l carboxamide，a-chIoromethyI-N-benzyI carboxamide，and 4，5-dihydrooxazole moieties[J].J.Agric.Food Chem.2012,60，1470-9?和Song H，Liu Y et al.Design， synthesis,and insecticidal evaluation of new pyrazole derivatives containing imine，oxime ether,oxime ester,and dihydroisoxazoline groups based on the inhibitor binding pocket of respiratory complex I.J.Agric.Food Chem.2013，61， 8730-6)中记载的方法制备化合物I和化合物n D化合物I的结构式如式（I)所示，其在文献 中的名称为tebufenpyrad。化合物n的结构式如式（n )所示，其在文献中的名称为Ethyl 2-(4-(tert-Butyl)phenyl)-2-〇x〇3cetete。
[0052] 实施例3、供试药抑制埃博拉假病毒感染HUH7细胞
[0053] 采用化合物I或化合物n作为供试药，进行如下实验：
[0054] -、埃博拉假病毒感染前给药对埃博拉假病毒的抑制效应
[0055] 设置试验组，进行=次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
[0056] 1、用膜蛋白酶消化HUH7细胞，然后用含10 % (体积比）胎牛血清的DMEM培养基重悬 并稀释，获得细胞密度为1 X IO5个/mL的细胞悬浮液。
[0057] 2、用二甲基亚讽(DMSO)溶解供试药，获得供试药溶液。
[005引3、取96孔板，每孔接种I(K)化步骤1获得的细胞悬浮液，然后置于37°C、5%C02的培 养箱中培养12h。
[0059] 4、完成步骤3后，取所述96孔板，弃上清，每孔加入DMEM培养基10化L，再加入步骤2 制备的供试药溶液，得到处理体系（当供试药为化合物I时，处理体系中的供试药的浓度为 29.95測、7.48祉M、1.872咖、0.46祉M或0.116咖；当供试药为化合物n时，处理体系中的供 试药的浓度为27.4祉M、6.87咖、1.71祉M、0.43咖或0.10祉M;每个浓度设置4个复孔），然后 置于37 °C、5 % C〇2的培养箱中培养30min。
[0060] 5、完成步骤4后，取所述96孔板，每孔加入10化L实施例1制备的埃博拉假病毒稀释 液，置于37°C、5 % C〇2的培养箱中解育化。
[OOW] 6、取所述96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入10化L PBS缓冲液洗涂一次;然后每 孔加入10化L含5 % (体积比）胎牛血清的DMEM培养基，37°C培养4她。
[0062] 7、取所述96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入10化L PBS缓冲液洗涂一次。
[0063] 8、完成步骤7后，取所述96孔板，每孔加入30化Luciferase Cell Culture Ly S i 巧 X Reagent，裂解 30min。
[0064] 9、完成步骤8后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay System 10-Pack，采用巧 光酶标仪检测巧光值。
[0065] 设置阴性对照组：用等体积二甲基亚讽代替供试药溶液，其它操作同试验组。设置 4个复孔。
[0066] 设置阳性对照组：用等体积ZMapp 2G4单克隆抗体代替供试药溶液，其它操作同试 验组。阳性对照组中ZMapp 2G4单克隆抗体的浓度为66.667iiM。设置4个复孔。
[0067] 根据下述公式计算不同浓度的供试药处理后HUH7细胞的抑制率：
[006引抑制率=(阴性对照组的检测巧光值-试验组的检测巧光值)/阴性对照组的检测 巧光值X 100%。
[0069] 化合物I对埃博拉假病毒的抑制率的实验结果见图UW供试药在处理体系中的浓 度W10为底的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标）。结果表明，随着化合物I在处理体系中的 浓度的增加，抑制率也增加。可见，埃博拉假病毒感染前给予化合物I可W抑制埃博拉假病 毒对HUH7细胞的侵染作用。
[0070] 化合物n对埃博拉假病毒的抑制率的实验结果见图2( W供试药在处理体系中的 浓度WiO为底的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标）。结果表明，随着化合物n在处理体系 中的浓度的增加，抑制率也增加。可见，埃博拉假病毒感染前给予化合物n可W抑制埃博拉 假病毒对HUH7细胞的侵染作用。
[0071 ]二、埃博拉假病毒感染后给药对埃博拉假病毒的抑制效应
[0072] 设置试验组，进行=次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
[0073] 1、用膜蛋白酶消化HUH7细胞，然后用含10 % (体积比）胎牛血清的DMEM培养基重悬 并稀释，获得细胞密度为1 X IO5个/cm2的细胞悬浮液。
[0074] 2、取96孔板，每孔接种I(K)化步骤1获得的细胞悬浮液，然后置于37°C、5%C02的培 养箱中培养12h。
[00巧]3、用二甲基亚讽(DMSO)溶解供试药，获得供试药溶液。
[0076] 4、另取一 96孔板，每孔加入10化L步骤一制备的埃博拉假病毒稀释液和步骤3制备 的供试药溶液，得到处理体系（当供试药为化合物I时，处理体系中的供试药的浓度为 14.975測、3.74化M、0.936測、0.234測或0.05祉M;当供试药为化合物n时，处理体系中的供 试药的浓度为13.740測、3.435iiM、0.859測、0.215測或0.05化M;每个浓度设置4个复孔），然 后置于37°C、5 % C〇2的培养箱中培养30min，得到混合液。
[0077] 5、取完成步骤2后的96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入10化L PBS缓冲液洗涂一 次;然后每孔加入100化步骤4制备的混合液，置于37°C、5 % C〇2的培养箱中培养化。
[007引6、完成步骤5后，取所述96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入10化L PBS缓冲液洗涂 一次，然后每孔加入10化L含5% (体积比）胎牛血清的DMEM培养基，37°C培养4她。
[OOW] 7、完成步骤6后，取所述96孔板，每孔加入30化Luciferase Cell Culture Ly S i 巧 X Reagent，裂解 30min。
[0080] 8、完成步骤7后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay System 10-Pack，采用巧 光酶标仪检测巧光值。
[0081] 设置阴性对照组：用等体积二甲基亚讽代替供试药溶液，其它操作同试验组。设置 4个复孔。
[0082] 设置阳性对照组：用等体积ZMapp 2G4单克隆抗体代替供试药溶液，其它操作同试 验组。阳性对照组中ZMapp 2G4单克隆抗体的浓度为66.667iiM。设置4个复孔。
[0083] 根据下述公式计算不同浓度的供试药处理后HUH7细胞的抑制率：
[0084] 抑制率=(阴性对照组的检测巧光值-试验组的检测巧光值)/阴性对照组的检测 巧光值X 100%。
[0085] 供试药对埃博拉假病毒的抑制率的实验结果见表1。结果表明，随着供试药在处理 体系中的浓度的增加，抑制率也增加。可见，供试药可W抑制埃博拉假病毒对HUH7细胞的侵 染作用。
[0086] 表1.供试药对埃博拉假病毒感染宿主细胞的抑制作用
【主权项】
1. 含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用。2. 含吡螨胺结构的化合物在制备抑制埃博拉病毒侵染哺乳动物细胞的产品中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述哺乳动物细胞为人肝癌细胞。4. 含吡螨胺结构的化合物在制备抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的活性的产品中的应 用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于:所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白为al)或a2): al)氣基酸序列是序列表序列2所不的蛋白质； a2)将al)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到 的与埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相关的蛋白质。6. 如权利要求1至5任一所述的应用，其特征在于:所述含吡螨胺结构的化合物为式（I) 所示化合物或式（Π )所示化合物；7. -种产品，其活性成分为含吡螨胺结构的化合物;所述产品为如下bl)或b2)或b3): bl)抗埃博拉病毒感染药物； b2)抑制埃博拉病毒侵染哺乳动物细胞的产品； b3)抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的活性的产品。8. 如权利要求7所述的产品，其特征在于：所述b2)中，所述哺乳动物细胞为人肝癌细 胞。9. 如权利要求7所述的产品，其特征在于:所述b3)中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白为 al)或a2): al)氣基酸序列是序列表序列2所不的蛋白质； a2)将al)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到 的与埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相关的蛋白质。10. 如权利要求7至9任一所述的产品，其特征在于： 所述含吡螨胺结构的化合物为式(I)所示化合物或式（Π )所示化合物；
【专利摘要】本发明公开了含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用。本发明所提供的含吡螨胺结构的化合物为式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅱ)所示化合物。实验证明，在埃博拉假病毒感染前后，本发明提供的含吡螨胺结构的化合物均可以抑制埃博拉假病毒对HUH7细胞的侵染作用。因此，含吡螨胺结构的化合物可抑制埃博拉病毒感染靶细胞，在制备抗埃博拉病毒感染药物中具有重要的应用价值。
【IPC分类】A61K31/415, A61P31/14
【公开号】CN105663123
【申请号】CN201610172558
【发明人】张立新, 汪清民, 高福, 马荣, 宋红健, 李燕, 代焕琴, 王兹稳, 宋福行, 刘玉秀
【申请人】中国科学院微生物研究所, 南开大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月24日