0.5μg/ml的TSG处理组；图6-c示lμg/ml的TSG处理组；图6-d示2μg/ml 的TSG处理组；图6-e示4μg/ml的TSG处理组
[0041 ] 图7示TSG对精子R0S水平的影响；其中，林示P〈0.01。
【具体实施方式】
[0042]本发明提供了 TSG的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数 实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它 们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人 员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与 组合，来实现和应用本发明技术。
[0043] 本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：
[0044] 精液取自吉林大学原种猪场杜洛克种公猪，每次采精时间在都在早上，采用了手 握法采精法。杜洛克新鲜精液，用Smeminark稀释液按1:1稀释，将精液稀释到1 X 106个/mL。 [0045] 猪精子稀释液(seminark)、二苯乙烯苷(TSG)、PBS、4%多聚甲醛、0.22%考马斯亮 蓝G-250、invitrgen公司的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L-7011)、NaCl、KCl、Na2HP〇4、 KH2PO4以及NaH2P〇4均购自Sigma公司；
[0046]甲醇及冰醇酸均购自国产分析纯；
[0047] 化丙啶(PI)、碧云天JC-1检测试剂盒、碧云天Flu〇-3AM试剂盒、碧云天活性氧检测 试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit)。
[0048] 可调式恒温水浴锅(DK-8D型，上海一恒科技有限公司）；
[0049] 热恒温培养箱(DHP-9272型，上海一恒科学仪器有限公司）；
[0050] -20°C冰箱（中国新飞公司）、4°C冰箱（中国新飞公司）；
[0051 ] -80 Γ超低温冰箱（日本SANYO公司）；
[0052] PB-10PH计（Sartorius)、BS 124S分析天平（Sartorius);
[0053] DHP-9272涡旋混合器(海门其林尔贝）；
[0054] 普通显微镜、4°C离心机(TGL-16gR);
[0055] 普通离心机(德国Thermo公司）；
[0056] 粘附载玻片(南通海伦生物医学器械制造有限公司）；
[0057] 高压蒸汽灭菌锅(长春百奥公司）；
[0058]精子质量检测分析仪(型号GK-9900A，徐州市广科新技术发展有限公司生产）。
[0059] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0060] 实施例1TSG对猪精子活力的影响
[00611 1)将TSG用PBS溶解，使TSG的储存浓度为lmg/ml，然后保存在-20°C的冰箱里，在使 用前将lmg/ml的PBS用猪精液稀释液稀释50倍后，使用时的工作浓度为0.5μg/ml、lμg/ml、4 μg/ml0
[0062] 2)在不同时间 0h、0.5h、lh、2h，分别用 0.5以8/!111、1以8/1111、4以8/1111处理子，放在371€ 恒温箱孵育。即分别取200μ猪精液，加入5μ1、?ομL、40ylTSG。
[0063] 3)各取50μ1的用TSG处理后的精子和空白对照滴于玻片上，用精子质量检测分析 仪检测精子活力。
[0064] 4)同一时间点同一浓度用精子质量分析仪重复测8次。
[0065] 检测结果如表1、图1~2:
[0066]表1孵育2小时精子活力变化
[0068] #示与Oyg/mL的对照相比存在显著差异，p〈0 · 01
[0069] 结果显示，在lh内，是否以TSG处理精液，精子的活力差别不显著（p>0.05)，而2h 后，经TSG处理的精液中精子的活力显著(p〈0.01)高于未经处理的精液中精子活力。
[0070] 实施例2TSG对猪精子成活率的影响
[0071 ]精子处理之后，用invitrgen公司的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L_7011)， 之后用流式细胞仪检测猪精子活率。
[0072] 将精子处理之后，在37°C恒温箱中孵育2h，600g离心8分钟，然后用200μ1的猪精子 稀释液（（seminark)悬浮。
[0073] 各加入0·2μ1 的PI(2.4Mm，propidium iodide)，37°C孵育 10分钟。
[0074] 孵育后用猪精液稀释液(seminark)离心洗涤两次。
[0075] 用流式细胞仪检测精子活率。（死精子被PI染色呈红色，试验每个浓度重复五次， 每个样品至少检测1 〇〇〇〇个精子）
[0076] 检测结果如图3,结果显示在提高精子活力的同时，TSG对精子的活率并不产生影 响。
[0077]实施例3TSG对精子内钙离子水平的检测
[0078] 实验分为实验组和对照组，实验组分为四组，即在精液中加入TSG:0.5ng/ml、lng/ ml、2ng/ml、4ng/ml，对照组不加 TSG。另设置一空白对照，不加 Flu〇-3AM染料。每组实验做5 个重复。
[0079]实验方法为：
[0080] 精子经过处理后，用碧云天F1UO-3AM试剂盒，并且用流式细胞仪检测精子内钙离 子水平。
[0081 ] 1)每组取200μ1的猪精液，加入相对应的不同浓度的TSG处理后，放在37 °C恒温箱 里，孵育2h。
[0082] 2)按照1:1000比例，在精液中加入Flu〇-3AM染料以后，轻轻混匀后，放在37 °C恒温 箱里孵育30min。
[0083] 3)用猪精洗涤液洗涤两次，然后37°C恒温箱，孵育20min。以确保Flu〇-3AM在精子 内全部变成F1UO-3A1UO-3AM的荧光特别弱，其荧光强度不会随着钙离子浓度升高而增强， 当F1UO-3AM染料进入细胞后，细胞内的剪酯酶可以把它剪切成Fluo-3 Aluo-3可以与钙离 子结合，结合钙离子后会产生荧光，每种处理重复五次，每个样品至少检测10000个精子。钙 离子水平可以用钙离子强度来表示。
[0084] 4)用流式细胞仪快速检测TSG对精子钙离子水平的影响。
[0085] 结果如图4-a~图4-e及图5所示，结果显示：相对于未经TSG处理的精液，以TSG处 理精液2h后，精子内Ca2+水平受到显著的抑制(？〈0.01)。且采用不同浓度处理了56的实验组 之间效果并无显著差异(P>〇.05)。
[0086]实施例4TSG对精子内活性氧水平的检测 [0087] 一:实验设计及分组
[0088] 实验分为实验组和阳性对照组，并设置空白对照组。即在实验组设计四个不同浓 度的TSG: 0 · 5μg/ml、lμg/ml、2μg/ml和4μg/ml，每组重复五次；阳性对照组中各加入Ros-up 0.5μg/ml、lμg/ml、2μg/ml和4μg/ml，每个浓度重复一次；空白对照组加入等量的猪精液稀 释液;实验组、阳性对照组和空白对照组均加入DCFH-DA探针，并设置一个不加入DCFH-DA探 针的空白组。
[0089]二：方法
[0090] 1)先处理好精子（用二苯乙烯苷TSG，以不同浓度的TSG处理2h，方法如之前所述）， 37°C 孵育 2h。
[0091] 2)加入DCFH-DA(按照1:1000比例），放在37°C恒温箱里，孵育30min。（每隔3-5min 颠倒轻轻混匀一下，使得荧光探针DCFH-DA与细胞充分地接触）。
[0092] 3)用猪精液稀释液洗涤三次，充分除去未进入细胞内的DCFH-DA)。
[0093] 4)用猪精稀释液充分悬浮细胞后，用流式细胞仪检测仪检测精子的活性氧产生情 况。实验采用活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Assay Kit)，这是一种利用带有焚光的 DCFH-DA探针进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身并没有荧光，它可以自由地穿过细胞 膜，当进入细胞内以后，细胞内的酯酶可以将其水解生成DCFH。酶水解之后形成的DCFH不能 通透细胞膜，这样探针就使得探针很容易装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光 的DCFH生成有荧光的DCF。这样通过检测DCF的荧光就可以知道细胞内的活性氧水平。
[0094] 结果如图6-a~图6-e及图7,相对于未经TSG处理的精液，以TSG处理精液2h后，精 子内R0S水平显著降低(p〈0.01)。且采用不同浓度处理TSG的实验组之间效果并无显著差异 (ρ>0·05)。
[0095]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. TSG在降低精子内Ca2+水平中的应用。 2. TSG在降低精子内ROS水平中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述精子为猪精子。 4. TSG在提高精子活力中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述精子为猪精子。6. -种提高精子活力的制剂，其特征在于，包括TSG。7. 根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，包括TSG和PBS缓冲液。8. -种提高精子活力的方法，其特征在于，使TSG与精液混合。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述精子为猪精子。10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每yg TSG与5yL~40yL精液混合。
【专利摘要】本发明涉及动物医学领域，尤其涉及TSG的用途。本发明提供了TSG通过抑制Ca2+水平和ROS水平来提高精子活力的应用，本发明提供的实验证明，TSG能够提高精子活力而不影响精子的活率。实验表明，浓度为0.5μg/mL～4μg/mL的TSG对精子活力的提高作用十分显著(p<0.01)。
【IPC分类】A61K31/7032, A61P15/08
【公开号】CN105726550
【申请号】CN201610326072
【发明人】李纯锦, 刘亚亭, 周虚, 赵云, 陈璐, 陈树雄, 蒋彦文, 高珊, 巴桑旺堆, 刘卓, 郑雪, 王凤鸽
【申请人】吉林大学
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2016年5月17日