病的发展都有一定的促进作用,尤其是埃 博拉病毒的囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)可与祀细胞发生吸附,进而进入祀细胞,在介导 病毒进入祀细胞过程中发挥重要作用。埃博拉病毒的囊膜糖蛋白被认为是决定埃博拉病毒 致病性一个重要因素,体外通过转染编码囊膜糖蛋白基因的质粒或腺病毒进入祀细胞,能 够导致祀细胞的脱落,表明埃博拉病毒的囊膜糖蛋白具有细胞毒性,但是其机理不详。因 此,抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白活性是抑制埃博拉病毒感染祀细胞的重要途径。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题如何制备抗埃博拉病毒感染药物。
[0004] 为解决上述问题,本发明首先提供了含化蛾胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒 感染药物中的应用。
[0005] 所述抗埃博拉病毒感染药物可为治疗型抗埃博拉病毒感染药物和/或预防型抗埃 博拉病毒感染药物。
[0006] 含化蛾胺结构的化合物在制备抑制埃博拉病毒侵染哺乳动物细胞的产品中的应 用也属于本发明的保护范围。
[0007] 所述哺乳动物细胞具体可为人细胞。所述哺乳动物细胞具体可为哺乳动物肝癌细 胞。所述哺乳动物细胞具体可为人肝癌细胞。所述人肝癌细胞具体可为HUH7细胞。
[000引含化蛾胺结构的化合物在制备抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的产品中的应用 也属于本发明的保护范围。
[0009] 上述应用中,所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可为al)或a2):
[0010] al)氨基酸序列是序列表序列2所不的蛋白质;
[0011] a2)将al)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 得到的与埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相关的蛋白质。
[0012] 上述任一所述的应用中,所述含化蛾胺结构的化合物可为式(I)所示化合物或式 (H)所示化合物;
[0014] 为解决上述问题,本发明还提供了一种产品。
[0015] 本发明所提供的产品,其活性成分为含化蛾胺结构的化合物;所述产品可为如下 bl)或 b2)或 b3):
[0016] bl)抗埃博拉病毒感染药物;
[0017] b2)抑制埃博拉病毒侵染哺乳动物细胞的产品;
[001引b3)抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的产品。
[0019] 上述产品中,所述抗埃博拉病毒感染药物可为治疗型抗埃博拉病毒感染药物和/ 或预防型抗埃博拉病毒感染药物。
[0020] 上述产品中,所述哺乳动物细胞具体可为人细胞。上述产品中,所述哺乳动物细胞 具体可为哺乳动物肝癌细胞。上述产品中,所述哺乳动物细胞具体可为人肝癌细胞。所述人 肝癌细胞具体可为HUH7细胞。
[0021] 上述产品中,所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可为al)或a2):
[0022] al)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白质;
[0023] a2)将al)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 得到的与埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相关的蛋白质。
[0024] 上述任一所述产品中,所述含化蛾胺结构的化合物可为式(I)所示化合物或式 (H)所示化合物;
[00%] 上述任一所述埃博拉病毒可为扎伊尔亚型,具体为H. sapiens wt/GIN/2014/ Gueckedou-COTO
[0027]由于高致病性和传染性,本发明中所述埃博拉病毒可用埃博拉假病毒代替,所述 埃博拉假病毒的制备方法可如下:
[002引 1、向质粒pcDNA?4/HisMax的限制性内切酶BamH巧肋hoi的识别序列之间插入核巧 酸序列是序列表中的序列1所示的双链DNA分子,得到重组质粒PCDNA4-EB0V-GP。
[00巧]2、将重组质粒PCDNA4-EB0V-GP和pNL4.3-Luc-R-E-载体质粒共转染皿K 293T细 胞,置于37°C、5%C02培养箱解育化,用PBS缓冲液冲洗2次,然后加入DMEM培养基,置于37 °C、5 % C〇2培养箱继续解育48h,收集细胞上清。
[0030] 3、取步骤2收集的细胞上清,300化pm离屯、lOmin,收集上清液并用0.22皿微孔滤膜 过滤,收集过滤后的液体。
[0031] 4、取步骤3过滤后的液体,30000巧m离屯、2 .化,获得的沉淀用ImL DMEM培养基溶 解,得到所述埃博拉假病毒的病毒液。
[0032] 序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白为埃博拉病毒的扎伊尔亚型的 H. sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07的囊膜糖蛋白。因此,含[I比蛾胺结构的化合物具有 抑制具有序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的假病毒的侵染能力,应该也具 有抑制扎伊尔亚型的埃博拉病毒的侵染能力。扎伊尔亚型的埃博拉病毒具体可为 H.sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07。
[0033] 实验证明,本发明提供的含化蛾胺结构的化合物在埃博拉假病毒感染前或感染后 对埃博拉假病毒的感染均具有抑制作用。因此,本发明提供的含化蛾胺结构的化合物可抑 制埃博拉病毒感染祀细胞,在制备抗埃博拉病毒感染药物中具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0034] 图1为埃博拉假病毒感染前给予化合物I对埃博拉假病毒感染册H7细胞的抑制作 用。
[0035] 图2为埃博拉假病毒感染前给予化合物n对埃博拉假病毒感染HUH7细胞的抑制作 用。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐 明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
[0037] 下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0039] 册H7细胞(人肝癌细胞)购自日本细胞库(Japanese Collection Of Research Bioresources,JCRB),编号为JCRB0403。胎牛血清为Sera Pro公司产品。DMEM培养基为 G;Lbco公司产品。二甲基亚讽为Amresco公司产品。Luciferase Cell Culture Lysis 5X Reagent为Promega公司产品,货号为E1531。皿K 293T细胞为中国普通微生物保藏管理中屯、 (简称CGMCC)产品,产品目录号为8.00020。质粒pcDNA?4/HisMax为Life technologies公司 产品,货号为V8642(LPBS缓冲液为BioTopped公司产品,货号为top0027eLuciferase Assay System IO-Pack为Promega公司产品,货号为E1501。
[0040] ZMapp 2G4单克隆抗体的制备方法参考如下文献:Q Xiangguo,W Gary, et al.Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp.NaUire.2014,514(10):47-61.
[0041 ] p化4.3-Luc-R-E-载体质粒购自BioVecto;r中国质粒载体菌株细胞基因保藏中屯、-NTCC国家典型培养物保藏中屯、(网址为hUp: //www.biovector.net/),货号为3767994。
[0042] 实施例1、埃博拉假病毒稀释液的制备方法
[0043] 由于埃博拉病毒的高致病性和传染性,埃博拉假病毒能够代替活病毒的部分研 究。本发明中使用的埃博拉假病毒的制备方法如下:
[0044] 1、向质粒pcDNA?4/HisMax的限制性内切酶BamHI和化Ol的识别序列之间插入核巧 酸序列是序列表中的序列1所示的双链DNA分子,得到重组质粒PCDNA4-邸0V-GP。重组质粒 PCDNA4-EB0V-GP表达序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP), W下简称GP蛋白。
[0045] 2、将步骤1构建的重组质粒PCDNA4-邸OV-GP和pNL4.3-Luc-R-E-载体质粒共转染 皿K 293T细胞(每1 X IO6个皿K 293T细胞约转染IOiig重组质粒PCDNA4-EB0V-GP和IOiig P化4.3-Luc-R-E-载体质粒),置于37 °C、5 % C〇2培养箱解育化,用PBS缓冲液冲洗2次,然后 加入DMEM培养基,置于37°C、5 % C〇2培养箱继续解育48h,收集细胞上清。
[0046] 3、取步骤2收集的细胞上清,300化pm离屯、lOmin,收集上清液并用0.22皿微孔滤膜 过滤,收集过滤后的液体。
[0047] 4、取步骤3过滤后的液体,30000巧m离屯、2 .化,获得的沉淀用ImL DMEM培养基溶 解,得到埃博拉假病毒的病毒液。该埃博拉假病毒的病毒液可表达GP蛋白。
[0048] 取埃博拉假病毒的病毒液,用DMM培养基稀释至35倍体积,得到埃博拉假病毒稀 释液。
[0049] 实施例2、制备化合物I和化合物n
[0051] 按照文献(Song H,Liu Y et al . Desi即,synthes is,and insecticidal activity of novel pyrazole derivatives containinga-hydroxymethyl-N-benzy